王 帥(綜述)，張霄雁,李哲海(審校)

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院骨科，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

?

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞分化研究進(jìn)展

王 帥△(綜述)，張霄雁※,李哲海(審校)

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院骨科，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用廣泛，BMSCs具有良好的成骨分化潛能，同時(shí)具有多向分化的能力，可向脂肪、骨、軟骨細(xì)胞分化。BMSCs在合適的生長(zhǎng)因子作用下可以快速地向成骨細(xì)胞分化和增殖，并且具有容易取材、容易分離、容易擴(kuò)增、多譜系轉(zhuǎn)化而不發(fā)生明顯免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，在骨組織工程領(lǐng)域擁有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。但是，隨著使用增多，存在的問(wèn)題也日益突出，如生物學(xué)特性、分離鑒定、誘導(dǎo)分化和臨床應(yīng)用進(jìn)展等問(wèn)題還有待進(jìn)一步解決。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；成骨分化；組織工程

骨缺損和骨損傷是臨床常見病，常需植骨治療。對(duì)于這些損傷或疾病引起的骨缺損常依賴于異體和自體骨移植修復(fù)。自體骨移植主要缺點(diǎn)是供應(yīng)有限，而同種異體骨主要缺點(diǎn)在于有致病性以及免疫原性，所以作為骨損傷修復(fù)材料不夠理想。20世紀(jì)80年代組織工程的出現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了根據(jù)骨缺損具體情況任意塑形進(jìn)而達(dá)到完善形態(tài)修復(fù)的要求，為實(shí)現(xiàn)真正意義上的無(wú)損傷修復(fù)創(chuàng)傷開辟了新途徑[1-2]。近年來(lái)，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)因具備多方向分化的潛能而進(jìn)行深入研究[1]。為了明確BMSCs的多向分化潛能，許多試驗(yàn)研究采用加入一系列誘導(dǎo)劑的方法，順利地將BMSCs誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成脂細(xì)胞等獲得了較大進(jìn)展[1,3-6]。它的優(yōu)勢(shì)逐步得到了認(rèn)可，臨床廣泛用于骨損傷修復(fù)中[7]?，F(xiàn)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞分化研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性

存在于骨髓腔中的提供造血干細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的結(jié)締組織骨髓基質(zhì)是由細(xì)胞間基質(zhì)和基質(zhì)細(xì)胞組成。雖然BMSCs取材容易，但是在骨髓中含量很低，僅為骨髓單個(gè)核細(xì)胞的0.000 1%～0.01%，所以還必須經(jīng)過(guò)體外分離純化、大量擴(kuò)增才可以作為組織工程種子細(xì)胞[8]?；谀壳皩?duì)BMSCs的研究及認(rèn)識(shí)，BMSCs主要有以下方面特征表現(xiàn)。①BMSCs的自我復(fù)制、增殖能力：BMSCs 在體外適宜條件培養(yǎng)下的自我復(fù)制、增殖與其他細(xì)胞相同，可以不斷地自我更新，需通過(guò)生長(zhǎng)滯緩期、對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期和生長(zhǎng)平臺(tái)期。②間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原標(biāo)識(shí)：BMSCs的表面標(biāo)識(shí)與造血干細(xì)胞的差別在于，BMSCs 沒有明確的表面抗原，目前已有數(shù)個(gè)抗體可用于鑒定BMSCs，通過(guò)對(duì)分離出的BMSCs進(jìn)行表面抗原鑒定，可判定所得到的細(xì)胞均一性及純度，也可大致判斷其是否來(lái)源于不同于骨髓造血干細(xì)胞的同類細(xì)胞，即BMSCs。③BMSCs的多向分化：實(shí)驗(yàn)證明，BMSCs具備多向分化的能力，不同的微環(huán)境可使BMSCs向不同的組織細(xì)胞分化[4]，可是經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)分化，細(xì)胞是否能在體內(nèi)很好地歸巢到指定部位，是否能有效發(fā)揮其應(yīng)有的生理功能還需更進(jìn)一步研究[6,9]。

2 BMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定和成骨誘導(dǎo)

隨著研究的不斷深入，BMSCs 的體外分離純化、培養(yǎng)擴(kuò)增以及鑒定技術(shù)獲得很大進(jìn)展，然而，目前對(duì)于BMSCs向成骨細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化還沒有形成統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)[10-11]。

2.1 分離BMSCs的方法 用于分離BMSCs的方法是在 Friedenstein方法上改進(jìn)的。目前主要包括4種：貼壁篩選法、密度梯度離心法、免疫磁珠分選培養(yǎng)法及流式細(xì)胞儀分選法。可選用不同的培養(yǎng)基分離BMSCs，比較常用的是Dulbcco′s modified eagle′s medurn(DMEM)培養(yǎng)基。培養(yǎng)所采用的細(xì)胞密度也有所不同，經(jīng)培養(yǎng)的BMSCs可以反復(fù)傳代，并且傳代后細(xì)胞保留了多向分化能力而未發(fā)生自然分化，而且經(jīng)傳代后，BMSCs可達(dá)到較高純度[7]。2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定 關(guān)于BMSCs的鑒定是個(gè)難點(diǎn)問(wèn)題，主要原因是BMSCs的特異性表面標(biāo)志物存在爭(zhēng)議[6]。通常通過(guò)其特有的形態(tài)和可向其他基質(zhì)細(xì)胞系分化的功能來(lái)識(shí)別。國(guó)際間充質(zhì)及組織干細(xì)胞委員會(huì)在2006年就人來(lái)源BMSCs實(shí)驗(yàn)研究的鑒定提出了三條最低標(biāo)準(zhǔn)[8]：①通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)，BMSCs必須具有對(duì)塑料底物黏附特性；②經(jīng)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)后，BMSCs群體陽(yáng)性表達(dá)CD73、CD105、CD90，且陰性表達(dá)CD45、CD34、CD19、CD79a及人白細(xì)胞相關(guān)抗原[6,8,12]；③經(jīng)體外誘導(dǎo)，MSCs必須能向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化[1]。比較公認(rèn)的鑒定標(biāo)識(shí)是BMSCs不表達(dá)淋巴細(xì)胞的表面抗原，如CD11a、CD11b等，且陰性表達(dá)造血細(xì)胞表面抗原如CD14、CD34、CD38、CD45等，但是可表達(dá)一些黏附分子，如CD29、CD44、CD166等，同時(shí)也可表達(dá)少許基質(zhì)細(xì)胞表面抗原及細(xì)胞因子受體[12]。當(dāng)前主要依靠形態(tài)和功能特性鑒定BMSCs[9]。

2.3 BMSCs成骨誘導(dǎo)

2.3.1 BMSCs分化成骨的方法 迄今為止BMSCs向成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)尚未形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[1]。骨組織工程要求其向單一方向分化，所以其定向誘導(dǎo)調(diào)控有著重要意義。在BMSCs向骨、軟骨誘導(dǎo)分化的過(guò)程中，作為信號(hào)物質(zhì)的各種生物誘導(dǎo)因子參與精細(xì)調(diào)節(jié)[13]，已被確認(rèn)的物理因素(超聲波、生物力等)能與生物因子共同增強(qiáng)BMSCs成骨分化作用。現(xiàn)階段誘導(dǎo)BMSCs分化成骨的方法主要包括以下6 種:通過(guò)細(xì)胞因子作用分化[11]、與骨細(xì)胞共同培養(yǎng)分化、借助化學(xué)藥物作用分化、使用中藥提取物作用分化、物理方法分化以及轉(zhuǎn)基因作用分化。作為當(dāng)前骨組織工程種子細(xì)胞，BMSCs是理想的選擇，關(guān)于骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的報(bào)道很多，其結(jié)果為認(rèn)識(shí)誘導(dǎo)分化機(jī)制提供了重要指導(dǎo)價(jià)值。

2.3.2 BMSCs定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的影響因素 BMSCs 定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的影響因素很多，其中主要受生物、化學(xué)、物理等三大因素影響。生物因素包括各種生長(zhǎng)因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子[11]、骨形態(tài)發(fā)生蛋白[11,14]、核心結(jié)合因子1等[8]；化學(xué)因素主要是常規(guī)化學(xué)誘導(dǎo)劑[1]；物理因素如脈沖電磁場(chǎng)等。當(dāng)前BMSCs定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的主要方法是化學(xué)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)法，包括試劑地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C等[6,15]。目前的研究認(rèn)為，糖皮質(zhì)激素對(duì)BMSCs 向成骨細(xì)胞定向分化有促進(jìn)，也有抑制作用，其主要依賴于使用劑量、作用時(shí)間、細(xì)胞種類及細(xì)胞所處階段等[10]。有的觀點(diǎn)[15]認(rèn)為，低劑量的地塞米松可促使BMSCs向成骨細(xì)胞方向定向分化，早期主要以合成細(xì)胞基質(zhì)為主，后期則以鈣化為主，其作用機(jī)制可能在于地塞米松通過(guò)調(diào)節(jié)BMSCs的基因表達(dá)，促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞方向分化，通過(guò)對(duì)成骨樣細(xì)胞的調(diào)控影響胰島素樣生長(zhǎng)因子合成，進(jìn)而影響膠原蛋白的合成，刺激其堿性磷酸酶活性。也有學(xué)者[15]發(fā)現(xiàn)骨形成發(fā)生蛋白2通過(guò)不同媒介方式作用修飾成骨細(xì)胞的骨形成來(lái)增強(qiáng)維生素C、β-甘油磷酸鈉、地塞米松等對(duì)BMSCs的成骨分化誘導(dǎo)能力，有數(shù)據(jù)表明[10]低劑量地塞米松保留了干細(xì)胞的增殖能力、表型以及多向分化能力，進(jìn)而保留BMSCs在反復(fù)擴(kuò)增過(guò)程中的干細(xì)胞源性。高濃度地塞米松不但使BMSCs增殖受到抑制，并且可促使BMSCs向成脂細(xì)胞分化。

3 成骨細(xì)胞鑒定

目前，對(duì)成骨細(xì)胞鑒定主要依賴其形態(tài)學(xué)特性及生物學(xué)特征。成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察主要靠倒置顯微鏡觀察、掃描電鏡觀察及透射電鏡觀察。成骨細(xì)胞生物學(xué)特性主要包括以下內(nèi)容。①堿性磷酸酶：成骨細(xì)胞有合成、分泌堿性磷酸酶的功能，它可直接反映成骨細(xì)胞的活性或功能狀況，成熟成骨細(xì)胞內(nèi),堿性磷酸酶染色陽(yáng)性[2,6,16]。目前常用的染色方法包括Gomori鈣鈷法、偶氮偶聯(lián)法及堿性磷酸酶染色試劑盒法。②膠原蛋白：經(jīng)免疫組織化學(xué)Ⅰ型膠原蛋白染色后，成骨細(xì)胞顯棕色；經(jīng)染色后的Ⅲ型膠原蛋白，成骨細(xì)胞偶而呈現(xiàn)淡棕色，這表明成骨細(xì)胞以合成Ⅰ型膠原為主[16-17]。③基質(zhì)前體染色：成骨細(xì)胞合成的骨基質(zhì)成分，經(jīng)組織化學(xué)糖原染色后，胞質(zhì)中可出現(xiàn)大小不等的紅色團(tuán)塊或顆粒狀物質(zhì)。④成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)：成骨細(xì)胞體外礦化特征，是成骨細(xì)胞具備骨形成功能的表現(xiàn)，通常用Von Kossa法、四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記法及茜素紅法染色顯示成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)[11,16]，四環(huán)素標(biāo)記法染色呈黃色發(fā)光結(jié)節(jié)，經(jīng)Von Kossa法染色礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)黑色。并且，礦化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)可反映成骨細(xì)胞礦化功能[16-17]。⑤增殖率測(cè)定：通過(guò)對(duì)成骨細(xì)胞增殖率測(cè)定，反映細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，已被廣泛應(yīng)用的測(cè)定方法是MTT比色法[1]。⑥分泌蛋白測(cè)定：成骨細(xì)胞具有合成分泌多種蛋白質(zhì)的功能，是典型的分泌蛋白型細(xì)胞，其中胰島素樣生長(zhǎng)因子、骨鈣素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、Ⅰ型膠原與成骨細(xì)胞分化以及骨形成功能密切相關(guān)[17]。⑦堿性磷酸酶比活性檢測(cè)：對(duì)堿性磷酸酶比活性檢測(cè)可反映成骨細(xì)胞的分化程度以及分泌堿性磷酸酶的活性[2]。⑧鈣攝取功能測(cè)定：可通過(guò)放射性核素標(biāo)記 45Ca2+對(duì)成骨細(xì)胞攝取和釋放鈣的功能進(jìn)行測(cè)定[18]。⑨信使RNA測(cè)定：通過(guò)應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)可檢測(cè)成骨細(xì)胞胰島素樣生長(zhǎng)因子、骨鈣素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、成骨生長(zhǎng)肽、Ⅰ型膠原等的信使RNA表達(dá)水平，進(jìn)而反映成骨細(xì)胞的功能狀態(tài)[8,11,17]。

4 結(jié) 語(yǔ)

BMSCs治療骨缺損疾病具有獨(dú)特的優(yōu)越性，使其成為治療骨科疾病合適的種子細(xì)胞，為基因治療和細(xì)胞移植提供理想材料[2]。但關(guān)于BMSCs尚存在一些問(wèn)題需要解決:①大量擴(kuò)增后如何保持 BMSCs 的生物學(xué)特性[19]；②如何得到較純的BMSCs[1,3]；③如何誘導(dǎo)BMSCs向特定組織細(xì)胞分化；④關(guān)于控制BMSCs過(guò)度增殖、選擇適當(dāng)移植時(shí)機(jī)、移植細(xì)胞可否整合到相應(yīng)組織的問(wèn)題上有待于進(jìn)一步研究；⑤各種力學(xué)條件對(duì)BMSCs向特定組織細(xì)胞分化的影響，特別是周圍環(huán)境的力作用的研究;⑥如何促使BMSCs與材料相容生長(zhǎng)并且成骨是當(dāng)前組織工程研究的焦點(diǎn)[5,7,20]。有關(guān)BMSCs誘導(dǎo)分化成骨的研究已有了較大發(fā)展，然而多數(shù)研究還處在動(dòng)物體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)階段，若對(duì)其進(jìn)行充分認(rèn)識(shí)，還需要臨床大量的研究和人體試驗(yàn)。

[1] Hagmann S,Moradi B,Frank S,etal.Different culture media affect growth characteristics,surface marker distribution and chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells[J].BMC Musculoskelet Disord,2013,14:223-233.

[2] Balmayor ER,Flicker M,K?ser T,etal.Human placental alkaline phosphatase as a tracking marker for bone marrow mesenchymal stem cells[J].Biores Open Access,2013,2(5):346-355.

[3] Kim N,Cho SG.Clinical applications of mesenchymal stem cells[J].Korean J Intern Med,2013,28(4):387-402.

[4] Kalinina NI,Sysoeva VY,Rubina KA,etal.Mesenchymal stem cells in tissue growth and repair[J].Acta Naturae,2011,3(4):30-37.

[5] 李承靖，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化成骨的研究進(jìn)展[J].廣西醫(yī)學(xué),2010,3(4)：456-459.

[6] Cortes Y,Ojeda M,Araya D,etal.Isolation and multilineage differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells from abattoir-derived bovine fetuses[J].BMC Vet Res,2013,9(1):133-146.

[7] 戴白云，吳紹華.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞影響因子的研究進(jìn)展[J].瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,33(4)：459-461.

[8] Fakhry M,Hamade E,Badran B,etal.Molecular mechanisms of mesenchymal stem cell differentiation towards osteoblasts[J].World J Stem Cells,2013,5(4):136-148.

[9] 邴愛英，宋文剛.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)和生物學(xué)特性的研究進(jìn)展[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,32(7)：549-552.

[10] 王瑒,吳文,李正,等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化[J].廣東醫(yī)學(xué),2011,32(3)：401-403.

[11] Lin Z,Wang JS,Lin L,etal.Effects of BMP2 and VEGF165 on the osteogenic differentiation of rat bone marrowderived mesenchymal stem cells[J].Exp Ther Med,2014,7(3):625-629.

[12] M?dder UI,Roforth MM,Nicks KM,etal.Characterization of mesenchymal progenitor cells isolated from human bone marrow by negative selection[J].Bone,2012,50(3):804-810.

[13] James AW.Review of signaling pathways governing msc osteogenic and adipogenic differentiation[J].Scientifica (Cairo),2013,2013:1-17.

[14] Kwon SH,Lee TJ,Park J,etal.Modulation of BMP-2 induced chondrogenic versus osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells by cell-specific extracellular matrices[J].Tissue Eng Part A,2013,19(1/2):49-58.

[15] Eslaminejad MB,Fani N,Shahhoseini ME,etal.Pigenetic regulation of osteogenic and chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells in culture[J].Cell J,2013,15(1):1-10.

[16] Matsuoka F,Takeuchi I,Agata H,etal.Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells[J].PLoS One,2013,8(2):1-12.

[17] Sch?ck LM,Noack S,Winkler R,etal.The Phosphate source influences gene expression and quality of mineralization during in vitro osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells[J].PLoS One,2013,8(6):1-10.

[18] 王勇平，廖燚，蔣垚.成骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2011,15(33):6231-6234.

[19] 王長(zhǎng)軍，殷國(guó)勇，李翔，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與成骨細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響[J].江蘇醫(yī)藥,2011,37(11):1244-1247.

[20] 陳廣東，楊惠林，王根林，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化及臨床應(yīng)用[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2010,14(49):9272-9276.

Research Progress on the Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Osteoblasts

WANGShuai,ZHANGXiao-yan,LIZhe-hai.

(DepartmentofOrthopedics,theThirdAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Baotou014010,China)

Basic research and clinical application of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) are extensive.BMSCs have good potential of differentiating into osteoblasts,and multipotential of differentiation ability,that they can differentiate into bone,cartilage,and adipose tissues.BMSCs can rapidly differentiate into osteoblasts and proliferate under suitable induction of growth factors.Moreover,BMSCs is easy to obtain,separate,expand,and transform of multi-spectrum without apparent immune rejection.BMSCs are the most commonly used cell sources for bone tissue engineering.However,as the application of BMSCs expands,problems such as biological characteristics,isolation and identification,induced differentiation,and clinical applicability of BMSCs are increasing and need further investigation.

Bone marrow mesenchymal stem cells; Osteogenic differentiation； Bone tissue engineering

R68

A

1006-2084(2015)12-2137-03

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.009

2014-08-18

2014-11-25 編輯：相丹峰