丁文斌，黃江鴻，徐偉力(綜述)，王大平1，※(審校)

(1.安徽醫(yī)科大學深圳市第二人民醫(yī)院臨床學院，廣東 深圳 518000； 2.深圳市第二人民醫(yī)院組織工程重點實驗室，廣東 深圳 518000)

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骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞誘導分化的研究進展

丁文斌1，2△，黃江鴻2，徐偉力2(綜述)，王大平1，2※(審校)

(1.安徽醫(yī)科大學深圳市第二人民醫(yī)院臨床學院，廣東 深圳 518000； 2.深圳市第二人民醫(yī)院組織工程重點實驗室，廣東 深圳 518000)

骨性關節(jié)炎是一種以關節(jié)軟骨進行性退行性變?yōu)樘卣鞯能浌遣∽儯罱K導致關節(jié)不可逆功能障礙。應用骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導分化成有活性的軟骨細胞，通過復合支架材料移植到軟骨缺損區(qū)，是治療骨性關節(jié)炎的一種微創(chuàng)和有效的治療方式，作為骨組織工程領域研究重點，目前主要研究的方向包括細胞因子、信號間的傳導通路、物理影響因素及支架材料的構建等方面。

骨髓間充質(zhì)干細胞； 細胞因子； 傳導信號； 應力刺激；三維空間結(jié)構

關節(jié)軟骨因其再生能力差，長期機械或其他原因?qū)е萝浌菗p傷后，將導致骨關節(jié)不可逆退行性變。主要治療方法包括[1]人自體軟骨細胞移植技術(autologous chondrocyte transplatation，ACT)和手術治療，ACT指將軟骨細胞移植到損傷的膝關節(jié)創(chuàng)面，治療骨性關節(jié)炎，但是因為ACT技術因供區(qū)的損傷并發(fā)癥，體外軟骨細胞去分化擴增后易纖維化，以及重建的整合關節(jié)面不良使其受到了限制；手術主要適用于終末期的關節(jié)功能明顯受限患者。而通過體外培養(yǎng)誘導骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow messenchymal stem cells，BMSCs)向軟骨細胞誘導分化，并結(jié)合骨組織工程技術為軟骨修復提供新的方向?，F(xiàn)對BMSCs向軟內(nèi)細胞誘導分化的研究進展進行綜述。

1 BMSCs在組織工程中的選擇及應用

軟骨分化早期，未分化的BMSCs細胞系表型向軟骨細胞轉(zhuǎn)化增殖，并分泌大量的細胞外基質(zhì)，包括水、膠原、蛋白多糖及非膠原蛋白等,在一定的條件下，受各種細胞因子及信號調(diào)控，繼續(xù)向肥大軟骨細胞分化最終以骨組織取代。軟骨組織工程很大程度上取決于種子細胞的選擇，目前主要包括以下幾個來源[2]。①軟骨細胞：生物學性能、韌性均欠佳、耐磨性、易退變。②胚胎源性細胞：動物實驗中認為其移植后存在形成畸胎瘤的風險，此外，移植后的胚胎源細胞仍有一定的免疫排斥反應。③間充質(zhì)干細胞：在適當?shù)臈l件下，通過細胞因子及其他信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)控，可向軟骨細胞分化，并且可以分泌特異性基質(zhì)。④羊膜細胞：少表達組織Ⅱ相容性抗原，免疫排斥反應概率很低[3]。

2 BMSCs的特性及鑒定

BMSCs是因其高度自我更新及多向分化潛能，在一定誘導條件下，分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞等，BMSCs無特異性細胞表面標志物，對其鑒定依賴其形態(tài)、功能、細胞分化表型。國際細胞治療學會制訂人BMSCs最低鑒定標準[4]：①具有貼壁性，能長期傳代，擴增培養(yǎng)；②細胞分化表型均一，表達CD105、CD90、CD73,不表達人類白細胞抗原DR、CD45(白細胞共同抗原)、CD34、CD14(血細胞表面抗原)等；③脂肪、成骨和軟骨細胞三系分化的潛能。

3 細胞因子及相關信號轉(zhuǎn)導通路

BMSCs向軟骨細胞的誘導分化基質(zhì)尚不清楚，體外培養(yǎng)BMSCs需要一定條件的誘導才能向軟骨細胞分化，包括多種細胞因子、分化因子、多種信號轉(zhuǎn)導通路及一定條件的物理因素參與，如轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)，成纖維生長因子(fibroblast growth factor,FGF)，胰島素樣生長因子，骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (bone morphogenetic proteins,BMP)，另外，促細胞分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)可以刺激軟骨形成轉(zhuǎn)錄因子(SRY-related HMC-box gene nine,Sox9)的活化，維持軟骨細胞形成表型和功能[5]。

3.1 TGF-β超家族 TGF-β是一組多肽類生長因子家族，TGF-β參與BMSCs定向分化為軟骨細胞，通過定量統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原的表達與TGF-β劑量有一定正相關聯(lián)系。誘導因子重組人TGF-β1激活Smads蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein，Smads)信號轉(zhuǎn)導通路，增加Ⅱ型膠原的表達與合成[6]。Park等[7]認為，TGF-β1通過Wnt信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié) BMSCs增殖分化過程，其中，TGF-β1依賴介導Smads蛋白上調(diào)β聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控下游靶基因轉(zhuǎn)錄在某一特定的水平，刺激MSC向軟骨細胞分化，抑制脂肪和成骨形成,并認為10 μg/L水平的TGF-β1可能是誘導BMSCs的最佳誘導濃度。夏萬堯等[8]實驗研究重組人TGF-β1腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs，使用腺病毒重組人TGF-β1基因，轉(zhuǎn)染BMSCs，分離培養(yǎng)后，通過分析研究重組人TGF-β1基因的表達、生物活性的測定、BMSCs生長曲線及增殖率，認為BMSCs表達一定生物學活性的重組人TGF-β1蛋白，但是分析BMSCs的生長曲線時卻發(fā)現(xiàn)，重組人TGF-β1蛋白使BMSCs的增殖率受到抑制。

BMP系TGF-β超家族之一，研究較多的有BMP-2、BMP-6、BMP-7，其中BMP-2對BMSC具有促進向成骨細胞誘導分化作用，BMP-7則更趨向于使BMSCs向軟骨細胞誘導分化，Knippenberg等[9]對脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，AT-MSCs)進行15 min的BMP-2及BMP-7處理，觀察第4日及第14日的基因表達，發(fā)現(xiàn)在第4日BMP-2刺激表達Runx相關基因2(runx-related transcription 2,Runx2)、骨橋蛋白以及二聚糖基因，而BMP-7組在第14日這些基因下調(diào)，表明BMP-2可以誘導AT-MSCs成骨細胞分化，而BMP-7則刺激其向軟骨細胞分化，為骨組織工程提供一個有力的證據(jù)。林在俊等[10]也認為BMP-2在BMSC 成骨細胞起重要作用，通過納米羥基磷灰石復合重組人BMP-2/殼聚糖轉(zhuǎn)染的BMSCs，對試驗組進行骨密度檢測、生物力學評分、組織學及骨形態(tài)計量分析，差異均有統(tǒng)計學意義。 Xiao等[11]通過實驗動物構建股骨頭壞死模型，以BMSCs為種子細胞，BMP-2處理實驗組，三維支架材料修復填充骨缺損創(chuàng)面，并對其進行4、8、12周的骨密度測定及X線檢查，實驗組在鈣鹽、骨密度測定及標本組織學檢查中相比對照組均有一定的統(tǒng)計學意義。BMP-2及BMP-6與TGF-β也有協(xié)同作用，張清林等[12]運用TGF-β1、BMP-2共同培養(yǎng)誘導BMSCs細胞誘導分化，細胞形態(tài)向軟骨細胞轉(zhuǎn)變，黏多糖及Ⅱ型膠原表達均高于BMP-2單獨誘導組。

3.2 堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF) 目前關于bFGF在BMSCs的研究越來越深，bFGF主要存在于細胞和細胞外中，對Ⅰ、Ⅱ型膠原及信使RNA的表達均有促進作用。王新武等[13]研究人bFGF重組慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs，通過觀察實驗組(bFGF-綠色熒光蛋白-BMSCs)的bFGF及bFGF信使RNA的表達均高于對照組(綠色熒光蛋白-BMSC)，但是對于bFGF通過什么樣的細胞通路及信號轉(zhuǎn)導的反正來調(diào)節(jié)BMSCs的表達尚無明確認定，大多研究偏向與細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)/MAPK有關，MAPK家族為介導真核細胞接受生長因子作用，引起下游細胞因子級聯(lián)反應的酶蛋白通路。買霞等[14]以不同濃度的bFGF作用BMSCs，觀察細胞的形態(tài)，免疫組織化學及聚合酶鏈反應檢測Ⅰ型膠原及信使RNA，Wentern blot和免疫組織化學檢測磷酸化調(diào)節(jié)激酶及其信使RNA表達，發(fā)現(xiàn)bFGF促進Ⅰ型膠原信使RNA的表達，且隨著培養(yǎng)時間的延長至第14日，磷酸化調(diào)節(jié)激酶的表達均高于同期對照組。Xiao等[15]研究FGF家族發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF2抑制BMSCs 向成骨細胞誘導分化及其礦化主要通過FGF23/FGF受體/MAPK途徑，bFGF對于BMSCs的介導，調(diào)控期生長、增殖、分化都具有重要的作用。

FGF2抑制BMSCs向成骨細胞誘導分化及其礦化主要通過FGF23/FGFR/MAPK。bFGF對于BMSCs的介導，調(diào)控期生長、增殖、分化都具有重要的作用。除此之外，bFGF也參與BMSCs的遷移，Schmidt等[16]對比了bFGF、促紅細胞生成素、基質(zhì)細胞衍生因子1對BMSCs 的遷移作用，發(fā)現(xiàn)bFGF與BMSCs的遷移存在效應-濃度關系，高濃度抑制其遷移，反之則促進，與bFGF能在骨損傷的部位促進MSC的增殖、促進毛細血管滋生、加快骨缺損修復的研究相符。

3.3 BMP與MAPKs通路關系 根據(jù)信號通路中執(zhí)行功能的激酶亞類不同，MAPK包括ERK1/2、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38、ERK5四條信號轉(zhuǎn)導通路，骨形態(tài)發(fā)生蛋白是由經(jīng)典的骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體的信號通路，激活下游靶基因傳遞信號，以產(chǎn)生骨誘導和其他的生物功能活性。但是，目前也有相關的研究表明，TGF-β/BMP可通過其他信號轉(zhuǎn)導通路，如MAPK、磷脂酰肌醇3-激酶等通路(BMP的非經(jīng)典通路)，此類信號通路的上游激活啟動點為非直接依賴轉(zhuǎn)錄因子Smads蛋白的激活。BMP2、BMP4等可通過MAPK參與信號傳遞，在促進BMP誘導成骨細胞功能方面極為重要。趙迎澤[17]研究表明， BMP9能誘導間充質(zhì)干細胞的成骨分化，BMP9提高p38MAPK、ERK1/2和JNK的磷酸化水平，從而激活MAPK信號轉(zhuǎn)導通路，通過使用p38MAPK特異性抑制劑、沉默p38MAPK mRNA的表達可抑制BMP9誘導的間充質(zhì)干細胞的體外及體內(nèi)成骨分化，而使用ERK1/2的特異性抑制劑、沉默ERK1/2 信使RNA的表達可增加BMP9誘導的間充質(zhì)干細胞的體外及體內(nèi)成骨分化，間接說明在軟骨及成骨過程中，BMP-MAPK發(fā)揮重要的信號轉(zhuǎn)導作用。

3.4 Sox9基因是軟骨形成過程中的主要調(diào)控基因

3.4.1 Sox9與Ⅱ型膠原α1的表達 Sox9系參與胚胎早期發(fā)育的重要基因，參與決定胚胎性別過程，Sox9在軟骨形成過程中，通過直接或間接作用，與其他細胞因子形成一個復查的信號通路環(huán)，目前，確切的研究通路尚不清楚。參與軟骨細胞的增殖與分化。軟骨細胞Ⅱ型膠原的表達需要靠Ⅱ型膠原α1(collagen typeⅡalpha 1，COL2α1)基因的表達，St?ckl等[18]研究認為在軟骨細胞表達過程中，Sox9蛋白的表達與COL2α1表達呈平行關系，認定COL2α1基因的表達依賴于Sox9。Sox9需要與L-Sox5、Sox6共同形成蛋白復合體后，協(xié)同作用COL2α1增強子序列，發(fā)揮增加其轉(zhuǎn)錄表達的作用，促進Ⅱ型膠原的表達。Kupcsik 等[19]通過腺病毒感染人間充質(zhì)干細胞，實驗組中Sox9上調(diào)靶基因表達，Ⅱ型膠原的表達水平增加，協(xié)調(diào)因子Sox5和Sox6的表達也增加。

3.4.2 Sox9與甲狀旁腺激素相關肽(parathyroid hormone-related protein, PTHrP)/印度豪豬蛋白(indian hedgehog,Ihh)負反饋信號通路 PTHrP與Ihh形成負反饋環(huán)，參與軟骨細胞的增殖、分化、肥大和礦化的過程，通過與Ihh信號分子形成旁分泌的負反饋通路環(huán)來調(diào)節(jié)，對骨骺增殖帶的軟骨細胞的分化起到成熟抑制作用[20]。Ihh主要在胚胎發(fā)育中起重要作用，骺板的前肥大細胞及肥大軟骨細胞合成表達Ihh，抑制軟骨細胞的成熟，促進軟骨細胞向肥大軟骨細胞的轉(zhuǎn)變。Kim等[21]通過PTHrP誘導BMSCs及AT-MSC，測定Sox9 信使RNA及COL2α1的表達，發(fā)現(xiàn)實驗組中這兩種表達均明顯升高，且與PTHrP的濃度存在一定的依賴性。Sox5、Sox6、Sox9形成的復合體，可以結(jié)合PTHrP的啟動子，激活上調(diào)啟動子的活性，在軟骨細胞分化的早期，對其增殖發(fā)育起到促進的作用，抑制其成熟和礦化[22]。

3.5 Wnt信號通路對軟骨細胞影響 Wnt是一種分泌型糖蛋白，包括19個家族成員，通過自分泌或旁分泌的方式，參與生長發(fā)育及腫瘤的發(fā)生。Wnt信號可正向或者負向調(diào)節(jié)軟骨細胞，對軟骨細胞的分化具有雙重作用，關于Wnt信號與其他細胞信號的相關調(diào)節(jié)作用也在研究階段，Wnt信號通路分為3種[23]：①經(jīng)典的Wnt/β聯(lián)蛋白信號，Wnt-1、Wnt-3a、Wnt-4、Wnt-7a和Wnt-7b參與激活下游β聯(lián)蛋白而發(fā)揮作用；②非經(jīng)典的Wnt信號通路，主要調(diào)控細胞內(nèi)的Ca2+和細胞級性；③Wnt/PCP (planar cell polarity)途徑，通過激活下游的Dsh散亂蛋白，進而激活下游JNK，進行細胞骨架重排和細胞極性的調(diào)整。不同時期的軟骨形成，Wnt的不同亞型參與的作用不同。Germann等[24]研究發(fā)現(xiàn)，Wnt-5a信號參與維持軟骨細胞的增殖和分化，過表達的Wnt-4也可促進軟骨細胞末期分化，Wnt-3a可以直接調(diào)控β聯(lián)蛋白下游基因，直接抑制軟骨細胞的形成，低表達的Wnt-14在軟骨細胞向成骨細胞誘導分化有正相關作用，而高水平的Wnt-14誘導BMSCs分化。Wnt/β聯(lián)蛋白信號的活化，可減少細胞外機制(氨基葡聚糖)的合成，抑制重組人BMSCs向脂肪及成纖維細胞的分化。

Wnt/β聯(lián)蛋白信號通路與多個信號因子相關聯(lián)，參與軟骨細胞的誘導分化。Wnt-3a受白細胞介素1的誘導表達，激活下游轉(zhuǎn)錄激活因子進一步抑制Sox9。Gao等[25]把Sox9基因重組腺病體內(nèi)，轉(zhuǎn)染軟骨細胞后，認為Wnt通路關鍵信號β聯(lián)蛋白發(fā)生復合磷酸化，抑制軟骨細胞的發(fā)育。也間接說明Sox9基因是Wnts的下游靶基因。BMP受到β聯(lián)蛋白信號的調(diào)節(jié)，β聯(lián)蛋白的激活會抑制BMP-2，抑制軟骨細胞的修復。同樣，Wnts信號也受上游信號的調(diào)控，TGF-β對Wnts蛋白的表達有抑制作用，Guerrero等[26]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β誘導激活核轉(zhuǎn)位因子Smad1/5/8，避免下游Wnt/β聯(lián)蛋白/BMP激活?？傊壳皩τ赪nts信號的研究還處于單節(jié)點研究，對于多個信號因子的作用已經(jīng)有了大體上的認識，但其進一步的復雜機制還需進一步研究。

4 物理因素

4.1 低氧誘導因子 低氧誘導因子1α在軟骨細胞成熟早期，可促進軟骨細胞在低氧條件下濃縮，另外，缺氧條件時，低氧誘導因子 1α降解速度減慢，參與調(diào)節(jié)Sox9基因的表達，保持Sox9 信使RNA水平，直接條件Ⅱ型膠原蛋白的表達[27]。

4.2 應力刺激 種子細胞與生物支架材料復合后受到應力刺激，在微觀過程中可影響細胞分子信號，力學信號可以改變胞內(nèi)NO信號或Ca2+濃度、白細胞介素1、白細胞介素6以及TGF-β等信使RNA的表達。張路等[28]采用兔肱骨干缺損模型，研究BMSCs修復骨缺損的實驗中，沿肱骨干長軸方向施加0.3 g的加速度，頻率為25 Hz的持續(xù)30 d振動刺激，發(fā)現(xiàn)實驗組的Ⅰ型膠原蛋白和Runx2信使RNA的免疫組織化學表達水平提高，一定程度的應力刺激和誘導BMSCs的成骨誘導分化。Saeed和Iqtedar[29]證實支架復合材料在修復軟骨細胞損傷疾病中需要一定的力學刺激，但是關于體外應力的具體實施大小、刺激的時間以及方式尚未做進一步詳細的研究和確切的說明。

4.3 支架材料 支架材料要求有[30]：生物相容性良好；力學性能穩(wěn)定；使移植的細胞保留有一定的生物活性及細胞功能；免疫排斥反應?。痪哂幸欢ǖ娜S可塑性；在細胞增殖分化過程中，三維支架材料的孔隙率也有一定的要求，一般200～400 μm。目前應用的三維支架材料培養(yǎng)BMSCs主要包括天然材料和人工復合材料。人工復合材料如高分子聚乙烯材料，其孔徑>100 μm，具有可吸附性、無毒性、可降解性，使其成為良好的BMSCs載體。聚乳酸應用較廣泛，但因為其親水性不足、降解過程中易引起局部無菌性炎癥反應等缺點，很多學者進行聚乳酸親水性的改性研究，設計出多種混合型材料，如明膠海綿與聚乳酸混合支架材料，聚乳酸和透明質(zhì)酸混合材料等[31]。

5 展 望

目前BMSCs移植在軟骨組織修復工程中已經(jīng)是一個重要的領域，其向軟骨細胞誘導分化涉及多個信號轉(zhuǎn)導通路及細胞因子，包括MAPKs-BMP通路，Wnt/β聯(lián)蛋白通路等。Sox9為BMSCs向軟骨細胞分化過程中的啟動基因，參與Wnt信號通路，并通過PTHrP/Ihh形成負反饋環(huán)來調(diào)控BMSCs的增殖分化，TGF-β與Wnt信號通路關系密切；BMP具有重要的促軟骨形成作用，與軟骨細胞Ⅱ型膠原蛋白的表達呈平行關系；bFGF通過MAPK通路參與MSC的增殖分化，且很多研究均表明這些因素在軟骨細胞分化過程中是確實存在重要作用的，但其機制仍需進一步研究。可以說細胞因子與信號轉(zhuǎn)導通路不是單一、單向的，而是多通路、多空間、多時間的綜合形成的一個整體，更涉及到骨組織工程，種子細胞的培養(yǎng)、支架材料的復合、外周物理因子，相信隨著骨組織工程的研究和發(fā)展，通過對細胞因子和信號通路的進一步研究，和對復合材料、改良天然材料、納米材料及其他新型材料的探索，將會有更理想方法應用于骨性關節(jié)炎治療中。

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Research Progress of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Differentiation into Cartilage Cells

DINGWen-bin1,2,HUANGJiang-hong2,XUWei-li2,WANGDa-ping1,2.

(1.ShenzhenSecondPeople′sHospitalAffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity,Shenzhen518000,China； 2.TheKeyLaboratoryofTissueEngineeringofShenzhenSecondPeople′sHospital,Shenzhen518000,China)

Osteoarthritis is a kind of a cartilage diseased featured with progressive joint articular cartilage degeneration, involving not only the joint lining but also cartilage, ligaments, and bone, eventually leading to irreversible dysfunction.Applying the bone marrow mesenchymal stem cells to induce active cartilage cells in vitro,and transplanting the harvest to the cartilage defect area with composite scaffold material is a minimally-invasive and effective treatment of osteoarthritis.As a key point in cartilage tissue engineering,the main directions include cytokines,signal pathways,physical factors and scaffold materials etc.

Bone marrow messenchymal stem cells; Cytokine; Signals; Stress stimulation; Three-dimensional structure

深圳市科技研發(fā)資金 (JSGG2014051905550503;CXZZ20120614160234842；GJHZ20130412153906739;ZDSY20120614154551201；JCYJ20130401115547212; JCYJ20140414170821160)

R684.3

A

1006-2084(2015)12-2148-04

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.013

2014-07-21

2014-11-07 編輯：相丹峰