胡文元 李琦華豆騰飛 榮 華葛長榮 賈俊靜劉麗仙，2* （云南農業(yè)大學，昆明65020；2云 南 農業(yè)職業(yè)技術學院，昆明 65003)

沙門氏菌感染引起的畜禽疾病給當代養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的危害，使得沙門氏菌病成為焦點而被持續(xù)爭論和關注。由于該病呈垂直和水平兩種方式傳播，且隱性感染家禽不能被及時發(fā)現(xiàn)，使得控制和解決沙門氏菌污染成為世界性的難題。

目前控制該病多利用凈化手段和飼喂抗生素的方法，然而由于抗生素的大量使用使得耐藥菌株不斷出現(xiàn)且造成了抗生素殘留問題。由于沙門氏菌感染與機體狀況有關，所以，在抵抗沙門氏菌感染過程中機體自身固有的免疫系統(tǒng)起到了決定性的作用。因此，尋找與免疫相關的候選基因至關重要。研究發(fā)現(xiàn)TLR4基因可作為抗沙門氏菌感染的候選基因。TLR4作為內毒素脂多糖(LPS)最重要的模式識別受體，不僅是連接獲得性免疫和先天性免疫的橋梁，在抗感染過程中調節(jié)獲得性免疫，發(fā)揮著天然免疫的作用，還在介導革蘭氏陰性菌及其LPS的宿主反應中發(fā)揮著重要作用[1]。

1 TLR4基因的結構分布

HashimotoC等在研究果蠅胚胎發(fā)育中發(fā)現(xiàn)了Toll樣受體[2]。自1997年以后，與Toll類似的一組蛋白被研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，稱為Toll樣受體，TLR4是TLRs家族的重要成員之一，首先由Medzhitov等[3]發(fā)現(xiàn)。到目前為止至少有13種TLRs被發(fā)現(xiàn)，在雞上已發(fā)現(xiàn)11種。作為機體的第一道防線，它們在機體各組織中廣泛分布，并能特異性識別大量病原體及組織代謝產物，為機體抵抗外源病菌入侵提供可靠保障。

在家禽及其抗沙門氏菌感染與免疫的研究上，對于TLR4的研究還處于初級階段。Leveque等[4]通過比較基因組學方法，首次克隆了雞的TLR4基因。該基因定位于雞17號染色體上，編碼843個氨基酸，序列全長4452bp，共有3個外顯子，2個內含子。由于第三外顯子較長，為2260bp，因此雞TLR4基因的SNP主要集中在第三外顯子區(qū)域。雞TLR4的兩個內含子區(qū)域分別為934bp和984bp。2個內含子區(qū)域也含有較為豐富的SNP，這些SNP與外顯子的SNP為研究SNP與雞抗革蘭氏陰性菌的關系提供了豐富的遺傳材料。

2 雞TLR4基因的研究進展

2.1 沙門氏菌感染對TLR4基因表達的影響

目前研究表明，家禽的腸道和脾臟在抵抗沙門氏菌感染的局部免疫反應中起著至關重要的作用。Abasht等[5]對雞感染沙門氏菌后機體內各組織器官TLRs的mRNA的表達情況進行研究，發(fā)現(xiàn)不同品系的雞群中，F(xiàn)ayouni雞與來航雞相比，TLR4在盲腸和脾臟中的表達量差異顯著。感染組與對照組相比，雛雞腸炎沙門氏菌感染后，TLR4基因的表達水平在盲腸和脾臟中明顯上調，并通過分析發(fā)現(xiàn)在盲腸中TLR4的表達量與盲腸的沙門氏菌載菌量呈極顯著相關[6]。李鵬等[7]研究表明，感染沙門氏菌組TLR4基因的表達量顯著高于對照組，并在感染后的第3和第7天mRNA的表達量達到了極顯著水平。Sadeyen等[8]通過對雞沙門氏菌易感和抗性品系進行TLR4基因mRNA表達水平的試驗，試驗結果表明，在沙門氏菌感染7天后，TLR4基因在抗性品系雞的組織器官中的表達水平極顯著高于易感品系雞，同時還發(fā)現(xiàn)，一氧化氮合成酶基因的表達量在抗病品系雞中也極顯著高于易感品系，說明了TLR4基因的表達量與機體免疫相關基因存在著不同程度的相關性，同時也表明了在發(fā)揮調節(jié)作用的細胞因子幫助下，TLR4基因可能為宿主提供沙門氏菌感染的危險信號。所以沙門氏菌感染與TLR4基因的表達水平存在著緊密的相關性。

2.2 沙門氏菌感染與TLR4基因多態(tài)性的關系

目前對于沙門氏菌感染與雞TLR4基因的多態(tài)性的關系[9]的研究進展比較緩慢。研究表明，雞TLR4基因第三外顯子上有2個突變位點，可造成編碼TLR4蛋白的氨基酸發(fā)生改變，進而引起機體對沙門氏菌感染產生不同反應[10，11]。宋詠梅等[12]利用基因組直接測序法對引進品種雞和地方品種雞進行TLR4基因的部分序列單核苷酸多態(tài)性檢測，SNP檢測發(fā)現(xiàn)，共檢測到36個多態(tài)性位點，并發(fā)現(xiàn)TLR4基因編碼序列的突變位點與機體對于病原菌的抗性具有重要作用。還有研究表明，雞TLR4基因上的突變可能與機體沙門氏菌載菌量相關。Beaumont等[13]研究報道雞TLR4與沙門氏菌易感性相關，試驗以產蛋母雞為研究素材，在TRL4序列中共發(fā)現(xiàn)3個SNPs，這些突變位點與某些組織器官的沙門氏菌載菌量有一定的相關性，尤其是在盲腸和卵巢中顯著相關。Malek等[14]對雞的遺傳資源群體進行了TLR4基因內含子區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性檢測，結果發(fā)現(xiàn)在TLR4基因內含子區(qū)域發(fā)現(xiàn)1個G156C的SNP突變位點。進一步做關聯(lián)分析表明，該SNP與脾臟載菌量呈中度相關，并且還發(fā)現(xiàn)TLR4基因與雞抗沙門氏菌感染存在一定相關。Leveque等[4]以沙門氏菌抗感和易感品系作比較，通過序列遺傳變異分析發(fā)現(xiàn)，在TLR4基因第三外顯子編碼區(qū)域共發(fā)現(xiàn)TLR4基因的14個突變位點。經預測分析表明，在保守區(qū)域有5個位點發(fā)生突變進而導致氨基酸的改變；在非保守區(qū)域的2個突變位點導致了氨基酸發(fā)生改變，而且這2個突變位點引起氨基酸改變僅存在于易感品系的商品代雞的基因組信息中。因此，Leveque等表明，TLR4基因有可能為宿主抗沙門氏菌感染相關的候選免疫基因。劉艷等[15]以紅色原雞與14個地方品種雞為試驗對象，通過PCR-SSCP技術對TLR4基因第二外顯子的多態(tài)性進行檢測，結果基因分型發(fā)現(xiàn)在第二外顯子區(qū)域有3種基因型AA、AB和BB，分析認為BB基因型可能是機體免疫應答的有利基因型，對于抗沙門氏菌感染具有一定的免疫應答作用。陶志云等[16]對我國4個地方雞種的TLR4基因第2內含子區(qū)域進行多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，在1 894bp處有1個為G-C替換的SNP位點，這一SNP導致種間基因型差異顯著，并推測出品種間對特定病原菌及其所引發(fā)的免疫反應類型具有較大差異。因此研究表明，TLR4基因很有可能為宿主抗沙門氏菌感染相關的候選免疫基因。

3 展望

采用免疫遺傳學原理篩選與沙門氏菌感染有關的抗病基因可為選育抗病新品種提供可靠依據。因此，探索TLR4基因的作用機制為尋找預防和治療沙門氏菌感染提供了新的思路和方法，為畜禽的分子標記輔助選育、抗病品種選育和疾病防治等方面的研究提供理論依據。

[1]溫樂.LPS和沙門氏菌刺激時雞腦內TLR4的表達規(guī)律研究［D］.武漢：華中農業(yè)大學,2014.

[2]Hashimoto C，Hudson K L，Anderson K V.The Toll gene of Drosophila，required for dorsal ventral embryonic polarity，appears to encode a transmembrane protein[J].Cell，1988，52(2):269-279.

[3]Medzhitov R，Preston-Hurburt P，Janeway CA.A human homologue of the Drosophila Tollprotein signals activation of adaptor immunity[J].Nature，1997，388：394-7.

[4]Leveque G，F(xiàn)orgetta V，Morroll S，et al.Allelic variation in TLR4 is linked to susceptibility to Salmonella enterica serovar Typhimurium infectionin chickens[J].Infect Immun，2003，71(3)：1116-24.

[5]Abasht B，Kaiser M.G，Van der Poel J，Lamont S.J.Genetic lines differ in Toll-like receptor gene expression in spleens of chicks inpculated with Salmonella enterica serovar Enteritidis[J].Poultry Sci,2009,88(4):744-749.

[6]AbashtB.KaiserM.G.LamontS.J.Toll-like receptor gene expression in cecum,spleen of advanced intercross line chicks infected with Salmonella enterica serovar Enteritidis[J].Veterinary Immunology,Immunopathology,2008,123(3-4):314-323.

[7]李鵬，夏平安，宋詠梅，等.雞TLR4基因表達水平與沙門氏菌感染關系的研究[J].中國畜牧獸醫(yī),2009,36(5):72-4.

[8]Sadeyen JR，Trotereau J，Protais J，et al.Salmonella carrierstate in hens:study ofhost resistance by a gene expression approach.Microb Inf，2006，8：1308-14.

[9]孫鈺.TLR4基因的變異分析及TLRs基因與雞沙門氏菌感染的相關性研究.［D］.山東：山東農業(yè)大學,2013.

[10]趙興旺.雞TLR4不同突變基因型對抗腸炎沙門氏菌感染的差異［D］.北京：北京畜牧獸醫(yī)研究所,2011.

[11]宋詠梅.雞TLR4信號通路與腸炎沙門氏菌感染關系的研究［D］.北京：中國農業(yè)科學院，2010.

[12]宋詠梅，龐建建，趙桂蘋，等.TLR4基因SNP檢測及在中外雞種中的群體變異分析［J］.中國農學通報，2010，26（16）：1-7.

[13]Beaumont C，Protais J，Pitel F，et al.Effect of two candidate genes on the Salmonella carrier state in fowl[J].Poultry Science，2003，82(5)：721.

[14]Malek M，Hasenstein J R，Lamont S J.Analysis of chicken TLR4，CD28，MIF，MD-2，and LITAFgenes in a Salmonella enteritidis resource population[J].Poultry Science，2004，83(4)：544-549.

[15]劉艷，包文斌，常國斌，等.14個雞品種和紅原雞TLR4基因外顯子2多態(tài)性分析[C].中國動物遺傳育種研究進展——第十五次全國動物遺傳育種學術討論會論文集，2009，40.

[16]陶志云，徐文娟，宋衛(wèi)濤，等.4個品種雞Toll樣受體4基因第2內含子的多態(tài)性分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（1）：145-148.