李 冰，胡賢榮，萬(wàn) 偉，薄志遠(yuǎn)，吳葉晨，鄭 曉，胡 冰

(1.蘇州大學(xué)研究生院，江蘇蘇州 215123;2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院內(nèi)鏡科，上海 200438)

膽管癌是起源于膽道上皮細(xì)胞的惡性腫瘤［1］，生長(zhǎng)部位比較特殊，起病隱匿，當(dāng)出現(xiàn)明顯臨床癥狀時(shí)，腫瘤往往已經(jīng)進(jìn)展為中晚期，絕大部分患者失去根治性手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，預(yù)后極差，死亡率高，癌患者的5年生存率平均是5%～10%［2］。更有研究顯示膽管癌對(duì)化療、放療極不敏感［3］，較多臨床研究認(rèn)為膽管癌根治性手術(shù)后患者的5年生存也僅有20% ～40%［4］。膽管癌的這些臨床特點(diǎn)及治療現(xiàn)狀，使其急需一種新的治療方法，近年來(lái)隨著醫(yī)療技術(shù)發(fā)展，光動(dòng)力等微創(chuàng)療法的興起，成為膽管癌治療的研究熱點(diǎn)，而且也取得明顯的成效。

光動(dòng)力學(xué)療法(photodynamic therapy，PDT)是繼手術(shù)、放療和化療之后興起的治療腫瘤的新手段，利用腫瘤組織及細(xì)胞對(duì)光敏劑(photosensilizter，PS)選擇性吸收，然后在特定波長(zhǎng)光照下激發(fā)光敏劑，發(fā)生光動(dòng)力化學(xué)反應(yīng)，生成活性氧(reactive oxygen species，ROS)為主的殺傷腫瘤細(xì)胞活性物質(zhì)，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。PDT于20世紀(jì)70年代用于人類腫瘤的治療，于80年代引入我國(guó)，因其對(duì)靶組織及損傷程度具有可選擇性，正常組織的損傷微小，有明確的臨床效果，而受到人們的關(guān)注，近年來(lái)得以迅速興起，并廣泛應(yīng)用于各類腫瘤的研究和治療。

葉綠光I號(hào)(YLG I)是桂林暉昂生化藥業(yè)有限責(zé)任公司提供的一種新型光敏劑。化學(xué)名為2-1-己氧乙基-2-去乙烯基卟吩e6三鈉鹽(HCE6)，屬于葉綠素類二代光敏劑，分子式為C40H47N4O7Na3，分子量為764.79，最大激發(fā)波長(zhǎng)652 nm，難溶于有機(jī)溶劑，易溶于水。分子結(jié)構(gòu)如圖1。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 PDT-652 nm AB型光動(dòng)力激光治療儀由桂林興達(dá)有限責(zé)任公司提供，葉綠光I號(hào)(YLG I)由桂林暉昂生化藥業(yè)有限責(zé)任公司提供。QBC939系人膽管癌細(xì)胞購(gòu)自上海和元生物技術(shù)有限公司。BALB/c裸鼠10只，雌雄各半，四周齡，16～18 g，由第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供并飼養(yǎng)，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2013-0016。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清，上海和元生物技術(shù)有限公司提供。細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒CCK8(批號(hào)20140818，Ruian biotech)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) QBC939人膽管癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于恒溫37℃、5%CO2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中。每24 h更換一次培養(yǎng)液，2 d傳代一次。HCE6光敏劑，在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液稀釋成實(shí)驗(yàn)濃度。

1.2.2 光毒性與暗度性實(shí)驗(yàn) CCK8檢測(cè)光毒性以及暗毒性條件下HCE6光敏劑對(duì)QBC939人膽管癌細(xì)胞增殖活性的影響。取4個(gè)96孔板，每個(gè)96孔板以豎排為一組，每個(gè)板分6組，每組5個(gè)樣本，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期膽管癌細(xì)胞，將QBC939細(xì)胞接種于96孔板中，每孔5 000個(gè)，用含牛胎血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每孔100μL培養(yǎng)基，當(dāng)膽管癌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后換相應(yīng)含濃度光敏劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)。每板6 組分別換含有不同濃度 0、0.3、0.5、1.0、15、2.0mg·L-1的 HCE6 光敏劑的培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h，24 h后棄掉培養(yǎng)基，用生理鹽水沖洗2次，加入無(wú)藥培養(yǎng)基，4個(gè)96孔板板分別接受光照強(qiáng)度劑量分別為0.6 J ·cm-2(0.1 W，10 min)、1.8 J ·cm-2(0.3 W，10 min)、2.7 J ·cm-2(0.9 W，5 min)，5.4 J ·cm-2(0.9 W，10 min)光強(qiáng)劑量的 PDT 治療，48h后棄掉培養(yǎng)基，生理鹽水沖洗2次，加入10∶1無(wú)血清培養(yǎng)基與CCK-8試劑混合液每孔150μL，2 h后在酶標(biāo)儀上測(cè)OD值(450 nm)，測(cè)量3次，此過(guò)程均為避光。暗毒性實(shí)驗(yàn)時(shí)不進(jìn)行PDT治療，加完光敏劑24 h后，棄掉培養(yǎng)基，用生理鹽水沖洗2次，加入無(wú)藥培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后直接測(cè)量細(xì)胞增殖活性，其步驟與光毒性實(shí)驗(yàn)相同。增殖率數(shù)據(jù)計(jì)算處理后，用GraphPad Prism5繪制增殖率曲線圖。增殖率=(對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/對(duì)照組OD×100%。

1.2.3 建立QBC939人膽管癌荷瘤裸鼠模型 培養(yǎng)瓶的細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)到5×107以上時(shí)，培養(yǎng)液稀釋制成1×1010·L-1的細(xì)胞懸液5 mL。每只裸鼠于臀部皮下注射濃度為1×1010·L-1的細(xì)胞懸液0.15 mL。接種后每2 d觀察動(dòng)物一次，到觀察到有腫瘤長(zhǎng)出后，改為每天觀察一次，并記錄腫瘤長(zhǎng)徑(L)、短徑(D)。

1.2.4 光動(dòng)力治療實(shí)驗(yàn)與病理切片制作 取腫瘤長(zhǎng)徑(L)1 cm左右裸鼠，分對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組兩組。兩組分別尾靜脈分別注射0、0.5 mg·kg-1光敏劑，24 h后PDT治療，光源距瘤體2 cm，光強(qiáng)度120 J·cm-2，功率0.2 W，治療20 min。光動(dòng)力治療后每天觀察裸鼠有無(wú)角膜光敏感以及腫瘤以外皮膚變化，并分別第1、3、7、10天觀察并記錄瘤塊長(zhǎng)短徑，GraphPad Prism5繪制瘤體變化曲線。腫瘤體積計(jì)算公式為:V=1/2×L×D2。PDT治療第10天處死裸鼠，取腫瘤置于10%甲醛中固定，浸蠟包埋，制作切片，并HE染色，光鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件包處理分析數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差即(±s)表示。采用方差分析，多個(gè)均數(shù)間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，顯著性水準(zhǔn)為0.05，即P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 光動(dòng)力處理后QBC939系膽管癌細(xì)胞增值率變化以及光敏劑的光毒性與暗度性比較 在QBC939系人膽管癌細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)中，特定光照強(qiáng)度下，隨著培養(yǎng)液中光敏劑濃度含量的增加，細(xì)胞的存活率逐漸是降低的，但當(dāng)光敏劑濃度1.5 mg·L-1后，在增加培養(yǎng)基中光敏劑濃度，這個(gè)數(shù)值不再變化，可能原因是這種膽管癌細(xì)胞對(duì)光敏劑吸收有飽和現(xiàn)象(圖2)。在a、b兩個(gè)光照劑量下無(wú)論光敏劑濃度怎樣增加，PDT都無(wú)法達(dá)到完全抑制，當(dāng)把光照劑量調(diào)到 2.7 J·cm-2(0.9 W，5 min)，光敏劑濃度1.5 mg·L-1時(shí)，可完全抑制細(xì)胞增殖，這可能是前者光照劑量不夠。當(dāng)光照強(qiáng)度繼續(xù)增加到圖d劑量5.4 J·cm-2(0.9 W，10 min)時(shí)，細(xì)胞增殖率曲線與c圖無(wú)差異，這可能與細(xì)胞對(duì)光敏劑的吸收量以及光照吸收也有飽和現(xiàn)象有關(guān)?？梢?jiàn)這類光敏劑在抑制QBC939細(xì)胞時(shí)存在最適濃度和光照劑量，最適完全抑制濃度為1.5 mg·L-1，最佳光照劑量為2.7 J·cm-2(功率0.9 W，5 min)，超過(guò)這些劑量范圍PDT對(duì)QBC939細(xì)胞的抑制效果不再變化。圖2，a、b、c、d 四組中1.5 mg·L-1與 2.0 mg·L-1濃度組間細(xì)胞存活率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，其余濃度組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

暗毒性與光毒性在暗度性實(shí)驗(yàn)中，可見(jiàn)到在沒(méi)有激光下，對(duì)膽管癌細(xì)胞抑制作用十分微弱，而有激光治療下，對(duì)膽管癌細(xì)胞有明顯的有抑制作用。暗毒性下，QBC939膽管癌細(xì)胞增殖率下降斜率不明顯，而光毒性下，這個(gè)斜率明顯，可見(jiàn)光敏劑的暗度性對(duì)癌細(xì)胞抑制甚微，而光毒對(duì)癌細(xì)胞的抑制十分顯著(圖3)。暗毒性曲線，0 mg·L-1與0.3 mg·L-1間細(xì)胞增殖率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，1.5 mg·L-1與 2.0 mg·L-1間細(xì)胞增殖率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，其余濃度組有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.05)。光毒性曲線，1.5 mg·L-1與 2.0 mg·L-1間細(xì)胞增殖率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，其余濃度組有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

2.2 裸鼠荷瘤瘤體變化對(duì)比 圖4，A圖為光動(dòng)力10 d后光動(dòng)力組(下)與對(duì)照組(上)裸鼠腫瘤體積比較，B圖為相應(yīng)裸鼠處死后摘取的瘤塊;兩組裸鼠上面一排為對(duì)照組，下面一排為實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組瘤塊體積(0.5 ±0.010)cm3，對(duì)照組瘤塊體積(2.25 ±0.015)cm3，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05。動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，PDT前各組腫瘤大致相似平均(0.073±0.012)cm3，無(wú)明顯差異。實(shí)驗(yàn)處理第3天開(kāi)始，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組有明顯腫瘤體積差異(P＜0.05)，到第10天，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組體積差異明顯，實(shí)驗(yàn)組瘤塊體積(0.5 ±0.010)cm3，而對(duì)照組為(2.25±0.015)cm3。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組除光照處外，均無(wú)皮膚變色壞死，也無(wú)角膜光敏感。

圖5，光動(dòng)力治療后，不同時(shí)間(1、3、7、10 d)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組瘤體變化曲線。PDT后不同時(shí)間點(diǎn)，對(duì)照組瘤體平均體積明顯大于實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組生長(zhǎng)曲線斜率明顯高于實(shí)驗(yàn)組。可見(jiàn)對(duì)照組瘤體生長(zhǎng)速度明顯高于實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在PDT后同一天，以及各組間PDT后不同時(shí)間段瘤塊體積大小，均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05。

2.3 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組瘤體病理對(duì)比 圖6，A(100倍)、B(400倍)為對(duì)照組瘤塊病理切片HE染色光鏡下視圖。C(100倍)、D(400倍)為實(shí)驗(yàn)組瘤塊病理切片HE染色光鏡下視圖。對(duì)照組(A、B)瘤組織可見(jiàn)瘤組織中央部位無(wú)壞死區(qū)域，邊緣瘤細(xì)胞增殖旺盛，瘤組織外有包膜，腫瘤細(xì)胞大而且細(xì)胞核深染，核漿比例大，細(xì)胞核異型性非常顯著，可觀察到核分裂。實(shí)驗(yàn)組(C、D)瘤組織內(nèi)部見(jiàn)大片的變性、壞死區(qū)域，腫瘤邊緣可見(jiàn)殘存腫瘤細(xì)胞，腫瘤組織內(nèi)可見(jiàn)出血，腫瘤細(xì)胞核可見(jiàn)固縮、碎裂及溶解，細(xì)胞可呈崩解狀態(tài)。

3 討論及結(jié)論

PDT對(duì)腫瘤組織及細(xì)胞的殺傷機(jī)制主要有三方面［5］:(1)誘導(dǎo)組織細(xì)胞凋亡與壞死。Cao 等［6］在QBC939系膽管癌細(xì)胞水平和荷瘤裸鼠模型實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)光動(dòng)力治療后腫瘤與對(duì)照組相比細(xì)胞凋亡率明顯增高，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C、caspase-9和caspase-3表達(dá)明顯增高，證明了光動(dòng)力可誘導(dǎo)QBC939系膽管癌細(xì)胞細(xì)胞色素 C、caspase-9和caspase-3的釋放，并激活誘導(dǎo)QBC939細(xì)胞的的壞死和凋亡。(2)對(duì)腫瘤微血管損傷。PDT能導(dǎo)致炎性反應(yīng)和炎性因子的釋放，引起血管收縮、血流停滯，致使腫瘤組織水腫、缺血、壞死，從而達(dá)到殺傷腫瘤的目的［7］。(3)誘發(fā)免疫及炎癥。PDT可引起組織內(nèi)免疫炎癥相關(guān)因子TNF、IL22等細(xì)胞因子表達(dá)。PDT的免疫作用涉及腫瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及細(xì)胞因子等方面［8］。

自20世紀(jì)80年代從HpD(血卟啉衍生物)中分離純化出 PhotofrinⅡ(光敏素Ⅱ)［9］，為目前臨床上常用的一代光敏劑，對(duì)應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)630 nm。這類光敏劑在膽管癌的基礎(chǔ)研究國(guó)內(nèi)外都有很多，無(wú)論細(xì)胞水平還是活體動(dòng)物方面成效都很顯著。一代光敏機(jī)在臨床實(shí)驗(yàn)也相當(dāng)成熟，但在國(guó)內(nèi)應(yīng)用沒(méi)有國(guó)外多，而且在膽管癌臨床治療中還不夠理想。一些臨床應(yīng)用顯示這類光敏劑有兩個(gè)重要局限，皮膚光敏感長(zhǎng)(3個(gè)月)和殺傷腫瘤深度有限(4～6 mm)［10］，而臨床研究顯示膽管癌大多侵犯深度為7～9 mm［11］，可見(jiàn)殺傷深度是其重大弊端。二代光敏劑最早出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代，近年來(lái)新發(fā)光敏劑頻出不斷。與一代光敏劑相比，成分單一、分子結(jié)構(gòu)明確、最大紅外吸收波長(zhǎng)更長(zhǎng)，吸收系數(shù)高，ROS產(chǎn)率高，對(duì)腫瘤的殺傷效果更強(qiáng)，副作用小，這類光敏機(jī)在國(guó)外研究和應(yīng)用都比較頻繁，但在國(guó)內(nèi)還尚未有用于臨床治療的報(bào)道。常用于膽管癌研究和治療的有ALA、mTHPC、HYP等，這些光敏劑與一代光敏劑比較，在人體內(nèi)的殘留時(shí)間明顯降低，對(duì)皮膚的光毒性也明顯減小。Kniebühler等［12］用 mTHPC 光動(dòng)力(0.032 ～0.063 mg·kg-1，652 nm，50 J ·cm-2)聯(lián)合ERCP支架植入治療13個(gè)無(wú)法手術(shù)患者，光動(dòng)力治療后患者平均生存期可達(dá)13個(gè)月，并用熒光動(dòng)力學(xué)測(cè)量空腔黏膜光敏劑最大濃度時(shí)間是注射光敏劑后3.85 d，但皮膚光敏感時(shí)間長(zhǎng)是其主要缺點(diǎn)。三代光敏劑是于二代光敏劑基礎(chǔ)上結(jié)合某些生物或者化學(xué)成分，如抗體、氨基酸、糖、脂類、蛋白質(zhì)等，以增強(qiáng)光敏劑對(duì)腫瘤組織的選擇性或生物相容性［13］，但這類光敏劑仍處于實(shí)驗(yàn)室研究中，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)臨床應(yīng)用報(bào)道。其中有在膽管癌細(xì)胞水平的一項(xiàng)研究，Lee等［14］用殼聚糖和熊去氧膽酸制作的納米材料，與光敏劑Ce6(二氫卟吩E6)形成離子結(jié)合物，用于HuCC-T1系膽管癌細(xì)胞光動(dòng)力治療研究，他的結(jié)果表明納米材料能增強(qiáng)膽管癌細(xì)胞對(duì)光敏劑的吸收以及膽管癌細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生量。

HPPH為二代光敏劑，在665 nm處有很強(qiáng)的吸收峰，這些特性使其比卟吩母鈉(630 nm)和m-THPH(652 nm)有更強(qiáng)的組織穿透性［15］。已用于肺癌、食管癌、頭面頸癌、膀胱癌、胃癌等多種實(shí)體腫瘤的治療，但未見(jiàn)在膽管癌中的研究及應(yīng)用。葉綠光I號(hào)(YLGI)是HPPH衍生物，其增加水溶性，卻降低了脂溶性，更容易在活體內(nèi)代謝。YLGI是葉綠素類二代光敏劑，分子式為C40H47N4O7Na3，分子量為 764.79，最大激發(fā)波長(zhǎng) 652 nm，難溶于有機(jī)溶劑，易溶于水，易于在人體內(nèi)代謝，所以最大優(yōu)點(diǎn)就是代謝快，皮膚光敏感時(shí)間短，副作用微小。但由于其脂溶性降低，可能會(huì)降低其在細(xì)胞內(nèi)的積累，以及光毒性。無(wú)論細(xì)胞水平還是裸鼠荷瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，YLG I-PDT對(duì)膽管癌生長(zhǎng)抑制效果十分明顯，而且暗度性微弱，也未見(jiàn)到皮膚光敏感。本實(shí)驗(yàn)已在細(xì)胞水平和活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上看到了其明顯的抑制腫瘤效果和相對(duì)安全性，但其在臨床上效果仍需要大量基礎(chǔ)和臨床實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證。

［1］Ahrendt SA，Nakeeb A，Pitt HA.Cholangiocarcinoma［J］.Clin Liver Dis，2001，5(1):191-218.

［2］Anderson CD，Pinson CW，Berlin J，et al.Diagnosis and treatment ofCholangiocarcinoma［J］.Oncologist，2004，9(1):43-57.

［3］Sagawa N，Kondo S，Morikawa T，et al.Effectiveness of radiation therapy after surgery for hilar cholangiocarcinoma［J］.Surg Today，2005，35(7):548-552.

［4］Blechacz B，Gores GJ.Cholangiocarcinoma:advances in pathogenesis，diagnosis，and treatment［J］.Hepatology，2008，48(1):308-321.

［5］章申峰，龔興國(guó).光動(dòng)力療法對(duì)腫瘤的作用機(jī)制及其影響因素［J］.細(xì)胞生物學(xué)雜志，2005，27(4):395-399.

［6］Cao LQ，Xue P，Lu HW，et al.Hematoporphyrin derivative-mediated photodynamic therapy inhibits tumor growth in human cholangiocarcinoma in vitro and in vivo［J］.Hepatology Research，2009，39(12):1190-1197.

［7］Webber J，Herman M，Kessel D，et al.Photodynamic treatment of neoplastic lesions of the gastrointestinal tract.Recent advances in techniques and results［J］.Langenbecks Arch Surg，2000，385(4):299-304.

［8］錢新宇，羅榮城.光動(dòng)力學(xué)療法的免疫作用［J］.中國(guó)激光醫(yī)學(xué)雜志，2005，14(4):256-258.

［9］Dougherty TJ，Kaufman JE，Goldfarb A，et al.Photoradiation therapy for the treatment of malignant tumors［J］.Cancer Res，1978，38(8):2628-2635.

［10］Ortner MA，Liebetruth J，Schreiber S，et al.Photodynamic therapy of nonresectable cholangiocarcinoma［J］.Gastroenterology，1998，114(3):536-542.

［11］Wiedmann M，Caca K，Berr F，et al.Neoadjuvant photodynamic therapy as a new approach to treating hilar cholangiocarcinoma［J］.Cancer，2003，97(11):2783-2790.

［12］Kniebühler G，Pongratz T，Betz CS，et al.Photodynamic therapy for cholangiocarcinoma using low dose mTHPC［J］.Photodiagnosis and Photodynamic Therapy，2013，10(3):220-228.

［13］翟 燕，韓光范.光動(dòng)力療法治癌光敏劑的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)激光醫(yī)學(xué)雜志，2006，15(1):48-55.

［14］Lee HM，Jeong YI，Kimdo H，et al.Ursodeoxycholic acid-conjugated chitosan for photodynamic treatment of HuCC-T1 human cholangiocarcinoma cells［J］.International Journal of Pharmaceutics，2013，454(1):74-81.

［15］Bellnier DA，Greco WR，Loewen GM，et al.Clinical pharmacokinetics of the PDT photosensitizers porfimer sodium(Photofrin)，2-［1-hexyloxyethyl］-2-devinyl pyropheophorbide-a(Photochlor)and 5-ALA-induced protoporphyrin IX［J］.Lasers Surg Med，2006，38(5):439-444.