杜方平，陳衛(wèi)東，朱月健，賈步云，俞年軍，楊青山，金傳山，季兆潔，彭代銀

(1.金寨縣金山寨食(藥)用菌種植專業(yè)合作社，安徽六安 237300;2.安徽中醫(yī)藥大學藥學院;3.安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心;4.安徽省中醫(yī)藥科學院中藥資源保護與開發(fā)研究所，安徽合肥 230012;5.安徽濟人藥業(yè)有限公司，安徽亳州 236800)

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核。茯苓甘，淡，性平，歸肺、脾、腎經(jīng)，具有利水滲濕，健脾和胃，寧心安神等功效，用于治療水腫，小便不利等［1］。在傳統(tǒng)中藥組方中，茯苓的配伍率極高，因而有“十方九苓”之說。一些經(jīng)典的組方一直沿用至今，并與西藥相結(jié)合對于一些疾病有良好的治療效果，如桂枝茯苓湯。臨床研究表明，桂枝茯苓湯對于慢性盆腔炎［2-4］、腎炎［5］以及子宮肌瘤［6］都有很好的輔助治療效果。同時，另有研究表明，以該方為基礎開發(fā)的茯苓桂枝膠囊對于月經(jīng)不調(diào)不孕癥有一定的治療效果［7］。茯苓中具有多種活性成分，包括茯苓三萜，茯苓多糖、樹膠、蛋白質(zhì)和脂肪等。其中茯苓三萜類化合物主要包括茯苓酸、土莫酸等、茯苓多糖主要包括β-茯苓聚糖、羧甲基茯苓多糖、茯苓次聚糖、木糖醇以及纖維素等。藥理研究表明，茯苓三萜的主要藥理活性為抗炎，利尿，抗氧化活性以及抑菌活性［8］，而茯苓多糖的活性主要表現(xiàn)為能夠提高機體的免疫力［9-10］。本研究采用儀器分析手段，測定大別山仿野生栽培茯苓中茯苓多糖以及茯苓酸的含量，探索不同茯苓樣品中有效成分含量的差異，為茯苓藥材質(zhì)量標準的建立和完善以及培育具有優(yōu)良遺傳特性菌種提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-15C高效液相色譜儀:日本島津公司;UV757CRT紫外可見分光光度計:上海精科公司;RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海亞榮生化儀器廠;AB125-S型十萬分之一分析天平:德國梅特勒公司;KQ-300B型超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 材料 仿野生栽培茯苓樣品6份:采集于大別山區(qū)野生環(huán)境(1號取自金寨縣桃?guī)X鄉(xiāng)桐崗村關(guān)廟組，栽培場坐北向南，砂壤土質(zhì)，海拔150 m，坡度20°;2號取自金寨縣桃?guī)X鄉(xiāng)東沖村培塘組，栽培場坐東向西，黃砂壤土質(zhì)，海拔230 m，坡度25°左右;3號取自金寨縣桃?guī)X鄉(xiāng)秦灣村紅毛田組，栽培場坐東南向西北，黃砂壤土質(zhì)，海拔200 m，坡度45°左右;4號取自金寨縣桃?guī)X鄉(xiāng)龍?zhí)洞宕鬄辰M，栽培場坐西北向東南，黃壤土質(zhì)，海拔185 m，坡度35°;5號取自金寨縣桃?guī)X鄉(xiāng)龍?zhí)洞宕鬄辰M，栽培場坐西北向東南，黃壤土質(zhì)，海拔185 m，坡度35°，原生松蔸邊地下3寸左右外;6號取自金寨縣天堂寨鎮(zhèn)鼓樓村，栽培場坐北向南，砂壤土細，海拔665 m，坡度30°);無水葡萄糖標準品:中國藥品生物制品檢定所，批號:100736-202423，純度:100%;茯苓酸標準品:上海源葉生物科技有限公司，批號:YJ0616SA14，純度≥98%;乙腈(色譜純):上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?甲醇(色譜純):上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?磷酸(分析純):江蘇強盛功能化學股份有限公司;

2 茯苓多糖含量研究

2.1 標準品溶液的配制 精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標準品10.00 mg，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度線，即得0.1 g·L-1的葡萄糖標準品溶液，放置于4℃條件下保存。

2.2 供試品溶液的配制 精密稱取過60目篩的仿野生栽培茯苓樣品粉末1.0 g于具塞錐形瓶中，加入50 mL純水，超聲30 min后用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10 mL定容至50 mL容量瓶，即得供試品溶液。

2.3 標準曲線 分別精密移取葡萄糖標準品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于 10 mL 試管中，補加純水至1 mL，再加入5%苯酚溶液1 mL，濃硫酸4 mL，沸水浴25 min，冰水浴15 min。取出后，補足減失體積，在490 nm處測定其吸光度(A)，以濃度(C)對其做回歸方程，回歸方程為A=8.0246C-0.0019(r=0.999 5)。

2.4 精密度試驗 精密移取標準品溶液1.0 mL至10 mL試管中，同前法操作后，連續(xù)測定吸光度5次，RSD值為1.71%，表明該方法精密度良好。

2.5 重復性試驗 分別精密移取5份樣品溶液1.0 mL至10 mL試管中，同前法操作后，連續(xù)測定吸光度5次，RSD值為1.03%，表明該方法重復性符合要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗 精密移取標準品溶液1.0 mL至10 mL 試管中，同前法操作后，于 0、1、2、3、4、5 h測定吸光度，計算RSD值，結(jié)果RSD值為0.98%，說明樣品在5 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗 精密移取0.5 mL已知含量的樣品溶液，平行5份，分別精密加入0.5 mL葡萄糖的標準品溶液(0.1 g·mL-1)，同前法操作后，于490 nm波長下測定吸光度，計算得平均加樣回收率為99.04%，RSD為0.63%，符合測定要求。

2.8 樣品中茯苓多糖含量測定［11］取各仿野生栽培茯苓樣品，按“2.2供試品溶液的配制”項下方法，配制供試品溶液。分別精密移取各供試品溶液0.5 mL，加純水至1 mL加入5%苯酚溶液1 mL，濃硫酸4 mL，沸水浴25 min，冰水浴15 min。取出后，補足減失體積，在490 nm處測定其吸光度(A)，根據(jù)標準曲線計算不同仿野生栽培茯苓樣品中茯苓多糖的百分含量，分別為 1.259%、2.169%、2.392%、2.830%、4.186%、0.709%。

3 茯苓酸含量研究

3.1 色譜條件 島津LC-15C高效液相色譜儀(包括LC-15C高壓輸液泵、SPD-15C紫外檢測器);色譜柱:COSMOSIL C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:乙腈∶0.4%乙酸(80∶20);柱溫:30℃;進樣量 20μL;流速:1.0 mL·min-1;檢測波長:360 nm。見圖1。

3.2 標準品溶液的配制 精密稱取茯苓酸標準品1.50 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度線，即得150 mg·L-1的標準品溶液，于4℃冰箱保存。

3.3 供試品溶液的配制 精密稱取過60目篩的仿野生栽培茯苓樣品粉末1.0 g于具塞錐形瓶中，加入30 mL甲醇，浸泡30 min，超聲90 min，過濾，并用甲醇洗滌濾渣，合并濾液和洗滌液，水浴蒸干后，用甲醇復溶并定容至10 mL容量瓶中，即得供試品溶液。

3.4 標準曲線 精密移取茯苓酸標準品溶液，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成15、30、60、75、100、120、135、150、300 g·mL-1的標準系列濃度，搖勻及過濾后，進樣分析，以峰面積(Y)對茯苓酸的質(zhì)量濃度(X)進行線性回歸，回歸方程:Y=200.83X-7.8316(r=0.999 9)，表明茯苓酸在15～300 mg·L-1濃度范圍內(nèi)線性良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液分別于0、0.5、1、2、3、4、5 h進樣分析，結(jié)果茯苓酸峰面積的RSD為1.45%，表明茯苓酸的供試品溶液在5 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.6 精密度試驗 取標準品溶液150 mg·L-1，重復進樣5次，測定茯苓酸峰面積，計算茯苓酸峰面積的RSD值為0.69%。

3.7 重復性試驗 按照“3.3供試品溶液的制備”項下方法，平行制備6份供試品溶液，進樣分析，計算茯苓酸峰面積RSD值為1.74%。

3.8 加樣回收率試驗 精密移取0.5 mL已知茯苓酸含量的供試品溶液，平行5份，每份精密加入0.5 mL茯苓酸標準品溶液(150 mg·L-1)，用流動相配成合適濃度，進樣分析，計算得平均加樣回收率為99.11%，RSD 為 0.53%。

3.9 樣品中茯苓酸含量測定［12-13］取各仿野生栽培茯苓樣品，按“3.3供試品溶液的配制”項下方法，配制供試品溶液。分別精密移取各供試品溶液0.5 mL，稀釋至1.5 mL，用 0.45 μm 過濾后進樣分析，記錄峰面積，根據(jù)標準曲線計算不同仿野生栽培茯苓樣品中茯苓酸的百分含量分別為0.697%、0.598%、0.781%、0.818%、0.777%、0.441%。

4 結(jié)果

經(jīng)測定，在6個不同的大別山仿野生栽培茯苓樣品中5號樣品茯苓多糖的含量(4.186%)最高，4號樣品的茯苓酸含量(0.818%)最高。4號和5號仿野生栽培茯苓生長地的生境是一致的，均為金寨縣桃?guī)X鄉(xiāng)龍?zhí)洞宕鬄辰M，栽培場坐西北向東南，黃壤土質(zhì)，海拔185 m，坡度35°，說明該地采用仿野生栽培技術(shù)栽培出的茯苓較其它場地更優(yōu)。

5 討論

本文建立了準確、快速且重現(xiàn)性好的的仿野生栽培茯苓中茯苓多糖的分光光度測定方法以及茯苓酸的HPLC分析方法，為茯苓的質(zhì)量控制研究和質(zhì)量標準的完善提供了參考。同時本研究篩選出了大別山區(qū)不同仿野生栽培茯苓樣品中茯苓多糖與茯苓酸含量較高的茯苓樣品，實驗結(jié)果將為后期菌種的分離及擴繁提供依據(jù)。目前大別山區(qū)很多茯苓種植單位，并不重視茯苓菌種的篩選，尤其是對于其有效成分的含量關(guān)注的較少，嚴重影響了栽培茯苓的質(zhì)量。因而，菌種擴繁前的有效成分的測定，對于生產(chǎn)高品質(zhì)茯苓藥材具有十分重要的意義。

［1］國家藥典委員會.中國藥典(一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:224.

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