高靈素，虞國(guó)慧

(安徽省六安市人民醫(yī)院，安徽六安 215004)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是造血系統(tǒng)惡性腫瘤，異常的漿細(xì)胞能分泌大量異常的單克隆免疫球蛋白［1］，正常途徑難以降解異?？寺〉拿庖咔虻鞍?，異常M蛋白會(huì)聚集在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)。能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)，即大量未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生，進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。誘導(dǎo)細(xì)胞自噬(autophagy)則是MM細(xì)胞保護(hù)其免受未折疊蛋白影響的重要途經(jīng)之一［2-3］，本研究觀察體外經(jīng)自噬誘導(dǎo)及阻斷劑作用后MM細(xì)胞增殖能力的變化，并檢測(cè)自噬相關(guān)調(diào)節(jié)基因的變化，從不同角度探討MM的發(fā)病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株來源及細(xì)胞分組 本實(shí)驗(yàn)使用細(xì)胞株均由蘇州大學(xué)邱玉華教授惠贈(zèng);實(shí)驗(yàn)過程中，U266細(xì)胞隨機(jī)分為正常培養(yǎng)細(xì)胞組、雷帕霉素處理組、3-MA處理組，對(duì)照組如下:無血清培養(yǎng)條件下的U266細(xì)胞組、無血清培養(yǎng)條件下雷帕霉素處理U266細(xì)胞組、無血清培養(yǎng)條件下3-MA處理U266細(xì)胞，正常培養(yǎng)和無血清條件下培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞。雷帕霉素和3-MA藥物濃度均為1 000 μg·L-1。

1.2 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力 調(diào)整細(xì)胞密度為2×108·L-1，接種于 96 孔培養(yǎng)板，立即加入 10 μL CCK-8試劑，后分別間隔24 h加入CCK-8試劑，直至培養(yǎng)4 d，加入試劑后均繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 h，取出后在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各實(shí)驗(yàn)分組的吸光度，根據(jù)吸光度繪制增殖曲線。

1.3 細(xì)胞凋亡水平及自噬泡測(cè)定 U266細(xì)胞以2×108·L-1密度接種于培養(yǎng)瓶，按實(shí)驗(yàn)分組分別加入雷帕霉素及3-MA處理，于正常培養(yǎng)的24及72 h收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。培養(yǎng)96 h后離心洗滌去除處理因素，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)凋亡水平。同時(shí)檢測(cè)對(duì)照組U266細(xì)胞內(nèi)凋亡率。Atg8為自噬小體形成的第2個(gè)泛素樣蛋白結(jié)合系統(tǒng)，可以特異性的與MDC結(jié)合，因此，我們通過熒光染色進(jìn)行標(biāo)記，在熒光顯微鏡下可見漿細(xì)胞核周區(qū)域點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)熒光。培養(yǎng)24及72 h時(shí)均取少量U266細(xì)胞進(jìn)行MDC染色，孵育15 min后置于熒光顯微鏡下觀察染色情況。

1.4 免疫印跡分析細(xì)胞內(nèi)LC3蛋白水平 按實(shí)驗(yàn)分組分別收集培養(yǎng)24及72 h的U266細(xì)胞，按操作說明提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，統(tǒng)一調(diào)整所提取的各組蛋白濃度至4 g·L-1。每孔加入60 μg蛋白進(jìn)行蛋白凝膠電泳(SDS-PAGE)。設(shè)置電泳的電壓為恒壓70 mV，放入電泳槽內(nèi)，直至蛋白電泳至分離膠底部;取出凝膠，按順序放置好纖維素膜，在90 mV條件下在轉(zhuǎn)移槽內(nèi)轉(zhuǎn)移40 min。取下纖維素膜，脫色搖床上用含5%的脫脂奶粉的TBST封閉1 h。TBST清洗3次，將一抗至1∶1000的濃度(LC3∶兔抗人IgG)，在4℃條件下孵育過夜，然后再次用TBST清洗3次，稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1000)與纖維素膜作用1 h，反應(yīng)后TBST清洗共3次。使用化學(xué)發(fā)光法顯影于X膠片上。樣本的免疫印跡條帶均與同一樣本的內(nèi)參比較后作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 自噬相關(guān)基因 mtor、Beclin1、Atg5分析 分別收集培養(yǎng)24及72 h的各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，采用RNeasy kit(Qiagen)試劑盒提取U266細(xì)胞RNA樣本，設(shè)置反應(yīng)條件，每次取試驗(yàn)各組細(xì)胞1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按同等劑量cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。取PCR產(chǎn)物4 μL，加入指示劑 5 × Loading Buffer 2 μL，120 V，100 mA下進(jìn)行凝膠電泳30 min。結(jié)束后進(jìn)行凝膠成像儀成像并保存結(jié)果。引物序列由上海生物工程公司設(shè)計(jì)并合成，以β-actin為內(nèi)參(表1)。操作按說明進(jìn)行，PCR共32個(gè)循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡率采用t檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

表1 引物序列及片段大小

2 結(jié)果

2.1 自噬水平變化對(duì)MM細(xì)胞增殖的作用 根據(jù)繪制的增殖曲線我們發(fā)現(xiàn)，無血清培養(yǎng)條件下Jurkat細(xì)胞增殖基本停止，顯著低于正常對(duì)照及無血清培養(yǎng)U266細(xì)胞。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3-MA或雷帕霉素處理組細(xì)胞的增殖水平與對(duì)照組相比，在培養(yǎng)24及72 h有顯著區(qū)別(P＜0.05)，故確定實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)為24及72 h。而正常條件下培養(yǎng)24 h，雷帕霉素及3-MA處理的細(xì)胞增殖水平有呈上升趨勢(shì)，較未處理組緩慢。但隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至72 h，處理組細(xì)胞增殖處于緩慢上升趨勢(shì)(圖1)。

2.2 藥物處理對(duì)自噬水平的影響 自噬泡可以通過熒光染色后在電鏡下觀察到，如圖所見，正常培養(yǎng)U266細(xì)胞核周圍環(huán)繞藍(lán)色點(diǎn)狀熒光，加入雷帕霉素處理24 h后細(xì)胞核周熒光增多，表明與正常培養(yǎng)組相比自噬水平有增多。自噬抑制劑3-MA作用24 h后U266細(xì)胞核周熒光減少，提示自噬泡減少，自噬水平減低。而繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間后觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)72 h雷帕霉素處理細(xì)胞內(nèi)自噬水平明顯增高。而延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至72 h 3-MA處理組細(xì)胞內(nèi)核周藍(lán)色點(diǎn)狀熒光同樣增多(圖2)。

2.3 U266細(xì)胞凋亡水平檢測(cè) 加入雷帕霉素或3-MA的U266細(xì)胞培養(yǎng)24 h后檢測(cè)凋亡水平。我們發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞凋亡水平均升高，分別為1.7% ±0.2%(對(duì)照組);16.8% ±0.61%(3-MA 處理組);19.1% ±1.0%(雷帕霉素處理組);且 P ＜0.01，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至72 h，雷帕霉素處理組U266細(xì)胞凋亡水與培養(yǎng)24 h無明顯變化16.9% ±0.46%，而3-MA處理組凋亡水平明顯下降9.0% ±0.70%(圖3)。

2.4 正常培養(yǎng)U266細(xì)胞內(nèi)LC3蛋白表達(dá) LC3蛋白為自噬相關(guān)蛋白，在自噬泡形成過程中始終可檢測(cè)到，當(dāng)哺乳動(dòng)物發(fā)生自噬時(shí)，隨著自噬泡的形成，細(xì)胞內(nèi)LC3的含量明顯增加。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)U266細(xì)胞內(nèi)存在低水平表達(dá)的LC3蛋白，并發(fā)現(xiàn)其高于正常培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞(圖4)。

2.5 藥物處理后正常培養(yǎng)下U266細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響 正常培養(yǎng)條件下U266細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入雷帕霉素培養(yǎng)24 h，通過RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)mtor基因表達(dá)水平上升，而加入3-MA培養(yǎng)24 h后mtor基因表達(dá)水平也同樣呈上升表現(xiàn)。而培養(yǎng)至72 h正常培養(yǎng)組、雷帕霉素處理組及3-MA處理組mtor基因表達(dá)水平繼續(xù)上升(圖5)。同時(shí)檢測(cè)Atg5及Beclin1基因水平發(fā)現(xiàn)，Atg5基因表達(dá)趨勢(shì)與mtor基因一致(圖6)。而3-MA處理細(xì)胞組內(nèi)Beclin1基因表達(dá)水平均較其余2組低(圖7)。內(nèi)參如下(圖8)，各組數(shù)據(jù)均與同一內(nèi)參進(jìn)行比較。

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞是一種惡性漿細(xì)胞病，其腫瘤細(xì)胞起源于骨髓中的漿細(xì)胞，其特征為骨髓漿細(xì)胞異常增生伴有單克隆免疫球蛋白或輕鏈(M蛋白)過度生成，極少數(shù)患者可以是不產(chǎn)生M蛋白的未分泌型MM。在一般情況下細(xì)胞內(nèi)存在的異常蛋白能導(dǎo)致細(xì)胞死亡，細(xì)胞能通過多種途徑降解蛋白，研究發(fā)現(xiàn)自噬具有降解異常蛋白的能力。自噬可以降解胞內(nèi)堆積的毒性蛋白質(zhì)，故而我們推斷自噬是維持多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展的重要因素。已有研究證實(shí)抗腫瘤藥物通過自噬途徑起作用［4］。但同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，自噬對(duì)細(xì)胞的生存和增殖起到不利的作用，過度的自噬能導(dǎo)致細(xì)胞死亡［5］。

研究資料發(fā)現(xiàn)，Hoang等研究了MM細(xì)胞株中的自噬情況，結(jié)果表明其中存在一定水平的自噬現(xiàn)象［6］，當(dāng)細(xì)胞暴露于蛋白酶體抑制劑硼替佐米、受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，或用mTOR抑制劑處理時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的自噬水平會(huì)上升，幫助在上述環(huán)境下維持細(xì)胞長(zhǎng)期生存。同樣的，研究證明饑餓條件同樣可抑制mTOR蛋白的活化，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生，通過對(duì)自身細(xì)胞內(nèi)各種營(yíng)養(yǎng)元素物質(zhì)的降解來維持細(xì)胞增殖［7］。雷帕霉素為現(xiàn)有的mTOR蛋白抑制劑，研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液內(nèi)加入雷帕霉素可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生［8-9］。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，自噬過程中有Ⅰ/Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶系統(tǒng)參與。3-MA可通過抑制Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶(classⅢPI3K)來抑制自噬的發(fā)生，所以該藥物廣泛作為自噬抑制劑使用。然而又有研究發(fā)現(xiàn)，如果在正常培養(yǎng)條件下延長(zhǎng)3-MA和骨髓瘤細(xì)胞的作用時(shí)間，其自噬水平反而呈明顯上調(diào)狀態(tài)［10］。這可能是由于3-MA同時(shí)對(duì)I型PI3K系統(tǒng)也有抑制作用，起到誘導(dǎo)自噬的作用。故3-MA對(duì)自噬起到抑制及誘導(dǎo)的雙重作用。

多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞內(nèi)存在基礎(chǔ)自噬，為了研究其對(duì)細(xì)胞增殖的作用，我們繪制了饑餓培養(yǎng)條件下U266細(xì)胞及Jurkat細(xì)胞的增殖曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在體外饑餓條件下U266細(xì)胞仍具有增殖能力直至培養(yǎng)72 h。而對(duì)照組Jurkat細(xì)胞的增殖成低平曲線，基本停止增殖;在血清培養(yǎng)液條件下加入雷帕霉素及3-MA，細(xì)胞增殖水平較未加入試劑的U266細(xì)胞增殖水平明顯低下。

本實(shí)驗(yàn)研究了 mtor、Atg5及 Beclin1基因在U266細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。雷帕霉素可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)自噬，而3-MA在處理24 h時(shí)對(duì)自噬起到抑制的作用，到培養(yǎng)72 h，檢測(cè)自噬相關(guān)基因表達(dá)我們發(fā)現(xiàn)示3-MA反而對(duì)自噬起到誘導(dǎo)作用。這就證明了培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)到一定程度，3-MA對(duì)I型磷脂酰肌醇3磷酸激酶系統(tǒng)的抑制起主導(dǎo)作用，誘導(dǎo)自噬發(fā)生。Beclin1蛋白是Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶系統(tǒng)的組成部分，故Beclin1基因與Atg5基因相比，3-MA處理組培養(yǎng)24及72 h后Beclin1基因表達(dá)水平均較正常培養(yǎng)及雷帕霉素處理組低。故而我們可以得出結(jié)論，提示在培養(yǎng)過程中3-MA對(duì)Ⅲ型PI3K系統(tǒng)的抑制作用一直存在，故而導(dǎo)致Beclin1基因表達(dá)水平下降。

雖然我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)正常培養(yǎng)條件下雷帕霉素及3-MA對(duì)細(xì)胞內(nèi)自噬的影響不同，但多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖曲線為相同趨勢(shì)。故可推測(cè)過度誘導(dǎo)自噬及抑制自噬均可能造成細(xì)胞死亡，抑制細(xì)胞增殖。接下來本實(shí)驗(yàn)研究細(xì)胞內(nèi)凋亡水平。

自噬與凋亡均屬于程序性細(xì)胞死亡范疇，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)二者在某些情況下存在著聯(lián)系［11-12］，有著相互協(xié)同發(fā)展或拮抗的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雷帕霉素及3-MA處理24 h后骨髓瘤細(xì)胞內(nèi)內(nèi)凋亡水平均升高。但是到培養(yǎng)72 h時(shí)，3-MA處理的細(xì)胞組內(nèi)凋亡水平較培養(yǎng)24 h時(shí)下降。表明培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，培養(yǎng)液內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸降解，接近饑餓環(huán)境，3-MA通過對(duì)抗細(xì)胞凋亡來延長(zhǎng)細(xì)胞生存。

綜上所述，自噬可促進(jìn)MM細(xì)胞增殖，并維持其長(zhǎng)期生存，但自噬抑制劑、阻斷劑如雷帕霉素及3-MA也可同時(shí)抑制MM細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。證實(shí)自噬對(duì)MM細(xì)胞生存具雙重作用，或雙向調(diào)節(jié)左右，有必要進(jìn)一步深入探討，可能對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的治療提供新的治療靶點(diǎn)。

［1］Barnhart BC，Simon MC.Taking aim at translation for tumor therapy［J］.J Clin Invest，2007，117:2385-2388.

［2］White E，DiPaola RS.The double-edged sword of autophagymodulation in cancer［J］.Clin Cancer Res，2009，15:5308-5316.

［3］Hφyer-Hansen M，J??ttel? M.Connecting endoplasmic reticulum stress to autophagy by unfolded protein response and calcium［J］.Cell Death and Differentiation，2007，14:1576-1582.

［4］Zhang X，Chen LX，Ouyang L，et al.Plant natural compounds:targeting pathways of autophagy as anti-cancer therapeutic agents［J］.Cell Prolif，2012，45(5):466-476.

［5］Shigeomi Shimizu，Tatsushi Yoshida，Masatsune Tsujioka，et al.Autophagic Cell Death and Cancer［J］.Int J Mol Sci，2014，15:3145-3153.

［6］Hoang B，Benavides A，ShiY，et al.Effect of autophagy on multiple myeloma cell viability［J］.Mol Cancer Ther，2009，8:1974-1984.

［7］Scott RC，Schuldiner O，Neufeld TP.Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body［J］.Dev Cell，2004，7:167-178.

［8］Sarbassov DD，Ali SM，Sabatini DM.Growing roles for the mTOR pathway［J］.Curr Opin Cell Biol，2005，17:596-603.

［9］Copp J，Manning G，Hunter T.TORC-specific phosphorylation of mammalian target of rapamycin(mTOR):phospho-Ser2481 is a marker for intact mTOR signaling complex 2［J］.Cancer Res，69:1821-1827.

［10］Wu YT，Tan HL，Shui G，et al.Dual Role of 3-Methyladenine in Modulation of Autophagyvia Different Temporal Patterns of Inhibition on Class I and III Phosphoinositide 3-Kinase［J］.Journal of biological chemistry，2010，285:10850-10861.

［11］Maiuri MC，Zalckvar E，Kimchi A，et al.Self-eating and self-killing:crosstalk between autophagy and apoptosis［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8:741-752.

［12］Gordy C，He YW.The crosstalk between autophagy andapoptosis:where does this lead?［J］.Protein Cell，2012，3:17-27.