孫 峰周 錕姜曉玲李 強(qiáng)

共聚焦激光掃描顯微鏡在Mohs顯微切除術(shù)中的應(yīng)用

孫 峰1周 錕1姜曉玲2李 強(qiáng)1

目的: 明確共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)在Mohs顯微切除術(shù)中的應(yīng)用價(jià)值。方法: 對(duì)46例皮膚腫瘤患者行Mohs顯微切除術(shù)，對(duì)57例標(biāo)本(36例患者行1次手術(shù)切除，9例2次，1例3次)的側(cè)面和底面行CLSM掃描及快速冰凍病理切片檢查。結(jié)果: 病理檢查示:46例標(biāo)本未檢測(cè)到腫瘤組織，11例標(biāo)本檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞組織，CLSM示:45例標(biāo)本未檢測(cè)到腫瘤組織，12例標(biāo)本檢測(cè)到腫瘤組織。CLSM掃描與快速冰凍病理切片之間在檢測(cè)有無腫瘤組織方面無明顯差異(P＞0.05)。結(jié)論: 在Mohs顯微切除術(shù)中CLSM可以代替快速冰凍病理檢測(cè)腫瘤組織殘留。

Mohs顯微切除術(shù)； 共聚焦激光掃描顯微鏡； 皮膚腫瘤

Mohs顯微切除術(shù)是皮膚外科技術(shù)與特殊冰凍組織切片相結(jié)合的一種手術(shù)方法，是皮膚外科最重要的術(shù)種之一，特別是治療皮膚惡性腫瘤，不僅盡可能的一次手術(shù)完整徹底切凈腫瘤組織，降低腫瘤復(fù)發(fā)率，傷口易于愈合，而且能最大限度地減少皮膚缺損面積，為進(jìn)一步整形修復(fù)打下良好的基礎(chǔ)。但快速冰凍病理切片技術(shù)要求較高，一般基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)開展困難，制約了Mohs顯微切除術(shù)進(jìn)一步的發(fā)展。

共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)是近年來新興的具有高分辨率的光學(xué)成像系統(tǒng)，常被用于皮膚病特別是皮膚腫瘤的診斷。本研究旨在Mohs顯微切除術(shù)中對(duì)比分析CLSM與快速冰凍病理切片結(jié)果，明確CLSM是否能夠替代快速冰凍病理切片在Mohs顯微切除術(shù)中應(yīng)用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年9月至2014年9月期間來我院就診的46例皮膚腫瘤患者，其中鱗狀細(xì)胞癌17例，基底細(xì)胞癌13例，濕疹樣癌10例，惡性黑素瘤6例。男26例，女20例。年齡45～8l歲，平均63.6歲。

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)方法 在Mohs顯微外科手術(shù)標(biāo)記圖上標(biāo)記腫瘤位置和形態(tài)，局部常規(guī)消毒后，沿腫瘤邊緣外3～5 mm處作標(biāo)記線(為了記錄腫瘤與周圍正常組織相對(duì)恒定的位置關(guān)系，要垂直于手術(shù)切口標(biāo)記線劃一刀痕)，并沿標(biāo)記線切除腫物?；准?xì)胞癌和Bowen病患者的皮損外擴(kuò)大切除3 mm，鱗狀細(xì)胞癌擴(kuò)大切除5mm，原位黑素細(xì)胞瘤及乳房外Paget病擴(kuò)大切除2 cm，深及脂肪層，對(duì)每次切除的腫瘤組織包裹手術(shù)貼膜后，固定于標(biāo)本固定器上，首先進(jìn)行CLSM掃描，然后分割成小標(biāo)本并編號(hào)，置入標(biāo)本運(yùn)輸盒內(nèi)相應(yīng)方格中(標(biāo)本編號(hào)需與運(yùn)輸盒中方格的序號(hào)一致)，同時(shí)在標(biāo)記圖上標(biāo)記標(biāo)本分割、染色和編號(hào)情況，送標(biāo)本處理間進(jìn)行冰凍切片，檢測(cè)側(cè)面和底面，以快速冰凍病理切片檢查結(jié)果為依據(jù)，結(jié)果陰性，則行皮瓣成形術(shù)修復(fù)皮損結(jié)束手術(shù)。結(jié)果陽性，繼續(xù)行切除術(shù)。1

1.2.2 CLSM操作方法 獲取每位進(jìn)行Mohs顯微切除術(shù)患者離體組織的CLSM圖像，取患者切除的離體組織，運(yùn)用手術(shù)貼膜包裹后滴入無菌生理鹽水，將組織環(huán)置于貼有手術(shù)貼膜的離體組織上，將組織環(huán)與受檢組織相連，根據(jù)成像部位，旋轉(zhuǎn)探頭，得到最佳的成像角度，定位好粘合窗和組織表面，開始對(duì)組織進(jìn)行成像；成像時(shí)，選擇Z軸控制選項(xiàng)，然后調(diào)整Z值，直至看到粘合窗的圖像，根據(jù)具體情況，調(diào)整激光功率；進(jìn)行VivaBlock(XY序列)掃描、VivaStack(Z序列)掃描，選擇最佳圖像，進(jìn)行保存，確定是否完全切除腫瘤組織。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)資料采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

46例患者，以快速冰凍病理切片陰性為準(zhǔn)，切除1次者36例，2次者9例，3次1例，總計(jì)57例標(biāo)本進(jìn)行檢查，其中病理陰性46例，陽性11例，CLSM陰性45例，陽性12例，病理陰性中CLSM陽性1例，病理檢查陽性的CLSM全陽性(表1)。

表1 兩種檢測(cè)結(jié)果比較

經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析，兩組檢查結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說明CLSM檢查與冰凍病理檢查無明顯差異。

3 討論

皮膚腫瘤Mohs顯微切除術(shù)需要快速冰凍病理技術(shù)支持，基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)不具備條件，制約了Mohs顯微切除術(shù)的開展。

CLSM是近年來新興的具有高分辨率的光學(xué)顯微鏡，其采用激光作為光源，在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上采用共軛聚焦原理和裝置，并利用計(jì)算機(jī)對(duì)所觀察的對(duì)象進(jìn)行數(shù)字圖像處理。其具有無創(chuàng)、原位、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、三維重建等特點(diǎn)，2－5從而可以保證在細(xì)胞生理狀態(tài)下進(jìn)行診斷，還可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)對(duì)同一組織多次成像，減少了傳統(tǒng)切片制作過程中人為因素的影響，由于CLSM具有較好的敏感性和特異性，可以檢測(cè)表皮和真皮乳頭層，并達(dá)到較高的分辨率，清晰地顯示細(xì)胞和細(xì)胞器，其達(dá)到的深度是200～250μm，有研究對(duì)腫瘤組織使用CLSM，發(fā)現(xiàn)瘤細(xì)胞在鏡下清晰成像，鏡下胞核明亮，瘤細(xì)胞在瘤團(tuán)周邊排列成柵欄狀，中央排列不規(guī)則，與傳統(tǒng)組織學(xué)影像相似，被用于皮膚疾病特別是皮膚腫瘤的診斷和鑒別診斷。6同時(shí)還可以幫助手術(shù)者快速確定皮膚腫瘤的皮損邊界，評(píng)估手術(shù)的范圍。7－9有研究指出在 Mohs顯微切除術(shù)中，運(yùn)用CLSM提供的離體組織快速光學(xué)反射成像替代快速冰凍切片，可以提高手術(shù)速度，同時(shí)常規(guī)的病理常使用垂直方向的皮膚各生理切面，而CLSM可提供皮膚橫向的光學(xué)切面，可以動(dòng)態(tài)的檢測(cè)腫瘤，可以實(shí)現(xiàn)同一個(gè)深度(XY軸)和同一點(diǎn)不同深度(Z軸)的成像，相當(dāng)于在皮膚活體生理狀態(tài)下進(jìn)行無損傷的系列“光學(xué)切片”。因而 CLSM在中國(guó)又被形象地稱為“皮膚CT”，更易于被外科醫(yī)生接受。10，11

本研究通過對(duì)57份標(biāo)本分別進(jìn)行CLSM掃描及快速冰凍病理切片檢查，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，CLSM檢查與快速冰凍病理切片檢查無顯著性差異。該結(jié)果提示CLSM觀察到的結(jié)果與快速冰凍病理切片檢查結(jié)果具有較好的一致性，CLSM可以替代快速冰凍病理切片在Mohs顯微切除術(shù)中應(yīng)用。該結(jié)果中病理陰性的標(biāo)本CLSM顯示為陽性，此標(biāo)本取樣來自于基底細(xì)胞癌的患者，追究出現(xiàn)假陽性的原因是由于CISM操作者對(duì)于基底細(xì)胞癌影像掌握不夠深入所致，需要加強(qiáng)對(duì)CLSM操作醫(yī)師專業(yè)技能的培訓(xùn)與學(xué)習(xí)。本研究發(fā)現(xiàn)，快速冰凍病理切片制作、檢查時(shí)間需要在45 min左右，而運(yùn)用CLSM提供快速成像，大約需要10 min，且無需染色，可以動(dòng)態(tài)的觀察腫瘤組織，不受腫瘤組織種類的影響。同時(shí)大大的減少患者因多次麻醉造成的損傷，縮短了手術(shù)時(shí)間?？焖俦鶅霾±砬衅谱?、檢查費(fèi)用大約在700元，CLSM費(fèi)用大約在160元，因此更易于被外科醫(yī)生和患者接受。

總之，我們認(rèn)為CLSM是一項(xiàng)具有臨床應(yīng)用前景的技術(shù)，在Mohs顯微切除術(shù)中運(yùn)用CLSM，不僅可以減少患者多次麻醉的損害，縮短手術(shù)時(shí)間、減少檢查費(fèi)用，而且還可以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地觀察皮膚腫瘤邊界，連續(xù)觀察切除組織每一平面，對(duì)可疑部分可進(jìn)行多次、重復(fù)觀察，提供客觀、量化的評(píng)估指標(biāo)。盡管運(yùn)用CLSM尚存在組織固定困難，掃描深度較淺等不足12但CLSM的運(yùn)用即可以提高外科病理學(xué)的管理而且還可以指導(dǎo)任何人體組織的顯微手術(shù)。10

1李航.皮膚外科系列講座(五)－Mohs顯微描記手術(shù).中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2008，17(12):1807－1810.

2李歡，徐麗敏.共聚焦激光掃描共焦顯微鏡在皮膚科的應(yīng)用.國(guó)際皮膚性病學(xué)雜志，2007(1):27－29.

3Gonzalez S，Rajadhyaksha M，Rubinstein G，et al.Characterixation of psoriasis in vivo by reflectance confocalmicroscopy.J Med，1999，30(5－6):337－356.

4 Swind le LD，Thomas SG，F(xiàn)reeman M，etal.View of normal human skin in vivo as observed using fluorescent fiber－optic confocalmicroscopic imaging.J Invest Dermatol，2003，121:706－7l2.

5 Rajadhyaksha M，Gonzalez S，Zavislan JM，etal.In vivo confo-

calscanning lasermicroscopy of human skin II:advances in instru－mentation and comparison with histology.J Invest Dermatol，l999，113(3):293－303.

6 Chung VQ，Dwyer PJ，Nehal KS，et al.Use of ex vivo confocal scanning lasermicroscopy during Mohs surgery for nonmelanoma skin cancers.Dermatol Surg，2004，30(12pt1):1470－1478.

7 Sauermann K，Gambichler T，Jaspers S，etal.Histometric data obtained by in vivo confocai laser scanning microscopy in patients with systemic sclerosis.BMC Dermatol，2002，8(2):8.

8 Choi J，Choo J，Chung H，et al.Direct observation of spectral differences between normal and basal cell carcinoma(BCC)tissues using confocal Raman microscopy.Biopolymers，2005，77 (5):264－272.

9 Tannous ZS，Mihm MC，F(xiàn)lotte TJ，etal.In vivo examination of lentigomaligna and malignantmelanoma in situ，lentigomaligna type by near－infrared reflectance confocalmicroscopy:comparison of in vivo confocal images with histologic sections.J Am Acad Dermatol，2002，46(2):260－263.

10Rajadhyaksha M，Menaker G，F(xiàn)lotte T，et al.Confocal examination of nonmelanoma cancers in thick skin excisions to potentially guidemohsmicrographic surgery without Frozen histopathology.J Invest Dermatol，2001，117(5):1137－1143.

11劉華緒，葛華勇，張福仁.反射式共聚焦激光掃描顯微鏡的原理.中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志，2010，26(12):860－862.

12 Paddock SW.Confocal laser scanning microscopy.Biotechniques，1999，27(5):922－996.

(收稿:2014－12－05 修回:2015－03－31)

Application of con focal laser scanningm icroscope in Mohs surgery

SUN Feng，ZHOU Kun，JIANG Xiao-ling，et al.Tai’an Skin Disease Hospital，271000

Objective:To determ ine the value of confocal laser scanningmicroscope(CLSM)in detection of tumormargins after Mohsmicrographic surgery.M ethods:Fifty－seven samples from 46 patients(once surgery in 36 patients，twice in 9 patients，three times in 1 patient)were detected by CLSM and fast frozen biopsy.Results:There was no tumor tissue in 46 samples and tumor tissue seen in 11 samples by fast frozen biopsy and there was45 samples and tumor tissue seen in 12 samples under CLSM.There was no significantdifference between CLSM scanning and fast frozen biopsy in detecting the margins of the tumors(P＞0.05). Conclusion:CLSM can be used in allocating themargins of the tumor in Mohsmicrographical surgery for the substitute of fast frozen biopsy.

Mohsmicroscopic surgery；confocal laser scanningmicroscopy；skin tumor

1泰安市岱岳區(qū)皮膚病防治所，山東泰安，271000 2解放軍第88醫(yī)院病理科，山東泰安，271000