曹 慧，陳小珍，朱 巖，李祖光，祝 穎，鄭軍科

（1．浙江省質(zhì)量檢測(cè)科學(xué)研究院，浙江杭州 310030；2．浙江大學(xué)化學(xué)系，浙江杭州 310028；3．浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程與材料學(xué)院，浙江杭州 310014）

多壁碳納米管凈化－超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)同時(shí)測(cè)定牛奶中青霉素類(lèi)藥物殘留

曹 慧1，2，陳小珍1，朱 巖2，李祖光3，祝 穎1，鄭軍科1

（1．浙江省質(zhì)量檢測(cè)科學(xué)研究院，浙江杭州 310030；2．浙江大學(xué)化學(xué)系，浙江杭州 310028；3．浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程與材料學(xué)院，浙江杭州 310014）

研究了多壁碳納米管凈化－超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)同時(shí)測(cè)定牛奶中的羥氨芐青霉素、青霉素V、氨芐青霉素、苯咪青霉素、甲氧苯青霉素、青霉素G、苯咪青霉素、鄰氯青霉素、乙氧萘青霉素和雙氯青霉素藥物殘留。樣品用乙腈沉淀蛋白，提取液用磷酸緩沖液稀釋后，經(jīng)改性的多壁碳納米管材料凈化，通過(guò)Waters C18色譜柱分離，以乙腈和10mmol／L乙酸銨（pH 4．5）溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用電噴霧－正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。10種青霉素藥物在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)均大于0．99，方法的定量限在0．1～10．0μg／kg之間。在低、中、高3個(gè)濃度添加水平下，10種青霉素藥物的平均回收率為72．0％～110％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1．83％～9．33％之間。多壁碳納米管材料具有較好的凈化效果，該方法可以快速、準(zhǔn)確地測(cè)定牛奶中的青霉素類(lèi)藥物殘留。

多壁碳納米管；固相萃取；超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS／MS）；牛奶；青霉素

青霉素是一類(lèi)廣譜抗生素，具有消炎抗感染等作用，被廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)［1］。由于不合理使用、不遵守休藥期等原因，其殘留問(wèn)題逐漸成為人們關(guān)注的社會(huì)焦點(diǎn)，并成為引起畜禽產(chǎn)品消費(fèi)安全和食品貿(mào)易爭(zhēng)端的主要原因之一。

青霉素類(lèi)藥物殘留的分析方法有微生物法、高效液相色譜法和液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法。微生物法和高效液相色譜法的基質(zhì)干擾嚴(yán)重，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性。超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS／MS）技術(shù)是利用液相色譜的高分離能力與質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度及豐富的結(jié)構(gòu)信息相結(jié)合的強(qiáng)有力的分析工具，以其操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度和靈敏度高、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)成為藥物殘留檢測(cè)的有效手段，是目前常用的檢測(cè)方法［2－5］。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB／T 21315—2007中關(guān)于青霉素的檢測(cè)不僅前處理復(fù)雜，且需要以固相萃取小柱凈化來(lái)消除雜質(zhì)干擾，由于商品化的固相萃取小柱價(jià)格昂貴，導(dǎo)致檢測(cè)成本較高，而且長(zhǎng)時(shí)間的前處理操作致使部分穩(wěn)定性差的青霉素藥物回收率不理想。

多壁碳納米管（MWCNTs）是一種具有較強(qiáng)吸附性能的納米材料，一般由2～50層石墨片組成，直徑在幾到幾十納米之間，長(zhǎng)度可達(dá)幾十甚至上百微米。由于其比表面積大，吸附能力強(qiáng)，對(duì)有機(jī)化合物、金屬離子和有機(jī)金屬化合物等具有較高的富集能力，可用作固相萃取吸附劑［6］。近年來(lái)，MWCNTs及其改性材料開(kāi)始應(yīng)用于揮發(fā)性物質(zhì)［7］、農(nóng)藥［8－9］、獸藥［10－13］的吸附研究，并作為新型材料應(yīng)用于不同基質(zhì)的凈化［14－15］。

本工作利用改性后的MWCNTs固相萃取小柱凈化牛奶基質(zhì)，建立超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定牛奶中青霉素類(lèi)藥物殘留的方法，采用內(nèi)標(biāo)法定量，旨在為日常牛奶的檢測(cè)提供方法參考和技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 主要儀器與裝置

超高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀為XevoTMTQ－MS質(zhì)譜儀，配備AcquityTM超高效液相色譜：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品，配有電噴霧電離接口（ESI）及Masslynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Milli－Q超純水器：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；高速離心機(jī)：美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；氮?dú)獯蹈蓛x：天津市恒奧科技有限公司產(chǎn)品；渦旋混合器：太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；固相萃取裝置：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品。

1．2 主要材料與試劑

乙腈（色譜純）：德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；甲酸（色譜純）：美國(guó)Tedia公司產(chǎn)品；磷酸氫二鉀（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；水為Milli－Q系統(tǒng)純化水；MWCNTs（純度大于97％，直徑40～60nm，長(zhǎng)度5～15μm）：深圳市納米港有限公司產(chǎn)品。

羥氨芐青霉素（純度≥98．0％），青霉素V（純度≥98．8％），氨芐青霉素（純度≥99．0％），苯咪青霉素（純度≥99．8％），甲氧苯青霉素（純

度≥85．0％），青霉素G（純度≥99．6％），苯唑青霉素（純度≥92．0％），鄰氯青霉素（純度≥99．5％），乙氧萘青霉素（純度≥86．0％），雙氯青霉素（純度≥99．0％），青霉素G－D7（純度≥99．7％）標(biāo)準(zhǔn)品：均為德國(guó)Dr．Ehrenstorfer GmbH公司產(chǎn)品。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取10mg上述標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1g／L儲(chǔ)備液，密封儲(chǔ)存于－18℃冰箱中。分別吸取50μL 1g／L標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成5mg／L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用時(shí)稀釋成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，待測(cè)。

0．05mol／L磷酸緩沖溶液的配制：稱(chēng)取8．7g磷酸氫二鉀，超純水溶解，稀釋至1 000mL，調(diào)節(jié)pH 8．5。

1．3 實(shí)驗(yàn)條件

1．3．1 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity BEH C18柱（2．1mm×100mm×1．7μm）；柱溫35℃；樣品溫度25℃；進(jìn)樣體積5μL；流速0．2mL／min；流動(dòng)相：pH 4．5的10mmol／L乙酸銨溶液（A），乙腈（B）；梯度洗脫程序：0～1．5min、20％B，1．5～2min、20％～40％B，2～7．2min、40％B，7．2～7．6min、40％～95％B，7．6～9．5min、95％B，9．5～10min、95％～20％B。

1．3．2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，毛細(xì)管電壓2．50kV，離子源溫度150℃，脫溶劑氣溫度500℃，脫溶劑氣流量1 000L／h。青霉素類(lèi)藥物的質(zhì)譜參數(shù)列于表1。

表1 青霉素類(lèi)藥物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 The mass spectrometry conditions of penicillins

1．4 多壁碳納米管材料的處理

稱(chēng)取2g多壁碳納米管粉末于250mL單口燒瓶中，分別加入50mL濃硫酸和100mL濃硝酸，超聲振蕩1h，靜置后除去上層酸液，反復(fù)水洗至中性，烘箱烘干后研磨成細(xì)粉末。稱(chēng)取150mg多壁碳納米管細(xì)粉末于6mL固相萃取空管中，墊上柱篩板壓實(shí)，使用前用5mL甲醇、5mL水和5mL磷酸緩沖液活化。

1．5 前處理方法

稱(chēng)取5g牛奶于50mL離心管中，加入5mL乙腈，渦旋2min，混勻，離心后將上清液轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用0．05mol／L磷酸緩沖液定容，混勻后轉(zhuǎn)移至MWCNTs固相萃取小柱上，用10mL水淋洗，抽至近干后，用5．0mL乙腈洗脫，整個(gè)過(guò)程控制流速小于1mL／min，洗脫液于45℃下氮吹至干，加入1mL乙腈水溶液（2∶8，V／V）溶解，渦旋1min，過(guò)0．22μm微孔濾膜后，待UPLCMS／MS分析。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜條件的優(yōu)化

選擇高效的色譜柱是多組分分析的前提條

件。本實(shí)驗(yàn)選用Waters公司的UPLC BEH C18（2．1mm×100mm×1．7μm）色譜柱分離青霉素類(lèi)藥物，此色譜柱對(duì)10種青霉素類(lèi)藥物具有較強(qiáng)的保留，各色譜峰能得到有效地分離，干擾較小。由于乙腈的離子化效率優(yōu)于甲醇，本實(shí)驗(yàn)采用乙腈作為強(qiáng)洗脫流動(dòng)相，用甲酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相溶液為pH 4．5，這可以有效改善峰形，提高離子化效率，且避免部分青霉素產(chǎn)生雙峰，其總離子流圖示于圖1。

圖1 10種青霉素類(lèi)藥物的總離子流圖Fig．1 Total ion chromatogram of 10 penicillins

2．2 前處理方法的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)分別采用乙腈、甲醇、三氯乙酸、醋酸鋅與亞鐵氰化鉀溶液（1∶1，V／V）沉淀牛奶中的蛋白質(zhì)，比較其提取效果。雖然醋酸鋅和亞鐵氰化鉀沉淀蛋白的效果很好，但部分青霉素類(lèi)藥物被沉淀物包裹，嚴(yán)重影響回收率。由于青霉素類(lèi)藥物在酸性條件下穩(wěn)定性較差，故三氯乙酸不適合作為提取溶液。乙腈沉淀蛋白的能力較甲醇強(qiáng)，沉淀效果好，且易于分離，故采用乙腈作為提取溶劑。

牛奶成分復(fù)雜，通常采用固相萃取方式進(jìn)行凈化處理，由于提取溶劑極性強(qiáng)，直接過(guò)柱凈化藥物不能被保留，因此本實(shí)驗(yàn)分別考察了濃縮提取液后凈化和稀釋提取液后凈化兩種方式。結(jié)果表明：由于提取液中含有大量水，濃縮速度慢，部分目標(biāo)化合物損失率大，而采用0．05mol／L磷酸緩沖溶液稀釋提取液，使乙腈含量控制在5％左右，目標(biāo)化合物在凈化柱上都能得到保留。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇將提取液稀釋后過(guò)柱。

2．3 凈化條件的選擇

多壁碳納米管填料是影響凈化效果的直接因素，為了保證萃取小柱填料的均勻性，減少萃取柱中氣泡的產(chǎn)生，本實(shí)驗(yàn)采用濕法裝柱。與干法裝柱相比，多壁碳納米管填料更緊密結(jié)實(shí)，凈化效果較好。分別稱(chēng)取30、60、150mg多壁碳納米管，以濕法方式裝柱，考察不同柱容量的凈化效果。結(jié)果表明：奶粉基質(zhì)成分復(fù)雜，60mg填充量的除雜效果優(yōu)于30mg填充量，且60mg填充量已完全滿(mǎn)足分析的要求，故本實(shí)驗(yàn)采用60mg多壁碳納米管以濕法填充萃取柱。

2．4 方法學(xué)驗(yàn)證

2．4．1 線(xiàn)性范圍和定量限 本實(shí)驗(yàn)采用空白基質(zhì)溶液配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各分析物的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，10種青霉素類(lèi)藥物在各自的濃度范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，各藥物的相關(guān)系數(shù)r均在0．99以上，以10倍信噪比（S／N＝10）計(jì)算10種青霉素類(lèi)藥物的最低定量限，結(jié)果列于表2。

表2 青霉素類(lèi)藥物的線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限Table 2 The linear equation，correlation coefficient and LOQs of penicillins

2．4．2 回收率和精密度 在陰性的牛奶樣品中分別添加低、中、高3種不同濃度水平（青霉素V和甲氧苯青霉素的濃度分別為1、5、10μg／kg，其余青霉素的濃度分別為10、50、100μg／kg）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度做3次平行實(shí)驗(yàn)，按1．5方法進(jìn)行預(yù)處理，青霉素類(lèi)藥物的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差列于表3。

由表3可知，青霉素類(lèi)藥物的回收率為72．0％～110％，精密度為1．83％～9．33％，能滿(mǎn)足日常檢測(cè)的要求。

表3 青霉素類(lèi)藥物的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations of penicillins

2．5 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法比較

在陰性的牛奶樣品中添加青霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（青霉素V和甲氧苯青霉素的濃度為5μg／kg，其余青霉素的濃度為50μg／kg），分別進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB／T 21315—2007中的方法進(jìn)行前處理，10種青霉素類(lèi)藥物的回收率為61．4％～84．1％，精密度為2．48％～12．4％。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)所采用的前處理方法為乙腈水溶液提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除高濃度的乙腈，但存在速度較慢，部分青霉素穩(wěn)定性差，在前處理過(guò)程中容易損失和降解，造成回收率較低等問(wèn)題。而本實(shí)驗(yàn)的前處理過(guò)程較國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)單，并采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確。此外，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采用HLB固相萃取小柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化，價(jià)格昂貴、檢測(cè)成本高。因此，采用改性后的多壁碳納米管進(jìn)行凈化，不僅前處理簡(jiǎn)單，而且價(jià)格低廉，在一定程度上降低了檢測(cè)成本。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了改性多壁碳納米管固相萃取技術(shù)凈化牛奶樣品中青霉素類(lèi)藥物的分析方法，用酸將多壁碳納米管材料表面羧酸化，處理后的材料純度高，在溶液中分散均勻，凈化效果更好。該方法的回收率為72．0％～110％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1．83％～9．33％。與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB／T 21315—2007相比，該方法具有前處理簡(jiǎn)單、操作成本低、回收率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，適合日常樣品的檢測(cè)分析。

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Determination of Penicillin Residues in Milk by Multiwalled Carbon Nanotubes Cleaning and UPLC－MS／MS

CAO Hui1，2，CHEN Xiao－zhen1，ZHU Yan2，LI Zu－guang3，ZHU Ying1，ZHENG Jun－ke1

（1．Zhejiang Institute of Quality Inspection Science，Hangzhou310030，China；2．Department of Chemistry，Zhejiang University，Hangzhou310028，China；3．College of Chemical Engineering and Materials Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou310014，China）

A method was established for determining penicillin residues in milk by ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry（UPLC－MS／MS）and multiwalled carbon nanotubes cleaning．The samples were extracted by acetonitrile and diluted by phosphate buffer solution，a step for clean－up and proconcentration of the analytes by solid phase extraction cartridge packed with multi－walled carbon nanotubes

multiwalled carbon nanotubes（MWCNTs）；solid phase extraction；ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry（UPLC－MS／MS）；milk；penicillin

O 657．63

A

1004－2997（2015）01－0023－06

10．7538／zpxb．youxian．2014．0043

2014－01－05；

2014－04－07

科技部國(guó)家重大科學(xué)儀器設(shè)備開(kāi)發(fā)專(zhuān)項(xiàng)（2012YQ09022903）；浙江省科技廳錢(qián)江人才科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010R10044）；浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督系統(tǒng)科研計(jì)劃項(xiàng)目（20110203）資助

曹 慧（1980—），女（漢族），浙江湖州人，高級(jí)工程師，從事色譜和質(zhì)譜檢測(cè)與科研工作。E－mail：ch＿zj＿cn＠163．com

陳小珍（1960—），女（漢族），浙江杭州人，教授級(jí)高級(jí)工程師，從事食品檢測(cè)與研究工作。E－mail：cxz730＠163．com

時(shí)間：2014－08－20；

http：∥www．cnki．net／kcms／doi／10．7538／zpxb．youxian．2014．0043．html

（MWCNTs）．The target analytes were separated by Waters C18column with gradient elution using acetonitrile and 10mmol／L ammonium acetate（pH 4．5）as mobile phases．The analytes were detected by tandem quadrupole mass spectrometry after positive electrospray ionization by multiple reaction monitoring（MRM）．Internal standard method with matrix was used to determine the results．The correlation coefficient is greater than 0．99for each drugs．The limits of quantitation（LOQ）are 0．1－10．0μg／kg．The mean recoveries at the three spiked levels are 72．0％－110％．The relative standard deviations（RSDs）are 1．83％－9．33％．The results indicated that using multi－walled carbon nanotubes as solid phase extraction adsorbent is efficient for the purification．The simplicity，sensitivity and good precision of the method made it is well suitable for determination of penicillin residues in milk．