張桂榮王振輝劉玉梅劉 軍

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,吉林吉林 132101; 2.吉林省白山市松樹鎮(zhèn)畜牧站,吉林吉林 134704; 3.吉林正業(yè)生物制品股份有限公司,吉林吉林 132101)

抗鴨病毒性肝炎卵黃抗體提取方法探究

張桂榮1王振輝1劉玉梅2劉 軍3

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,吉林吉林 132101; 2.吉林省白山市松樹鎮(zhèn)畜牧站,吉林吉林 134704; 3.吉林正業(yè)生物制品股份有限公司,吉林吉林 132101)

為了探究抗鴨病毒性肝炎卵黃抗體的最佳提取方法。采用泊洛沙姆法卵黃抗體的脫脂方法試驗(yàn)。通過對濃度、蛋白質(zhì)含量、效價(jià)等結(jié)果進(jìn)行比較。試驗(yàn)結(jié)果顯示:由泊洛沙姆作為脂肪沉淀劑,其泊洛沙姆濃度為1.2%、辛酸濃度為0.2%時(shí)制得的抗體物理性狀好,抗體收率最高,效價(jià)高,抗體效價(jià)為1:64。

雛鴨病毒性肝炎;卵黃抗體;脫脂

1 方法

1.1 免疫雞蛋收集與蛋黃的分離

取收集的雞蛋，浸入42℃的0. 1%新潔爾滅水溶液中消毒15 min；隨后將雞蛋浸入溫度為95℃以上的水中消毒5 s，取出后于無菌條件下晾干或吹干；打蛋分離蛋清與卵黃，充分除去蛋清和卵黃系膜，將卵黃收集于一容器中，攪拌均勻，然后分別裝在三個(gè)容器內(nèi)。

1.2 泊洛沙姆法雛鴨病毒性肝炎卵黃抗體去脂試驗(yàn)[1]

泊洛沙姆法提卵黃抗體步驟

1.2.1 泊洛沙姆濃度的優(yōu)化

分別取卵黃液20ml，用去離子水做4倍稀釋，加入泊洛沙姆，使其終濃度分別為0.6%、0.8%、1%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%。靜置后用紗布過濾，取上清。

1.2.2 pH值的優(yōu)化

分別取卵黃液20ml，用去離子水做4倍稀釋，加入泊洛沙姆，使其終濃度為上步所得的最佳濃度。用稀鹽酸調(diào)pH值，使pH值分別為5.2、5.7、6.2、6.7、7.2、7.7。靜置后用紗布過濾，取上清。

1.2.3 辛酸濃度的優(yōu)化

分別取卵黃液20ml，用去離子水做4倍稀釋，加入泊洛沙姆，使其終濃度為上步所得的最佳濃度和pH。靜置后用紗布過濾，取上清，加入不同濃度辛酸，靜置48h。此后去除上層脂肪層，將粗提的抗體液用微孔濾器過濾至澄清。

1.3 脫脂抗體的效價(jià)測定[2]

采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測定抗體效價(jià)。將1%瓊脂溶于100ml的8%NaCl溶液的適量稀釋后的抗體與等量瓊脂混勻加入約0.01%的硫氯汞鈉鹽作為防腐劑，澆注成板，凝固后，在板上打孔，孔徑3mm，孔間距10mm，孔中加入抗原，每孔10μl，放置濕盒中，37℃溫箱，抗原就會向孔的四周擴(kuò)散，邊擴(kuò)散邊與瓊脂中的抗體結(jié)合。24～48h后觀察結(jié)果。

1.4 蛋白質(zhì)濃度的測定

將制得的抗體液用飽和硫酸銨法沉淀蛋白后，各組試驗(yàn)樣品以同樣的稀釋倍數(shù)稀釋，用ND-1000型紫外分光光度計(jì)測定卵黃抗體的蛋白含量。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 泊洛沙姆法的脫脂及效價(jià)測定結(jié)果

2.1.1 泊洛沙姆濃度的結(jié)果

表1 不同泊洛沙姆濃度的結(jié)果

表1可見，隨著泊洛沙姆濃度的增大，卵黃抗體水溶液逐漸澄清，顏色逐漸變淡，蛋白質(zhì)濃度逐漸降低。1%～1.4%為不影響效價(jià)的濃度范圍，當(dāng)泊洛沙姆濃度增加到1.6%及以上時(shí)，抗體效價(jià)開始降低。綜合考慮，故選1.4%的濃度為宜。

2.1.2 泊洛沙姆沉淀法沉淀離心條件的結(jié)果

表2 不同離心條件的結(jié)果

表2表明，不同離心速度離心結(jié)果與不離心直接紗布過濾處理結(jié)果無明顯區(qū)別。泊洛沙姆的沉淀脂肪效果很好，不用離心處理即可得到清澈透明。用泊洛沙姆提取卵黃抗體可以簡化生產(chǎn)工藝。

2.1.3 辛酸濃度的結(jié)果

表3 不同辛酸濃度的結(jié)果

表3表明，隨著辛酸濃度的增大，蛋白質(zhì)濃度逐漸降低，辛酸濃度為0.2%時(shí)抗體效價(jià)為1：64。結(jié)果表明1.4%的泊洛沙姆濃度和0.2%的辛酸濃度是最合適的。

3 討論

脂類約占卵黃總量的90%，大量脂類的存在導(dǎo)致卵黃粘稠度很高，未經(jīng)去脂的高免卵黃液，容易堵塞注器，注射到動物體內(nèi)吸收慢，在注射部位易滯留而影響肉的品質(zhì)，并有醫(yī)源性感染的危險(xiǎn)。為避免上述缺點(diǎn)，泊洛沙姆可以使卵黃脂類迅速沉淀，提取的抗體液澄清，抗體效價(jià)降低較少，可以提高卵黃脂類的分離

速度，簡化工藝流程。其缺點(diǎn)是價(jià)格相對稍貴；泊洛沙姆是無毒無害的藥用輔料，所以本試驗(yàn)最終確定由更為安全的泊洛沙姆代替PEG-6000作為脂肪沉淀劑。

4 結(jié)論

采用泊洛沙姆法卵黃抗體的脫脂方法，可獲得穩(wěn)定效價(jià)、穩(wěn)定性狀的脫脂抗體液。綜合比較，濃度1.2%的泊洛沙姆抗體效價(jià)結(jié)果最佳，抗體損失量少，制備工藝簡單，更適合于工業(yè)進(jìn)一步擴(kuò)大生產(chǎn)研究。

[1] 閔嗣璠，李彬，萬思平，等.PEG6000用于卵黃抗體提取條件初探[J].食品科學(xué)，2007，（2）：8.

[2] 徐錫殿，臧福學(xué).泊洛沙姆對雞卵黃脫脂作用的研究[J].山東家雞，2004，（2）：10-11.

張桂榮（1962—），女，吉林省公主嶺市人，副教授，碩士，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)方向。

此篇文章是教育廳2012年項(xiàng)目論文 論文項(xiàng)目基金編號：吉教科合字[201]