孟 振, 胡 鵬, 劉新富, 賈玉東, 劉 濱, 鮑 鷹, 張和森

(1.青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所, 山東 青島266071; 2.中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 3.青島通用水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司, 山東 青島 266404)

海洋橈足類種類多、分布范圍廣、群體數(shù)量大,在海洋食物鏈中, 是構(gòu)成海水魚類仔稚魚餌料生物的主要組成部分[1-3]。人工育苗實(shí)驗(yàn)中, 無(wú)論使用野外拖網(wǎng)采集的包含大量橈足類的浮游動(dòng)物還是使用人工培養(yǎng)的橈足類, 都獲得較好的生長(zhǎng)效果和較高的成活率[4-8]。尤為重要的是, 橈足類每個(gè)種類的生活史含有12個(gè)不同規(guī)格的發(fā)育階段, 提供了較寬規(guī)格幅度的生物餌料[3-6], 而且營(yíng)養(yǎng)豐富, 特別是不飽和脂肪酸含量高, 彌補(bǔ)了現(xiàn)行的海水魚類生物餌料體系(微藻-輪蟲-鹵蟲無(wú)節(jié)幼體)個(gè)體大小范圍有限和營(yíng)養(yǎng)供給不足的缺陷, 可以成功應(yīng)用于培育輪蟲和鹵蟲無(wú)法飼養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)魚類, 如小口裂的石斑魚類[9]和大口裂的金槍魚[10]等。因此, 篩選合適的橈足類品種進(jìn)行人工培養(yǎng), 并探討其對(duì)海水魚類早期發(fā)育階段的餌料價(jià)值和投喂效果, 對(duì)于解決許多名貴魚類的苗種培育難題、提高海水魚類人工培育苗種的質(zhì)量和成活率都具有極為重要的意義。

短角異劍水蚤(Apocyclops royi)是一種廣泛分布的海洋近岸小型橈足類[11], 是臺(tái)灣培育石斑魚苗常用的橈足類品種[12], 對(duì)其生理生態(tài)[13-14]的研究, 表明該品種是適于人工培養(yǎng)的小型餌料橈足類之一,但國(guó)內(nèi)對(duì)該品種的人工培育研究尚處于起步階段[15],也未見(jiàn)應(yīng)用于海水魚類育苗的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在收集、分離和純化培養(yǎng)短角異劍水蚤的基礎(chǔ)上[16], 以重要的海水觀賞魚——克氏雙鋸魚(Amphiprion clarkii,俗稱紅雙帶小丑魚)稚魚為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 研究了短角異劍水蚤對(duì)其生長(zhǎng)、成活和脂肪酸組成的影響, 以驗(yàn)證短角異劍水蚤的餌料價(jià)值和投喂效果。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

短角異劍水蚤于2011年4月取自江蘇省贛榆市一輪蟲養(yǎng)殖池, 取回后置于150 L PVC水槽中暫養(yǎng),分離、純化后以濃縮海水小球藻為餌料培養(yǎng)1個(gè)月。隨后轉(zhuǎn)移至 3 m3的露天水泥池中充氣培養(yǎng), 每日投喂20 mL濃縮海水小球藻, 換水量0.5 m3/d。實(shí)驗(yàn)時(shí),以350目篩絹過(guò)濾收集, 計(jì)數(shù)、消毒后投喂。

克氏雙鋸魚(Amphiprion clarkii)親魚由青島絢海水族科技有限公司人工培育、光溫調(diào)控性腺成熟[17]。

褶皺臂尾輪蟲(Brachionus plicatilis)由青島通用水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司提供, 在室內(nèi) PVC水槽中充氣培養(yǎng), 投喂仔稚魚前用濃縮小球藻強(qiáng)化 24 h, 過(guò)濾收集, 消毒后定量投喂。濃縮海水小球藻(Chlorellasp.)、鹵蟲(Artemiasp.)卵均購(gòu)自青島越洋進(jìn)出口有限公司, 鹵蟲卵經(jīng)孵化、去殼、小球藻營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化、消毒后定量投喂。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 克氏雙鋸魚受精卵孵化及初孵仔魚收集

受精卵在原水槽中孵化, 孵化水溫 26℃±1℃,pH值 7.8, 鹽度 30, 微充氣, 溶解氧高于 5.6 mg/L,光照強(qiáng)度1 000 lx, 光照周期L∶D=14 h∶10 h。待全部仔魚孵出2 h內(nèi), 根據(jù)初孵仔魚的趨光性, 光誘導(dǎo)聚集, 采收后將初孵仔魚平均分到 2個(gè) 50 L的PVC水槽中進(jìn)行投喂實(shí)驗(yàn)。采用不同批次受精卵重復(fù)實(shí)驗(yàn)一次。

1.2.2 克氏雙鋸魚仔稚魚投喂實(shí)驗(yàn)

2批次仔稚魚培育水質(zhì)條件同上, 每天吸底并換水2次, 10 d前每次換水量25%, 10~20 d換水量50%,同時(shí)統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組死魚數(shù)目。從孵化后1~7 d投喂褶皺臂尾輪蟲, 日投喂2次, 投喂量10個(gè)/mL, 同時(shí)添加海水小球藻以調(diào)控水質(zhì)顏色。從5 d至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(20 d)分別投喂鹵蟲無(wú)節(jié)幼體(A1/A2組)和橈足類(C1/C2組)。A1/A2、C1/C2組鹵蟲無(wú)節(jié)幼體和橈足類投喂密度均為5個(gè)/mL, 日投喂2次。

1.2.3 鹵蟲無(wú)節(jié)幼體、橈足類和克氏雙鋸魚稚魚脂肪酸的測(cè)定

1.2.3.1 樣品采集

鹵蟲無(wú)節(jié)幼體、橈足類: 鹵蟲無(wú)節(jié)幼體孵化8 h后, 投喂?jié)饪s海水小球藻營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化10 h, 饑餓12 h,分離卵殼, 經(jīng)200目篩絹用蒸餾水沖洗過(guò)濾。橈足類以200目篩網(wǎng)收集轉(zhuǎn)入新鮮海水中, 饑餓12 h清空消化道內(nèi)的單胞藻, 篩濾掉排出的廢物, 用蒸餾水沖洗。樣品冷凍干燥24 h。

克氏雙鋸魚稚魚: 取20 d稚魚20條, 轉(zhuǎn)入新鮮海水, 饑餓24 h清空消化道內(nèi)餌料, 用蒸餾水沖洗,樣品冷凍干燥24 h。

1.2.3.2 樣品處理

樣品處理方法參考劉光興等[18], 取凍干樣品30 mg,加入1 mol/L KOH-甲醇3 mL, 在80℃水浴鍋中皂化10 min, 加入2 mol/L HCl-甲醇溶液3 mL, 在80℃水浴鍋中酯化反應(yīng)10 min; 加入正己烷1 mL, 振蕩萃取, 靜止分層, 吸取上清液約 1 mL放入離心管中,低速離心5 min, 取1 μL進(jìn)樣測(cè)定。

1.2.3.3 脂肪酸測(cè)定

使用美國(guó)安捷倫公司7890A氣相色譜儀分析測(cè)定脂肪酸的含量, 用面積歸一法計(jì)算各種脂肪酸占總脂肪酸的百分含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

其中Lt為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)稚魚體長(zhǎng)(mm),L0為實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)初孵仔魚體長(zhǎng)(mm),t為實(shí)驗(yàn)時(shí)間(d)。

采用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 短角異劍水蚤和鹵蟲無(wú)節(jié)幼體脂肪酸組成分析

短角異劍水蚤與鹵蟲無(wú)節(jié)幼體脂肪酸組成的分析見(jiàn)表1, 幾種對(duì)海水魚類仔稚魚具有重要營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的必需脂肪酸(EFA, 即n-3、n-6系列高不飽和脂肪酸 HUFA)中, 濃縮海水小球藻營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化的鹵蟲無(wú)節(jié)幼體未檢出 DHA(22: 6n-3), 其 EPA(20: 5n-3)、ARA(20: 4n-6)和EFA也分別僅占其總脂肪酸含量的1.408%、1.090%和3.801%, 而短角異劍水蚤DHA、EPA和ARA含量分別達(dá)21.185%、11.088%和3.250%,EFA含量為37.417%, 極顯著高于鹵蟲無(wú)節(jié)幼體。橈足類DHA/EPA和EPA/ARA分別為1.911和3.412,鹵蟲無(wú)節(jié)幼體EPA/ARA為1.292。

2.2 短角異劍水蚤和鹵蟲無(wú)節(jié)幼體投喂對(duì)克氏雙鋸魚稚魚成活和生長(zhǎng)的影響

5~20日齡, 投喂短角異劍水蚤的克氏雙鋸魚稚魚成活率(80.71%±8.23%)稍高于鹵蟲無(wú)節(jié)幼體組(76.30%±7.00%)(表2), 但兩者差異不顯著。短角異劍水蚤投喂組克氏雙鋸魚稚魚生長(zhǎng)速度顯著高于鹵蟲無(wú)節(jié)幼體組, 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體長(zhǎng)極顯著高于后者(P<0.01),體重和特定生長(zhǎng)率均顯著高于后者(P<0.05)。

2.3 克氏雙鋸魚稚魚脂肪酸組成的分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(20 d), 投喂短角異劍水蚤的克氏雙鋸魚稚魚DHA、EPA、ARA和EFA含量均高于鹵蟲無(wú)節(jié)幼體投喂組(表1), 且2個(gè)實(shí)驗(yàn)組的不飽和脂肪酸組成基本與餌料生物相對(duì)應(yīng)。

表1 短角異劍水蚤、鹵蟲無(wú)節(jié)幼體及實(shí)驗(yàn)克氏雙鋸魚稚魚脂肪酸含量的測(cè)定Tab.1 Fatty acids composition of Apocyclops royi, Artemia nauplii and juveniles of Amphiprion clarkii

表2 短角異劍水蚤和鹵蟲無(wú)節(jié)幼體對(duì)克氏雙鋸魚稚魚成活和生長(zhǎng)的影響Tab.2 The survival and growth rate of Amphiprion clarkii juveniles fed with Apocyclops royi and Artemia nauplii respectively

3 討論

生物餌料的開(kāi)發(fā)和利用是海水魚類苗種人工培育的關(guān)鍵技術(shù)。長(zhǎng)期以來(lái), 海水魚類苗種培育主要依賴于輪蟲和鹵蟲無(wú)節(jié)幼體作為生物餌料, 在多種魚類苗種人工培育中取得了成效, 但由于二者個(gè)體大小范圍有限、營(yíng)養(yǎng)成分不穩(wěn)定、缺乏高度不飽和脂肪酸等原因, 并非對(duì)所有經(jīng)濟(jì)魚類都適用。橈足類作為海水魚類仔稚魚天然的餌料生物, 將其開(kāi)發(fā)為生物餌料一直是海水魚類苗種培育的研究熱點(diǎn)之一。已有研究證實(shí), 在使用輪蟲作為海水魚類仔魚開(kāi)口餌料的階段結(jié)束之后, 使用橈足類替代鹵蟲無(wú)節(jié)幼體[2,19], 或是兩者同時(shí)投喂都取得了較為滿意的效果[2,20]。本實(shí)驗(yàn)中, 以輪蟲作為克氏雙鋸魚仔魚的開(kāi)口餌料, 稚魚期單獨(dú)投喂短角異劍水蚤的實(shí)驗(yàn)組稚魚的成活率稍高于投喂鹵蟲無(wú)節(jié)幼體的實(shí)驗(yàn)組, 生長(zhǎng)狀態(tài)則顯著優(yōu)于后者, 與上述學(xué)者的研究結(jié)果相一致, 初步表明短角異劍水蚤作為海水魚類仔稚魚的生物餌料優(yōu)于鹵蟲無(wú)節(jié)幼體。本實(shí)驗(yàn)中 2個(gè)實(shí)驗(yàn)組克氏雙鋸魚稚魚成活率均高于 75%, 與克氏雙鋸魚苗種培育階段死亡高峰出現(xiàn)在仔魚期(孵化后 2~3日齡)有關(guān)[17]。

評(píng)價(jià)生物餌料優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)除適口性(餌料大小)和運(yùn)動(dòng)能力外, 主要考慮其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值(如脂肪酸、蛋白質(zhì)和自由氨基酸), 其中尤以多不飽和脂肪酸(PUFA)含量和組成為主要參數(shù), 特別是 DHA、EPA和 ARA等海水仔稚魚必需的高不飽和脂肪酸(HUFA)[21]。餌料中HUFA的數(shù)量和種類, 會(huì)直接影響海水仔稚魚的生長(zhǎng)速度、成活率、應(yīng)激能力和體內(nèi)相關(guān)成分的組成[22]。輪蟲和鹵蟲作為傳統(tǒng)生物餌料, 其體內(nèi)缺乏海水魚類仔稚魚必需的HUFA, 需要富集餌料中 HUFA以滿足海水魚類仔稚魚的營(yíng)養(yǎng)需求。本實(shí)驗(yàn)中, 經(jīng)海水小球藻強(qiáng)化的鹵蟲無(wú)節(jié)幼體仍未檢出 DHA, 小球藻強(qiáng)化對(duì)鹵蟲無(wú)節(jié)幼體必需脂肪酸的組成和含量沒(méi)有顯著效果, 與黃旭雄等[23]所得結(jié)論一致。而僅使用海水小球藻強(qiáng)化的短角異劍水蚤DHA、EPA、ARA和n-3HUFA含量均較高, 暗示短角異劍水蚤可能具有自身合成 HUFA的能力, 這需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證, 但就必需脂肪酸種類和含量而言, 短角異劍水蚤營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高于鹵蟲無(wú)節(jié)幼體。

必需脂肪酸的比例也是衡量生物餌料脂肪酸品質(zhì)的重要指標(biāo), 由于 PUFA在代謝方面存在競(jìng)爭(zhēng)作用, 主要是DHA和EPA與ARA的競(jìng)爭(zhēng), 這3種重要的 HUFA的比例會(huì)直接影響海水仔稚魚視網(wǎng)膜和腦的發(fā)育[24]。張其永等[25]研究鲆鰈類有眼側(cè)色素沉積與 DHA、EPA和 ARA 的比例失調(diào)有關(guān), 導(dǎo)致視網(wǎng)膜和腦不能正常發(fā)育, 嚴(yán)重影響視力; Reitan等[26]用DHA/EPA為2/1的餌料培育大菱鲆仔稚魚, 有效地防止了大菱鲆白化的產(chǎn)生; McEvoy等[27]報(bào)道, 對(duì)大菱鲆和大西洋庸鰈而言, 餌料中DHA含量占總脂肪酸的6.5%~12.5%, 用EPA/ARA為4.2/1和20/1的乳化油強(qiáng)化活餌料, 仔稚魚表現(xiàn)出正常的生長(zhǎng)、成活率、色素和變態(tài), 然而用EPA/ARA為1.5/1和0.5/1的乳化油強(qiáng)化活餌料, 仔稚魚的色素和變態(tài)均不正常。此外, 多數(shù)海水魚魚卵和仔稚魚體內(nèi), DHA/EPA的含量均為2/1左右, 而不同魚類對(duì)ARA需求不同,歐洲鱸的 EPA/ARA的適宜值為 1/1, 大菱鲆和大西洋庸鰈的EPA/ARA的適宜比例為10∶1以上。本實(shí)驗(yàn)中短角異劍水蚤DHA/EPA為1.911, EPA/ARA為3.159, 均優(yōu)于小球藻強(qiáng)化的鹵蟲無(wú)節(jié)幼體, 從必需脂肪酸比例分析短角異劍水蚤也更適于作為海水魚類仔稚魚的生物餌料加以開(kāi)發(fā)利用。

本文通過(guò)分析短角異劍水蚤和鹵蟲無(wú)節(jié)幼體的脂肪酸組成及2種生物餌料對(duì)克氏雙鋸魚稚魚存活、生長(zhǎng)和脂肪酸組成的影響表明, 短角異劍水蚤HUFA、DHA、EPA、ARA 含量高, DHA/EPA、EPA/ARA比值與海水魚類仔稚魚必需脂肪酸比例需求類似, 橈足類投喂組表現(xiàn)出較高的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和成活率, 優(yōu)于傳統(tǒng)的生物餌料。綜上所述, 短角異劍水蚤適于作為海水魚類仔稚魚的生物餌料, 在苗種培育產(chǎn)業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

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