楊春治(中國政法大學(xué)比較法學(xué)研究院比較法學(xué)研究所，北京 00088;福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)在臨床上主要表現(xiàn)為鼻塞、鼻癢、噴嚏頻繁、常有大量清水樣鼻涕等特征，長期慢性AR還會(huì)引起頭痛、嗅覺減退等癥狀。目前，AR的治療主要可分為六大方法，即避免與變應(yīng)原接觸、藥物治療、免疫治療、物理化學(xué)治療、手術(shù)治療和中醫(yī)治療。其中，藥物治療由于應(yīng)用簡便、效果明顯而成為治療AR的首選方法，主要包括抗組胺藥物、肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑、減充血?jiǎng)?、白三烯受體阻滯劑、糖皮質(zhì)激素等。但由于大部分藥物有一定程度的毒副作用而不能長期使用，如抗組胺藥物都有不同程度的中樞抑制作用，長期全身使用糖皮質(zhì)激素會(huì)產(chǎn)生毒性［1-3］。

雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide，TP)是從衛(wèi)矛科植物雷公藤中分離出的活性最高的環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化合物，具有較強(qiáng)的抗炎及免疫抑制活性，臨床上廣泛用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性腎炎、肝炎、各類腫瘤、血小板減少性紫癜和各種皮膚病，毒副作用極小［4-7］。AR發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，目前尚未闡明，因此，研究AR發(fā)病過程中TLR2-NF-κB信號通路對深入研究AR發(fā)病機(jī)制具有一定的指導(dǎo)意義。同時(shí)，對AR的藥物干預(yù)治療或免疫抑制治療提供一種新的思路。本課題擬采用TLR2的激動(dòng)劑肽聚糖(PTG)以及NF-κB的抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸(PDTC)首先研究大鼠AR發(fā)病過程中TLR2-NF-κB信號通路各細(xì)胞因子的變化，確認(rèn)AR發(fā)病過程中TLR2-NF-κB信號通路是髓樣分化因子(MyD88)依賴性信號通路還是MyD88非依賴性信號通路。確定TLR2-NF-κB信號通路類型之后再采用TP進(jìn)行干預(yù)，觀察TP對AR發(fā)病過程中TLR2-NF-κB信號通路的影響，并初步探討AR發(fā)病機(jī)制和TP可能存在的藥用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

雷公藤內(nèi)酯醇(上海經(jīng)科化學(xué));PTG，PDTC，OVA(Sigma公司，USA);兔抗大鼠 β-actin單抗(Abcam，UK);兔抗大鼠 TLR2、IFN-β、NF-κB、IκB、IgE、MyD88、IRAK-1、TRAF-6、IL-1、IL-6、TNF-β 多抗(Abcam，UK);RIPA裂解液(碧云天);檸檬酸抗原修復(fù)液、EliVision Super檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒(福州邁新生物公司);ECL發(fā)光液、顯影液、定影液(廈門泰京生物公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康SD雄性大鼠60只，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證編號:SCXK(閩)2012-0001，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號:0000012。隨機(jī)分為五組(n=12):對照組、模型組、TP組、PTG組和PDTC組。模型組:①基礎(chǔ)致敏:用0.3 mg卵清白蛋白(OVA)加30 mg Al(OH)3混于1 ml生理鹽水中，行腹腔注射，隔日1次，連續(xù)7次;②強(qiáng)化致敏:基礎(chǔ)致敏結(jié)束后向每只大鼠霧化吸入2 ml濃度為2.5 μg/ml的OVA，每日1次，連續(xù)5 d;③激發(fā):間隔3 d后向大鼠每側(cè)鼻孔滴入10%OVA 50 μl，每日1次，連續(xù)7 d。PTG組:腹腔基礎(chǔ)致敏后，在局部OVA噴鼻激發(fā)過敏狀態(tài)同時(shí)采用50 μg/ml PTG滴鼻，每日1次，連續(xù)7 d;PDTC組:基礎(chǔ)致敏前1 d腹腔注射120 mg/kg PDTC，每日1次，連續(xù)7 d;TP組:基礎(chǔ)致敏前1 d腹腔注射30 mg/kg TP，每日1次，連續(xù)7 d。PDTC組和TP組不注射PTG。

1.3 大鼠變應(yīng)性鼻炎模型的評價(jià)

從初次滴鼻激發(fā)開始，觀察大鼠抓鼻、打噴嚏及流涕情況。經(jīng)OVA滴鼻10 min后，單獨(dú)觀察30 min并進(jìn)行疊加得分評價(jià)動(dòng)物模型(見表1)，得分超過5分表示造模成功［8］。分別對抓鼻和打噴嚏次數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)資料統(tǒng)計(jì)。

表1 大鼠變應(yīng)性鼻炎模型建立后癥狀積分評估Table 1 Assessment of symptom score after establishment of AR model in rat

1.4 Western blot檢測大鼠鼻黏膜組織中 TLR2-NF-κB信號通路相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)

按凱基組織蛋白提取試劑盒說明書操作步驟提取大鼠鼻黏膜組織中的蛋白，并調(diào)整濃度為20 mg/ml。樣品與上樣緩沖液混合后100℃加熱5 min變性，然后取樣品處理液進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h。洗膜后將封閉后的PVDF膜與一抗(TLR2、IFN-β、NF-κB、IκB、IgE、MyD88、IRAK-1、TRAF-6、IL-1、IL-6、TNF-β，各一抗?jié)舛劝凑f明書配制)4℃孵育過夜。洗膜后在室溫條件下與二抗孵育1 h，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(1∶5 000)。洗膜后加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)，顯影、洗片、晾干。用凝膠圖像分析儀掃描照片，并采用灰度分析計(jì)算各蛋白條帶的灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。所有的數(shù)據(jù)表示為±s，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠變應(yīng)性鼻炎模型的建立及TP的干預(yù)作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠打噴嚏次數(shù)和抓鼻次數(shù)明顯多于對照組，且在一周內(nèi)總體隨時(shí)間延長大鼠打噴嚏次數(shù)和抓鼻次數(shù)增多(見表2，表3)，說明大鼠變應(yīng)性鼻炎模型建立成功。從第3天開始，TP組大鼠打噴嚏次數(shù)和抓鼻次數(shù)雖然明顯高于空白組，但卻明顯低于模型組。

2.2 Western blot檢測大鼠 TLR2-NF-κB 信號通路

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠鼻黏膜組織中 TLR2、MyD88、IRAK-1、TRAF-6、NF-κB、IκB、IL-1、IL-6、TNF-β和IgE的蛋白表達(dá)水平都明顯高于空白組(見圖1，表4)。PTG組中除IFN-β以外，以上其他細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)水平都高于模型組。PDTC組中除IFN-β以外，以上其他細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)水平都明顯低于PTG組;NF-κB、IκB、IL-1、IL-6、TNF-β和 IgE表達(dá)水平明顯低于模型組，但TLR2、MyD88、IRAK-1、TRAF-6 的蛋白水平與模型組無明顯差異。

表2 大鼠打噴嚏次數(shù)的變化及TP的干預(yù)作用Table 2 The changes of sneezing times after the intervention of triptolide

表3 大鼠抓鼻次數(shù)的變化及TP的干預(yù)作用Table 3 The changes of catching nose times after intervention of triptolide

圖1 Western blot檢測大鼠鼻黏膜組織中的TLR2-NF-κB信號通路Figure 1 Expression of cytokines in TLR2-NF-κB signaling pathway in rat nasal mucosa by Western blot

表4 大鼠鼻黏膜組織中的TLR2-NF-κB信號通路相關(guān)細(xì)胞因子的蛋白相對表達(dá)量Table 4 Relative expression levels of cytokines in TLR2-NF-κB signaling pathway in rat nasal mucosa

2.3 Western blot檢測TP對大鼠鼻黏膜信號通路的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠鼻黏膜組織中 TLR2、MyD88、IRAK-1、TRAF-6、NF-κB、IκB、IL-1、IL-6、TNF-β和IgE的蛋白表達(dá)水平都明顯高于空白組。TP組中以上細(xì)胞因子的表達(dá)水平都明顯低于模型組。除 IRAK-1、NF-κB、IL-1、IL-6、IgE 以外，其余細(xì)胞因子的表達(dá)水平與對照組無顯著差異(見圖2，表5)。

圖2 Western blot檢測雷公藤內(nèi)酯醇對大鼠鼻黏膜組織中TLR2-NF-κB信號通路的影響Figure 2 The effect of triptolide on expression of cytokines in TLR2-NF-κB signaling pathway in rat nasal mucosa by Western blot

表5 雷公藤內(nèi)酯醇對大鼠鼻黏膜組織中TLR2-NF-κB信號通路的影響Table 5 The effect of triptolide on expression of cytokines in TLR2-NF-κB signaling pathway in rat nasal mucosa

3 討論

TLRs介導(dǎo)的信號通路研究主要集中于TLR2和TLR4，該信號通路可分為髓樣分化因子88(myeloid differentiation marker 88，MyD88)依賴性和非依賴性通路，其中以MyD88依賴性通路為主［9-11］。當(dāng)機(jī)體受到外源分子刺激時(shí)，MyD88先與TLRs和Toll/IL-1受體同源性區(qū)域(TIR)相結(jié)合，促使IL-1受體相關(guān)激酶4(IRAK-4)磷酸化，IRAK-4磷酸化后激活I(lǐng)RAK-1，隨后激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)基因6(TRAF-6)，進(jìn)一步活化轉(zhuǎn)化生長因子 β激酶(TAK1)，活化后的 TAK1會(huì)促使 κB激酶 β 磷酸化，最終激活 NF-κB，誘導(dǎo)炎性因子(IL-1、IL-6、TNF-β、IgE 等)的表達(dá)［12，13］，AR 發(fā)病過程中假設(shè)的TLR2-NF-κB信號通路見圖3。

Fransson等發(fā)現(xiàn)，AR患者接觸過敏原后TLR2、TLR3、TLR4 等 Toll樣受體的表達(dá)量明顯增加［14］。大量研究表明TLR2對變應(yīng)性反應(yīng)有促進(jìn)作用［15，16］。目前關(guān)于AR發(fā)病過程中的信號通路研究較少，目前的研究主要集中在TLRs介導(dǎo)的MyD88依賴性信號通路為主。為了研究TLRs介導(dǎo)的信號通路在AR發(fā)病過程中作用，本研究采用建立動(dòng)物模型、使用信號通路激動(dòng)劑和阻斷劑的方法研究TLR2在大鼠AR發(fā)病過程中的作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TP組大鼠打噴嚏次數(shù)和抓鼻次數(shù)雖然明顯高于空白組，但卻明顯低于模型組。且模型組大鼠鼻黏膜組織中 TLR2、MyD88、IRAK-1、TRAF-6、NF-κB、IκB、IL-1、IL-6、TNF-β和IgE的蛋白表達(dá)水平都明顯高于空白組，說明大鼠變應(yīng)性鼻炎模型建立成功。模型組、PTG組、PDTC組和空白組TNF-β的表達(dá)水平都無明顯差異，說明PTG和PDTC對TNF-β的表達(dá)未造成影響。MyD88非依賴性信號通路中機(jī)體對病原體感染產(chǎn)生相應(yīng)的有效應(yīng)答，借助Toll樣受體相關(guān)分子(TRAM)與Toll樣受體相關(guān)的干擾素活化因子(TRIF)鏈接，誘導(dǎo)TNF-α/β表達(dá)。因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測，TLR2介導(dǎo)的TLR2-NF-κB信號通路是MyD88依賴性信號通路，而非MyD88非依賴性信號通路。

圖3 AR發(fā)病過程中TLR2-NF-κB信號通路假設(shè)圖Figure 3 The hypothesis of TLR2-NF-κB signaling pathway in pathogenesis of AR

PTG組中除TNF-β以外，其他細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)水平都高于模型組。PDTC組中除TNF-β以外，其他細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)水平都明顯低于PTG組，NF-κB、IκB、IL-1、IL-6、TNF-β 和 IgE 表達(dá)水平低于模型組，但 TLR2、MyD88、IRAK-1、TRAF-6 的蛋白水平與模型組無明顯差異。說明TLR2在TLR-2-NF-κB 信號通路上游，NF-κB 在 TLR-2-NF-κB 信號通路中游。TP對大鼠變應(yīng)性鼻炎的干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TP不僅可以減緩大鼠變應(yīng)性鼻炎癥狀，還可抑制TLR-2-NF-κB信號通路中除TNF-β以外的其他細(xì)胞因子的表達(dá)。

因此，本研究提出 TLR2介導(dǎo)的 TLR-2-NF-κB信號通路為MyD88依賴性信號通路:即大鼠鼻黏膜受過敏原刺激后激活TLR2，隨之與MyD88結(jié)合，促使IRAK-4磷酸化，磷酸化的IRAK-4激活I(lǐng)RAK-1，進(jìn)一步激活 TRAF-6。接著 NF-κB被激活，與 IκB結(jié)合后激活炎癥相關(guān)因子 IL-1、IL-6、TNF-β、IgE 的表達(dá)，從而引發(fā)變應(yīng)性鼻炎。而雷公藤內(nèi)酯醇通過抑制 TLR2與 MyD88的結(jié)合來抑制 TLR-2-NF-κB信號通路，從而起到減輕變應(yīng)性鼻炎的作用，為治療變應(yīng)性鼻炎新藥開發(fā)提供參考。

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