鄧 勛，宋小雙，尹大川，崔文峰，宋瑞清

(1．黑龍江省森林保護(hù)研究所，哈爾濱150040;2．沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，沈陽110000;3．黑龍江省林業(yè)科學(xué)院，哈爾濱150040;4．東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱150040)

樟子松(Pinus sylvestris var．mongolica)是我國北方主要造林樹種，在生態(tài)建設(shè)、環(huán)境修復(fù)方面發(fā)揮重要作用［1］，我國鹽漬土主要分布在華北、東北和濱海地區(qū)，造成森林和草原退化。培育耐鹽樹種或者通過人為引進(jìn)植物根際有益微生物(包括內(nèi)生真菌、菌根菌、促生細(xì)菌等)與宿主植物的互作實(shí)現(xiàn)促進(jìn)苗木生長、增強(qiáng)苗木抗逆性，并以“菌化苗”形式在后續(xù)逆境造林中提高苗木成活率，是實(shí)現(xiàn)鹽堿地改造、恢復(fù)植被和改善生態(tài)的有效途徑。

深色有隔內(nèi)生真菌(Dark Septate Endophytes，DSE)是植物內(nèi)生真菌的主要類群，是植物根部的內(nèi)生菌［2］，從沿海灘涂到內(nèi)陸高原山地;從熱帶、溫帶到凍原地區(qū)及南北極地區(qū)均有DSE的分布［3］。在針葉樹中深色有隔內(nèi)生真菌種類以子囊菌(Ascomycetes)中 的 Phialocephala fortinii s．l．—Acephala applanata species complex(PAC)類群集合為主［4］，在針葉樹的根系中占據(jù)主導(dǎo)地位［5］。研究表明，DSE真菌可提高植物抗逆性，包括可提高植物對(duì)干旱［6］以及重金屬污染［7-9］等逆境脅迫的抗性、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，抵御病原菌生物脅迫［10-12］等。

D575是分離自樟子松根部的深色有隔內(nèi)生真菌，在離體試驗(yàn)中［13-14］，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽性，在 CNaCl≤0．4 mol/Lm 和 C Na2SO4≤0．2 mol/Lm的低中濃度鹽脅迫條件下，D575菌絲生長和對(duì)碳、磷相對(duì)利用率受抑制程度均較低，生長速率同對(duì)照相比相差不大，本文在離體研究基礎(chǔ)上，測定內(nèi)生真菌-樟子松共生體在鹽脅迫條件下的生長及生理相應(yīng)，探討鹽脅迫條件下，D575對(duì)樟子松生長及耐鹽性的影響。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)菌株:深色有隔內(nèi)生真菌D575分離自樟子松根部，經(jīng)菌落形態(tài)和16S rDNA序列測定初步鑒定為Phialocephala fortinii，屬于Phialocephala fortinii s．l．—Acephala applanata species complex(PAC)，為典型的針葉樹種根部深色有隔內(nèi)生真菌，保存于黑龍江省林業(yè)科學(xué)院森林保護(hù)研究所。

樟子松種子來源:2014年購自遼寧彰武章古臺(tái)樟子松苗木繁育基地，由遼寧省防風(fēng)固沙研究所提供，保存于-20℃冰箱備用。

1．2 樟子松育苗與菌劑制備

(1)無菌制備方法。將草炭土、蛭石和河沙按體積比2∶1∶1的比例配制混合土，置高溫高壓滅菌器中121℃下滅菌2 h，放置7 d后裝入營養(yǎng)缽(直徑15 cm×高13 cm)中備用。

(2)種植處理及播種方法。種子處理及播種參考尹大川［15］方法進(jìn)行，將經(jīng)催芽的樟子松種子播入營養(yǎng)缽中，每缽30顆種子，上覆2 cm厚無菌土，澆透水后放入大棚中培養(yǎng)，待幼苗出土后，定苗至每缽20株。進(jìn)行常規(guī)的日常管護(hù)，每2 d澆一次水(100 ml/缽)。

(3)菌劑制備方法。用直徑5 mm的無菌打孔器，切取在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的內(nèi)生真菌D575接種于盛有250 mL PD液體培養(yǎng)基的三角瓶(500 mL)中，每瓶接種3片。置于搖床上(25℃、150 r/min)振蕩培養(yǎng)10 d，得到液體菌劑，使用前用攪碎機(jī)將菌絲體攪碎做勻漿處理。

1．3 接種及鹽脅迫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1)接種處理。在播種出苗1個(gè)月后，進(jìn)行深色有隔內(nèi)生真菌的接種處理，設(shè)置2種處理方式:處理1:接種深色有隔內(nèi)生真菌D575(D575);處理2:PD培養(yǎng)基空白對(duì)照(CK)。采用液體菌劑，在苗木根際打孔，接種液體菌劑，每缽接種100 ml菌劑，每組處理25盆，共50盆。

(2)鹽脅迫處理設(shè)計(jì)。參考張峰峰［16］的方法，接種 D575菌劑 1個(gè)月后，在 0．1、0．2 mol/Lm NaCl，0．1、0．2 mol/Lm Na2SO4，4 種不同的鹽溶度水平下進(jìn)行鹽脅迫實(shí)驗(yàn)，以不施鹽為對(duì)照。每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，共50盆(2個(gè)接種處理×5個(gè)鹽脅迫處理×5個(gè)重復(fù))盆苗木。結(jié)合澆Hoagland營養(yǎng)液，每次每盆澆溶液200 ml，每天澆一次，共澆5次，使達(dá)到預(yù)計(jì)濃度，置于大棚中培養(yǎng)。

1．4 取樣及相關(guān)指標(biāo)測定

在接種3個(gè)月后，每處理隨機(jī)挖取30株樟子松苗木，進(jìn)行苗木生長指標(biāo)測定、菌根合成率調(diào)查，生理指標(biāo)測定、抗氧化酶活性測定、抗病害保護(hù)酶活性測定。每個(gè)處理3次重復(fù)。

(1)生長指標(biāo)。對(duì)于苗高和地徑測定，采用直尺和游標(biāo)卡尺分別測量，苗木取樣后，用刷子小心清理掉根際泥土，用電子天平測定苗木鮮重后，在鼓風(fēng)干燥箱中85℃烘干后稱量苗木的干重。

(2)內(nèi)生菌侵染率。將根尖剪成1 cm長根段，用Phillips＆Hayman的染色方法［17］對(duì)根段染色，計(jì)算菌根侵染率。菌根菌侵染率(%)=外生菌根菌侵染的根段數(shù)/檢查的總根段數(shù)×100%，所得結(jié)果取平均值。

(3)抗逆生理指標(biāo)。

可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)G250法測定［18］。

葉綠素與類胡蘿卜素含量測定采用丙酮-乙醇混合液法測定［19］。

抗氧化酶(SOD酶、POD酶、CAT酶)活性采用南京建成生物工程公司的抗氧化檢測試劑盒利用光度計(jì)法進(jìn)行酶活測定［20］。

丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法［21］測定。

游離脯氨酸采用酸性茚三酮比色法［22］測定。

1．5 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用SPSS 13．0進(jìn)行單因素差異顯著性分析(ANOVA)，α=0．05，并以平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同鹽分脅迫對(duì)樟子松苗木生物量的影響

(1)對(duì)苗高的影響。鹽脅迫和接種內(nèi)生真菌處理對(duì)樟子松苗高均有顯著影響(見表1)，同對(duì)照相比，在 NaCl(0．1 ～0．2 mol/Lm)和 Na2SO4(0．1 ～0．2 mol/Lm)脅迫下，未接種D575樟子松苗高降低6．57% ～17．31%，其中對(duì)照與 NaCl(0．12 mol/Lm)相比，苗高差異不顯著(P ＞0．05)，NaCl(0．2 mol/Lm)和 Na2SO4(0．1 ～0．2 mol/Lm)處理，未接種D575樟子松苗高之間差異不顯著(P＞0．05)，說明樟子松對(duì)低濃度NaCl脅迫有一定的耐受性，而高濃度NaCl和Na2SO4脅迫對(duì)樟子松苗木高成長有顯著影響。非鹽脅迫條件下，同對(duì)照相比，接種D575苗高增加7．49%，二者存在顯著性差異(P＜0．05)，同時(shí)接種D575可緩解鹽脅迫對(duì)樟子松苗木生長的抑制作用，在NaCl(0．1～0．2 mol/Lm)和Na2SO4(0．1～0．2 mol/Lm)脅迫下，同對(duì)照相比，苗高增加9．32% ～13．26%，鹽脅迫濃度越大，苗高增加越多，說明內(nèi)生真菌對(duì)樟子松促生作用越明顯。在接種D575條件下，低濃度鹽分脅迫(NaCl 0．1 mol/Lm、Na2SO40．1 mol/Lm)對(duì)樟子松苗高影響不顯著(P ＞0．05)。

(2)對(duì)地徑的影響:同苗高表現(xiàn)相同，不同鹽分脅迫和接種內(nèi)生真菌均對(duì)對(duì)樟子松苗木地徑均有顯著影響(見表1)，不同處理?xiàng)l件存在顯著性差異(P＜0．05)。非鹽脅迫條件下，接種D575同對(duì)照相比，樟子松苗木地徑提高7．61%，二者存在顯著性差異(P＜0．05)。在接種內(nèi)生真菌D575條件下，不同鹽分脅迫處理后，對(duì)照相比地徑增加6．09% ～10．34%。在接種 D575條件下，低濃度NaCl(0．1 mol/Lm)對(duì)樟子松地徑影響不顯著(P＞0．05)。

(3)對(duì)生物量的影響:不同鹽分脅迫和接種內(nèi)生真菌對(duì)樟子松苗木鮮重和干重均有顯著影響(見表1)，不同處理之間生物量存在顯著性差異(P＜0．05)。非鹽脅迫條件下，在接種內(nèi)生真菌D575后，同對(duì)照相比，對(duì)樟子松苗木鮮重和干重分別提高20．00%和19．81%，可明顯促進(jìn)生物量積累，增加抗逆性。鹽脅迫處理后，接種內(nèi)生真菌D575可促進(jìn)樟子松苗木鮮重增加7．40% ～14．28%，干重增加5．19% ～16．86%，結(jié)果表明，內(nèi)生真菌的存在可消除部分鹽脅迫的影響，增加宿主植物生物量的積累。

表1 鹽脅迫下深色有隔內(nèi)生真菌D575對(duì)樟子松生物量的影響Tab．1 The effect of endophyte fungi D575 on P．sylvestris var．Mongolica biomass under salt tolerance

2．2 不同鹽分脅迫對(duì)內(nèi)生菌侵染率的影響

鹽脅迫的存下降低內(nèi)生菌的侵染率(如圖1所示)，其中低濃度NaCl(0．1 mol/Lm)同對(duì)照相比，內(nèi)生菌侵染率不存在顯著性差異(P＞0．05)，而NaCl(0．2 mol/Lm)和 Na2SO4(0．1 ～0．2 mol/Lm)脅迫下，同對(duì)照相比，內(nèi)生菌侵染率存在顯著性差異(P＜0．05)，結(jié)果表明，不同濃度鹽分脅迫對(duì)內(nèi)生菌侵染效果的影響不同。

圖1 不同鹽脅迫對(duì)內(nèi)生菌侵染率的影響Fig．1 The infection rate of endophyte fungi D575 under different salt tolerance

2．3 不同鹽分脅迫對(duì)樟子松苗木生理指標(biāo)的影響

(1)對(duì)苗木葉綠素和可溶性蛋白的影響。研究結(jié)果表明，無論是否接種內(nèi)生真菌，鹽脅迫后宿主植物的葉綠素含量均有所降低(見表2)，接種內(nèi)生真菌后，同對(duì)照相比，可提高宿主植物葉綠素含量，從而提高植物的光和效率，生物量增加。非鹽脅迫條件下，接種內(nèi)生真菌對(duì)葉綠素a和b分別提高25．59%和36．12%。不同處理之間差異顯著(P＜0．05)。在 NaCl(0．1 ～ 0．2 mol/Lm)和 Na2SO4(0．1～0．2 mol/Lm)脅迫下，接種內(nèi)生真菌后，同對(duì)照相比，葉綠素a增加28．13% ～32．66%，葉綠素b增加28．36% ～37．19%，鹽分脅迫濃度越大，葉綠素增加越多，表明內(nèi)生真菌對(duì)宿主植物的促進(jìn)作用越高，提高植物耐鹽效應(yīng)越顯著。可溶性蛋白含量也是衡量益生菌對(duì)植物促生作用的指標(biāo)，非鹽脅迫條件下，同對(duì)照相比，宿主植物可溶性蛋白含量提高 21．01%，在 NaCl(0．1 ～0．2 mol/Lm)和 Na2SO4(0．1 ～0．2 mol/Lm)脅迫下，同對(duì)照相比，可溶性蛋白含量增加14．55% ～25．43%，接種內(nèi)生真菌后，NaCl(0．1～0．2 mol/Lm)和Na2SO4(0．1 mol/Lm)脅迫處理，可溶性蛋白含量變化同對(duì)照相比，差異不顯著(P＞0．05)，而未接種內(nèi)生真菌5種處理之間差異均不顯著(P＞0．05)，說明鹽脅迫對(duì)植物可溶性蛋白含量影響不明顯。

表2 鹽脅迫下深色有隔內(nèi)生真菌D575對(duì)樟子松苗木生理指標(biāo)的影響Tab．2 The effect of endophyte fungi D575 on P．sylvestris var．Mongolica physiological index under salt tolerance

(2)對(duì)保護(hù)酶活性的影響。植物在非生物脅迫條件下會(huì)直接或間接形成過量的活性氧自由基(ROS)，對(duì)植物細(xì)胞膜系統(tǒng)具有破壞作用，逆境條件下，植物體內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)能夠清除多余的自由基，從而提高植物抗逆性，不受逆境脅迫傷害［23］。超氧化物岐化酶(SOD酶)、過氧化物酶(POD酶)和過氧化氫酶(CAT酶)是植物重要的保護(hù)酶，非鹽脅迫條件下，接種內(nèi)生真菌D575后，樟子松苗木SOD酶、POD酶和CAT酶通對(duì)照相比分別增加30．08%、54．49%和42．85%，可顯著提高植物的抗逆性(見表3)。在鹽脅迫條件下，同對(duì)照相比，SOD酶活增加29．65% ～35．11%，POD酶活增加50．55%-55．83%，CAT 酶 活 增 加 41．37% ～47．05%。均有大幅度的提高，進(jìn)一步證明，內(nèi)生真菌D575的存在，可顯著提高植物的抗逆性，有效抵御鹽脅迫對(duì)植物的傷害。

(3)對(duì)丙二醛含量的影響。活性氧代謝是植物對(duì)逆境脅迫的初始反應(yīng)，鹽脅迫條件下，植物體內(nèi)活性氧的積累加劇，導(dǎo)致膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛含量迅速增加，而內(nèi)生真菌可提高宿主植物保護(hù)酶系活性，從而清除鹽脅迫所產(chǎn)生的超氧自由基和活性氧，減輕逆境對(duì)宿主植物的傷害［24］。未接種內(nèi)生真菌D575條件下，鹽脅迫處理后，樟子松丙二醛含量顯著增加(見表3)，而無論是否有鹽脅迫，D575的存在均降低了植物體內(nèi)的丙二醛含量，在NaCl(0．1 ～0．2 mol/Lm)和 Na2SO4(0．1 ～0．2 mol/Lm)脅迫下，同對(duì)照相比，丙二醛含量分別降低13．33% ～17．91%，鹽脅迫濃度越高，降低效果越明顯，證明內(nèi)生真菌可降低宿主植物丙二醛含量，降低鹽分對(duì)植物的傷害。

(4)對(duì)脯氨酸含量的影響。植物在逆境下積累脯氨酸具有一定普遍性，脯氨酸可作為滲透調(diào)節(jié)物、膜和酶的保護(hù)物質(zhì)及自由基清除劑等，而對(duì)植物起保護(hù)作用［25］。在未接種條件下，非鹽脅迫的樟子松脯氨酸含量低于鹽脅迫下樟子松的脯氨酸含量，差異顯著(P＜0．05)(見表3)，說明鹽分脅迫提高了樟子松脯氨酸含量。無論是否有鹽脅迫，接種D575均可降低樟子松體內(nèi)脯氨酸含量。在NaCl(0．1 ～0．2 mol/Lm)和 Na2SO4(0．1 ～0．2 mol/Lm)脅迫下，同對(duì)照相比，丙二醛含量分別降低25．04% ～38．01%。

表3 鹽脅迫下深色有隔內(nèi)生真菌D575對(duì)樟子松抗逆指標(biāo)的影響Tab．3 The effect of endophyte fungi D575 on P．sylvestris var．Mongolica stress resistance physiological index under salt tolerance

3 結(jié)論與討論

(1)深色有隔內(nèi)生真菌D575可侵染樟子松，在與宿主植物互作過程中，通過提高宿主植物葉綠素含量，增強(qiáng)光合作用效率，進(jìn)而增加苗高、地徑和干物質(zhì)積累。

(2)深色有隔內(nèi)生真菌D575可提高樟子松苗木耐鹽性，與宿主植物互作后提高保護(hù)酶(SOD酶、POD酶和CAT酶)活性、同時(shí)降低丙二醛和游離脯氨酸含量緩解鹽脅迫對(duì)宿主植物的傷害。

植物根際益生菌與宿主植物的互作機(jī)制是近年研究的熱點(diǎn)問題，通過人為引入植物根際益生菌可促進(jìn)植物生長和養(yǎng)分吸收，提高宿主植物抗逆性，并在生態(tài)修復(fù)中發(fā)揮重要作用。益生菌提高植物耐鹽性機(jī)制包括:緩解植物細(xì)胞中過量活性氧自由基的積累，誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生糖類和氨基酸等能夠調(diào)節(jié)滲透壓的物質(zhì)緩解植物的滲透壓壓力，減少由逆境環(huán)境所誘導(dǎo)產(chǎn)生的丙二醛等應(yīng)激化合物產(chǎn)生［26］。如玉米接種丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)、熒光假單胞菌(P．fluorescens)、產(chǎn)腸桿菌(Enter-obacter aerogenes)后，對(duì)鹽堿環(huán)境的耐受性顯著提高［27］。菌根菌可顯著提高植物耐鹽性［28-31］，外生菌根菌如 Suillus bovinus、S．luteus［16］、Laccaria bicolor對(duì)一定濃度的鹽脅迫有較強(qiáng)的耐受性，并且可以顯著提高針葉樹種的耐鹽堿能力，Picea glauca和Pinus banksiana的實(shí)生苗在接種L．bicolor后，明顯提高了兩種針葉樹在鹽脅迫土壤上的存活率和生長量［32］，與對(duì)照相比，針葉受到脅迫的傷害明顯減少［33］。

深色有隔內(nèi)生真菌是針葉樹重要的根際微生物，針葉樹根部深色有隔內(nèi)生真菌以Phialoceph ala fortinii s．l．—Acephala applanata species complex(PAC)類群集合為主，同菌根菌相比，其對(duì)宿主植物的益生作用研究較少，如通過代謝抑菌成分抑制病原菌、篩選低毒菌株控制土壤病原菌等方面證明了其生物防治能力［34-37］，但目前還沒有其與宿主植物互作提高耐鹽性的報(bào)道。離體實(shí)驗(yàn)證明，深色有隔內(nèi)生真菌對(duì)鹽脅迫具有較強(qiáng)的耐受性［13-14］，在 CNaCl≤0．4 mol/Lm 和 C Na2SO4≤0．2 mol/Lm的低中濃度鹽脅迫條件下，D575菌絲生長和對(duì)碳、磷相對(duì)利用率受抑制程度均較低，生長速率同對(duì)照相比相差不大。通過人工接種實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明內(nèi)生真菌D575可提高宿主植物對(duì)鹽脅迫的耐受性，增加植物生物量積累，如在NaCl和Na2SO4脅迫下，同對(duì)照相比，苗高增加9．32% ～13．26%，鹽脅迫濃度越大，苗高增加越多，說明內(nèi)生真菌對(duì)樟子松促生作用越明顯。此外，接種內(nèi)生真菌D575后，顯著增加植物體內(nèi)保護(hù)酶活性，并降低丙二醛和游離脯氨酸的含量，最大程度降低鹽脅迫對(duì)植物的傷害。上述實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步田間實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

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