胡愛軍+蔡小玲

摘要：KDN-04（08）A、C、D定氮儀為糧食、飼料、乳品、土肥、化工、醫(yī)藥、商檢樣品的理想檢測(cè)設(shè)備，與傳統(tǒng)的仲裁法測(cè)定樣品粗蛋白方法相比，具有速度快，準(zhǔn)確率高，安全簡(jiǎn)單易操作等優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：取樣；消化；蒸餾；滴定；計(jì)算

KDN-04（08）A、C、D定氮儀為糧食、飼料、乳品、土肥、化工、醫(yī)藥、商檢樣品的理想檢測(cè)設(shè)備，與傳統(tǒng)的仲裁法測(cè)定樣品粗蛋白方法相比，具有速度快，準(zhǔn)確率高，安全簡(jiǎn)單易操作等優(yōu)點(diǎn)。KDN型定氮儀檢測(cè)整套裝置，由消化器（見圖一）、蒸餾器（見圖二）兩大部分組成。提高蛋白質(zhì)含量測(cè)定的檢測(cè)速度，關(guān)鍵要加速樣品消化的時(shí)間。KDN系列定氮儀消化裝置，由于采用井式電加熱方式，增大了消化管受熱面，使消化樣品在消化管內(nèi)取得最佳的消化效果。如果使用硒片作為催化劑可進(jìn)一步加速消化煮解，大大縮短了消化時(shí)間。消化時(shí)產(chǎn)生的SO2等有害氣體，通過消化爐上的排污管經(jīng)過抽氣泵把氣體融合在水中排入下水道，有效的抑制有害氣體的外逸，又省去實(shí)驗(yàn)中安裝毒氣通風(fēng)柜。試樣經(jīng)過40分鐘的消化，即能完全消化。自來水進(jìn)入蒸餾器，經(jīng)穩(wěn)壓器流入蒸發(fā)爐，因水位的上升碰到電極產(chǎn)生電流，快速加熱產(chǎn)生蒸汽，對(duì)已消化完全的樣品進(jìn)行蒸餾，將蒸餾過程中產(chǎn)生的硫酸銨轉(zhuǎn)化成銨并與硼酸反應(yīng)生成硼酸氫銨。然后經(jīng)滴定計(jì)算蛋白質(zhì)含量，滴定的過程是鹽酸（或硫酸）和硼酸氫銨反應(yīng)的過程。澧縣農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心在樣品中粗蛋白測(cè)定上進(jìn)行一些探索，現(xiàn)將工作中的體會(huì)與質(zhì)檢工作者作些商討交流。

一、KDN-04 （08） A、C、D定氮儀技術(shù)參數(shù)

1.測(cè)定品種：糧食、飼料、食品、乳制品、土肥、醫(yī)藥；

2.測(cè)定范圍：含氮量0.05%-90%；

3.精度：相對(duì)差≤2%，平行差≤0.2%；

4.測(cè)定時(shí)間：消化45分鐘左右（視樣品含氮量而定，催化劑用硫酸銅、硫酸鉀則需2.5小時(shí)），蒸餾6分鐘左右；

5.電源：AC220V/50HZ；

6.功率：消化器（四孔）1200W（八孔）2400W；

7.體積：04消化器650×220×150

08消化器730×300×150；

蒸餾器380×330×740單位（mm），1000Kw；

二、操作過程

1.選取具有代表性的試樣用四分法縮減至200g，粉碎后全部通過40目篩，裝于密封容器內(nèi)，防止試樣成分變化。

2.混合催化劑：2g硫酸銅加上30g硫酸鉀，磨碎混勻。（或用35g硒粉代替）

3.稱取0.5g試樣，精確至0.0002g，，放入消化管內(nèi)，加上6.4g混合催化劑與試樣混合，加入10ml的濃硫酸和2粒玻璃珠，將消化管分別放入各個(gè)消化架各個(gè)孔內(nèi)，然后置于消化器上，放上已經(jīng)裝好密封圈的排污管，打開抽氣三通進(jìn)水（自來水）使抽氣通處于吸氣狀態(tài)，在接通電源，打開各自控制開關(guān)，轉(zhuǎn)動(dòng)電位器，調(diào)節(jié)電壓指示220v，使其快速消化。消化結(jié)束后（一般2.5小時(shí)），消化管及排污管和整個(gè)托架一起移到冷卻架上進(jìn)行冷卻。注意：在冷卻過程中，排污管必須保持吸氣狀態(tài)（千萬不能將消化管放入水中冷卻）防止廢氣逸出。

4.混合指示劑：0.05g甲基紅加上50ml乙醇混勻后為0.1%的甲基紅乙醇溶液，0.25g溴甲酚綠加上50ml乙醇混勻后為0.5%溴甲酚綠乙醇溶液，然后把兩溶液等體積混合，在陰涼處保存期為三個(gè)月。

5.配制0.1mol的硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液：3ml硫酸緩緩的注入1000ml去離子水中，冷卻，搖勻。

6. 0.1mol的硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的標(biāo)定：稱取0.2g無水碳酸鈉（270℃-300℃的高溫爐中灼燒），溶于50ml水中，加入10滴溴甲酚綠-甲基紅指示劑，用配制好的硫酸溶液滴定至溶液由綠色變成暗紅色，記住加了多少毫升，然后煮沸2分鐘，冷卻后繼續(xù)滴定至溶液再呈暗紅色，記住加了多少毫升，兩次的和為V1，同時(shí)做空白試驗(yàn)，代入公式：

C=m×1000/〔（V1-V2）M〕

M為無水碳酸鈉的摩爾質(zhì)量的數(shù)值，為52.994

m為無水碳酸鈉的質(zhì)量的準(zhǔn)確數(shù)值，單位為g

7.40%氫氧化鈉水溶液（M∕V）：20g氫氧化鈉加上50ml蒸餾水混勻。

8.2%硼酸水溶液（M∕V）：2g硼酸加上100ml蒸餾水混勻。

9.打開定氮儀的開關(guān)，關(guān)掉排水閥打開自來水，打開面板蒸汽開關(guān)，水位達(dá)到后蒸汽開關(guān)的燈會(huì)自動(dòng)亮，這時(shí)關(guān)掉自來水，打開冷卻水龍頭，儀器進(jìn)入自動(dòng)加熱狀態(tài)，直到蒸汽噴出來為止（再噴半分鐘）。關(guān)掉蒸汽開關(guān)，把接收液（25ml硼酸加上2滴溴甲酚綠———甲基紅指示劑）的三角燒瓶放到大圓盤上，接收管浸入液面。

10.把消化好的樣品的消化管與蒸餾器連接，稍加旋轉(zhuǎn)使其密封后打開蒸餾水開關(guān)H2O加蒸餾水20ml，關(guān)掉開關(guān)，再打開NaOH開關(guān)加50mlNaOH，關(guān)閉NaOH開關(guān)。打開蒸汽開關(guān)，儀器進(jìn)入正常工作狀態(tài)，當(dāng)三角燒瓶的接收液滿150ml，下移三角燒瓶繼續(xù)蒸餾半分鐘。關(guān)閉蒸汽開關(guān)，倒掉消化管內(nèi)廢液，進(jìn)行滴定計(jì)算。

三、討論

1.如果開機(jī)電源指示燈不亮，檢查電源插頭和15A熔絲管，請(qǐng)必須使用良好接地的三眼插座。

2.消化時(shí)如有氣體外逸，加大三通抽氣泵的進(jìn)水量。在消化初始階段，需注意觀察防止試樣因急速加熱而飛濺。緩解辦法可在消化過程，當(dāng)發(fā)現(xiàn)試樣飛濺時(shí)關(guān)機(jī)5分鐘后再開機(jī)繼續(xù)加熱。

3.如果開機(jī)后電流上升中，指示燈突然不亮，請(qǐng)先切斷電源，檢查熔絲管是否損壞（如損壞，應(yīng)更換15A熔絲管），然后關(guān)閉冷卻水，打開排水閥和蒸汽開關(guān)進(jìn)行排水，故障排除后重新開機(jī)操作。冷卻水接口必須連接自來水，其他水源不能使用（如蒸餾水或經(jīng)過處理后的深井水），如果其他水源的話，儀器內(nèi)蒸發(fā)爐因不導(dǎo)電引起儀器不能加熱，儀器將無法工作。開機(jī)前先觀察儀器右側(cè)面下部蒸發(fā)爐內(nèi)水位，應(yīng)不能超過電極底部。（如果超過請(qǐng)先排水，否則很容易造成儀器損壞，操作時(shí)應(yīng)先關(guān)閉冷卻水，再打開排水閥和蒸汽開關(guān)，然后排水。）打開面板上“蒸汽”開關(guān)，機(jī)器開始自動(dòng)加熱，加熱期間請(qǐng)注意觀察面板上電流表指針是否有電流指示（如果沒有電流指示，表示儀器沒有加熱或加熱功率很小，其原因?yàn)榭赡芩|(zhì)有問題），直到蒸汽從前下方蒸餾塑管內(nèi)噴出，讓其噴半分鐘左右。關(guān)掉蒸汽開關(guān)，儀器進(jìn)入待機(jī)狀態(tài)。（如果待機(jī)時(shí)間過長，蒸餾前應(yīng)先開一下蒸汽開關(guān)，待蒸汽噴出后再關(guān)掉蒸汽開關(guān)）接收液取下（在取下接收瓶時(shí)，用少量蒸餾水沖洗導(dǎo)出管前端，洗液與吸收液合并），關(guān)掉蒸汽開關(guān)，倒掉蒸餾完的廢液儀器還原到待機(jī)狀態(tài)，接收液待滴定之用。

4.如果開機(jī)后自來水不能正常進(jìn)水蒸發(fā)爐（右下方有一個(gè)觀察窗口）請(qǐng)用手?jǐn)D壓出水口膠管或打開后蓋擠壓穩(wěn)壓器連接到蒸發(fā)爐的橡膠管

（可能橡膠管內(nèi)有空氣）。使水正常流入蒸發(fā)爐內(nèi)進(jìn)行加熱。

5.如果打開水泵或堿泵有工作聲音，但不出液體，檢查儀器內(nèi)部單向閥是否連接，消除方法是拔掉單向閥一頭橡膠管，用硬物使單向閥中間藍(lán)色維體活動(dòng)即可。如果水泵或堿泵沒有工作聲音時(shí)，應(yīng)檢查2A保險(xiǎn)絲是否斷裂。

6.試驗(yàn)做完后，冷卻水不能關(guān)，每天工作結(jié)束后，清洗堿泵，方法如下：堿液管從容器中取出，放入蒸餾水容器內(nèi)（蒸餾水必須在40℃左右）的溫水中然后在蒸餾器前放上一只空的消化管，打開NaOH開關(guān)，抽取200ml蒸餾水（溫水）2-3次清洗完成，保證使用壽命，盡量減少堿泵因結(jié)晶而無法使用。

7.KDN系列定氮儀采用凱氏定氮的原理進(jìn)行測(cè)定，但是不同的樣品，實(shí)際含氮量也有區(qū)別。所以，不同的樣品必須采用不同的換算系數(shù)。如花生、大豆、蠶豆、大麥小麥、燕麥等的含氮量為17.6%，求得K=5.7；蕎麥、葵花籽、亞麻籽、棉花籽、蓖麻子等換算系數(shù)則為K=5.5；玉米菜籽則為6.0；水稻為5.95，上述以外的其他樣品換算系數(shù)均適用6.25，在計(jì)算公式中A也就不一樣。

蛋白含量（%）=[（V1-V2）C×0.014×A×100]/W

公式中：V1-消耗鹽酸（或硫酸）的毫升數(shù)

V2-空白實(shí)驗(yàn)時(shí)消耗鹽酸（或硫酸）的毫升數(shù)

C-鹽酸（或硫酸）的當(dāng)量濃度

0.014-1ml鹽酸（或硫酸）的當(dāng)量數(shù)

A-A固定系數(shù)（6.25，5.7等）

W-試樣重量g

空白測(cè)定：用0.1克糖代替樣品或不加樣品作空白測(cè)定。

摘要：用高效液相色譜法對(duì)飼料中維生素D3的檢測(cè)過程中，BHT（2，6-二叔丁基對(duì)甲酚）對(duì)測(cè)定會(huì)產(chǎn)生影響。當(dāng)維生素D3含量較低或檢測(cè)人員經(jīng)驗(yàn)不足時(shí)，檢測(cè)峰易發(fā)生誤判，造成檢測(cè)結(jié)果的偏離。從BHT結(jié)構(gòu)和實(shí)驗(yàn)入手，對(duì)檢測(cè)過程進(jìn)行優(yōu)化，可消除BHT對(duì)飼料中維生素D3檢測(cè)的影響，達(dá)到準(zhǔn)確定性和準(zhǔn)確定量的目的。

關(guān)鍵詞：維生素D3；高效液相色譜儀；抗氧化劑；準(zhǔn)確定量

維生素D3是維持機(jī)體正?；顒?dòng)必不可少的物質(zhì)，常用于維生素D缺乏癥的預(yù)防與治療，適量的各種維生素D3作為飼料添加劑能促進(jìn)禽畜生長，增強(qiáng)禽畜體質(zhì)，產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟(jì)效益。

飼料中維生素D3的檢測(cè)一般是按照GB/T 17818-2010進(jìn)行，但是在分析檢測(cè)過程中，經(jīng)常會(huì)有飼料中維生素D3超過標(biāo)準(zhǔn)值的情況，在排除了企業(yè)添加值錯(cuò)誤的情況外，本文首次發(fā)現(xiàn)了在檢測(cè)過程中添加的抗氧化劑BHT對(duì)維生素D3含量測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生的影響，并且對(duì)其進(jìn)行了詳細(xì)的討論，達(dá)到了準(zhǔn)確定量飼料中維生素D3的目的。

1.實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

高效液相色譜儀：島津；電子分析天平（德國梅特勒）；氮吹儀；圓底燒瓶（帶回流冷凝器）；電熱套；抗壞血酸；乙醇；氫氧化鉀；乙醚；氯化鈉；BHT（2，6-二叔丁基對(duì)甲酚）。

1.2 樣品前處理

稱取樣品10g，精確至0.0001g，置于250mL圓底燒瓶中，加入50mL L-抗壞血酸乙醇溶液，10mL氫氧化鉀溶液，混合均勻，沸水浴上回流30min皂化。

皂化完成后，皂化液轉(zhuǎn)移至裝有50mL乙醚的250mL分液漏斗中提取，再分別用40mL、30mL乙醚重復(fù)提取2次，棄去水相，合并三次乙醚相。用氯化鈉溶液50mL洗滌一次，棄去水相，再用50mL水洗滌乙醚提取液至中性。乙醚提取液用無水硫酸鈉脫水，轉(zhuǎn)移到100mL棕色容量瓶中，加入100mgBHT使之溶解，用乙醚定容至刻度。

取5.0mL乙醚溶液，氮?dú)獯蹈桑眉状级ㄈ葜?.0mL，高效液相色譜儀分析。

1.3 色譜條件

色譜柱：C18 5μm 150×4.6 mm，流動(dòng)相：甲醇：水=95：5，流速：1.0 mL/min，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：20.0μL，波長：264 nm

2.結(jié)果討論

2.1 結(jié)果影響

實(shí)際測(cè)定中，我們發(fā)現(xiàn)，在1.3色譜條件下，維生素D3的含量普遍比標(biāo)示含量偏高，而且在空白基質(zhì)中，在與維生素D3對(duì)照品同一保留時(shí)間出現(xiàn)了強(qiáng)吸收峰，而且面積比較大，見圖2，與維生素D3對(duì)照品檢測(cè)重疊，對(duì)飼料中維生素D3的檢測(cè)產(chǎn)生影響，具體譜圖見圖1-圖4。

2.2 影響因素分析驗(yàn)證

通過對(duì)樣品的分析過程進(jìn)行拆解，對(duì)可能存在的影響因子一一進(jìn)行排查，最后確定，用GB/T 17818-2010方法對(duì)樣品進(jìn)行分析檢測(cè)，是BHT對(duì)整個(gè)的分析結(jié)果產(chǎn)生了影響。

2.2.1BHT結(jié)構(gòu)剖析驗(yàn)證

維生素D3對(duì)光、熱不穩(wěn)定，在空氣中容易氧化，光化成前反式維生素D3和后維生素D3等產(chǎn)物而失去活性。在實(shí)際測(cè)定中，加入BHT抗氧化劑，可防止其氧化。

在維生素D3提取過程中，在最后一步加入了抗氧化劑BHT，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)BHT結(jié)構(gòu)與維生素D3有相似的紫外吸收基團(tuán)（具體結(jié)構(gòu)式見圖5）。維生素D3在264nm下，有較強(qiáng)的吸收。而BHT由于具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，因此在由苯環(huán)共軛系統(tǒng)下π-π※躍遷產(chǎn)生B帶特征吸收在254nm下有較強(qiáng)的吸收，又由于在BHT結(jié)構(gòu)中，苯環(huán)上面有羥基，作為助色基團(tuán)，會(huì)導(dǎo)致BHT最大特征吸收波長發(fā)生紅移，因此BHT最大吸收波長會(huì)大于254nm，因此，可以考慮，在圖2空白玉米樣中，出現(xiàn)與維生素D3相同保留時(shí)間下出現(xiàn)的物質(zhì)，是BHT帶來的干擾

2.2.2 BHT的影響實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

介于BHT對(duì)維生素D3分析可能存在的影響，稱取一定量的BHT，用甲醇溶解，按照1.3中色譜條件，進(jìn)行分析，色譜圖見圖6.

從圖6中可以看出，維生素D3對(duì)照品以及樣品和單獨(dú)的BHT在保留時(shí)間都為8.45min，因此可以證明，BHT對(duì)維生素D3含量的測(cè)定產(chǎn)生了影響，在圖2中也得到了驗(yàn)證。在圖3樣品中出現(xiàn)的色譜峰物質(zhì)，不完全是樣品中維生素D3，而是維生素D3與BHT疊加后得到的色譜吸收峰。因此，在GB/T 17818-2010方法下，如果單純的以保留時(shí)間作為維生素D3檢測(cè)峰的話，對(duì)測(cè)定結(jié)果會(huì)產(chǎn)生很大的影響。

2.3 BHT影響的解決方法

2.3.1流動(dòng)相的優(yōu)化

為消除BHT的干擾，我們嘗試更改有機(jī)相比例。

2.3.1.1調(diào)整流動(dòng)相比例為90：10

當(dāng)減小有機(jī)相甲醇的比例，調(diào)整為甲醇：水為

2.3.1.2調(diào)整流動(dòng)相比例為98：2

更改流動(dòng)相有機(jī)相比例為98：2時(shí)，發(fā)現(xiàn)此時(shí)維生素D3對(duì)照品和BHT能夠徹底分開，見圖8A；樣品中的VD3和BHT也能完全的分開，見圖8B，可排除BHT對(duì)維生素D3檢測(cè)的干擾。

2.3.1.3調(diào)整流動(dòng)相比例為100%甲醇

繼續(xù)調(diào)整流動(dòng)相比列為100%甲醇，我們發(fā)現(xiàn)，此時(shí)維生素D3對(duì)照品和BHT均無顯著相應(yīng)，具體情況見圖9。

2.3.2BHT的添加及放置時(shí)間影響剖析

介于BHT對(duì)維生素D3存在的影響，本文取同一樣品X，平行稱取兩份，X1樣品按照1.2前處理方法進(jìn)行前處理檢測(cè)，X2樣品亦按照1.2前處理方法進(jìn)行前處理，但最后一步，X2樣品定容時(shí)不加BHT，分別于4℃條件下放置0天（樣品編號(hào)X1、X2）、3天（樣品編號(hào)X3、X4）、7天（樣品編號(hào)X5、X6）、15天（樣品編號(hào)X7、X8），然后以2.3.1.3的色譜條件對(duì)其進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)分析，具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

從圖8A中，可以看出，X樣品在未加BHT的情況下，放置3天、7天以及15天的情況下，樣品中維生素D3的含量與其加入BHT檢測(cè)后的結(jié)果是基本不變的，也就是說，在檢測(cè)飼料樣品中的維生素D3時(shí)，半個(gè)月之內(nèi)檢測(cè)完畢，為了防止BHT對(duì)維生素D3的結(jié)果產(chǎn)生影響，是完全可以不添加BHT的。

3結(jié)論

本文首次發(fā)現(xiàn)了在檢測(cè)過程中添加的抗氧化劑BHT對(duì)維生素D3含量測(cè)定產(chǎn)生的影響，并且從結(jié)構(gòu)剖析方面以及單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證，優(yōu)化流動(dòng)相比例，對(duì)其進(jìn)行分離，同時(shí)對(duì)于檢測(cè)過程中，BHT的添加與否在不同時(shí)間內(nèi)對(duì)飼料中維生素D3含量測(cè)定的影響進(jìn)行了詳細(xì)的討論。最后確定，在飼料中維生素D3的檢測(cè)過程中，流動(dòng)相的比例優(yōu)化為98：2時(shí)，BHT與維生素D3可以有效的分離；其次，為避免BHT在檢測(cè)過程中產(chǎn)生的干擾，在放置15天以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，不加BHT進(jìn)行檢測(cè)，亦可得到準(zhǔn)確的結(jié)果，排除了BHT對(duì)其的影響，達(dá)到了準(zhǔn)確定量飼料中維生素D3含量的目的，但由于維生素D3的前處理方法比較復(fù)雜，如何能夠更快速有效的檢測(cè)其含量還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)（略）