金海強(qiáng)，樸光一，屈俊廷，沈國娟，李熙英

(1．延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，吉林 龍井 133400;2．延邊大學(xué)長白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 延吉 133002;3．延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

人參Panax ginseng C．A．Mey．為五加科藥用植物。我國是人參的原產(chǎn)國，吉林省長白山是人參的宗主地和發(fā)祥地，人參產(chǎn)量占全國的80%，占世界的70%［1］。在人參(園參)種植方面，我國仍然采用伐林栽參、參后還林的栽培方式，影響長白山的森林資源和生態(tài)環(huán)境。隨著國家天然林保護(hù)工程的啟動，毀林栽參受到嚴(yán)格限制。而人參(園參)需種植4～8 a才能采收，采收后的參地10～15 a內(nèi)不能重茬栽參的特點(diǎn)，使人參種植用地變得異常緊張。造成上述現(xiàn)象的主要原因與人參銹腐病Cylindrocarpon destructans等人參根部病害經(jīng)常發(fā)生有直接關(guān)系。據(jù)文獻(xiàn)報道人參銹腐病菌以厚垣孢子休眠的方式在無寄主的條件下在土壤中長期存活，致使土壤帶菌，直接影響下一茬人參的種植，造成人參連作障礙［2-3］。因此，凡栽培人參的地方，人參銹腐病便成為主要威脅。

解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens與枯草芽孢桿菌B．subtilis親緣性很高，且均為安全菌株，特性非常相似。研究表明，該類菌通過非核糖體途徑合成分子量小、熱穩(wěn)定性好、含有D-氨基酸、耐受蛋白酶水解以及有機(jī)溶劑作用的脂肽類抗生素［4］。解淀粉芽孢桿菌通過產(chǎn)生低分子量抗生素以及抗菌蛋白或多肽等活性物質(zhì)抑制植物病原菌，并且可作為根圍細(xì)菌促進(jìn)植物生長，其產(chǎn)抗真菌物質(zhì)主要有抗真菌蛋白、伊枯草菌素、幾丁質(zhì)酶等［5］。而解淀粉芽孢桿菌對人參銹腐病菌抑菌作用方面未見報道。本文研究了從楊樹上分離到的內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌菌株Y-S-Y12對人參銹腐病的防治作用，為人參銹腐病生物防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌供試植物病原菌有人參銹腐病菌Cylindrocarpon destructans、人參黑斑病菌Alternaria brassicicola、人參灰霉病菌Botrytis cinerea，水稻紋枯病菌Rhizoctonia solani，楊樹腐爛病菌Cytospora chrysosperma，水稻惡苗病菌Fusarium moniliforme;供試拮抗菌菌株有Y-S-Y12，YBN13，YBN18，YBN20和YBN21。根據(jù)形態(tài)特征及16S rDNA序列分析方法鑒定，Y-S-Y12菌株為解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens［6］;YBN13和YBN18為芽孢桿菌屬的細(xì)菌Bacillus sp．，登錄號分別為JX156418和JX156419。以上植物病原菌和拮抗菌均由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理研究室提供。

1.2 5株拮抗菌菌株及其發(fā)酵濃縮液對人參銹腐病菌菌絲生長抑制作用的室內(nèi)測定

1.2.1 菌 株 選 用Y-S-Y12，YBN13，YBN18，YBN20，YBN21菌株在KB培養(yǎng)基上活化2 d，人參銹腐病菌在PDA平板上活化7 d。用打孔器打出直徑8 mm的人參銹腐病菌菌碟，放入新的PDA平板中間，人參銹腐病菌菌碟兩邊10 mm處點(diǎn)接已活化的拮抗菌(2個點(diǎn)對稱)，每個處理重復(fù)5個培養(yǎng)皿，并以只接人參銹腐病菌不接拮抗菌的為對照。20℃恒溫箱培養(yǎng)4 d，測菌落直徑，計算抑菌率。

抑菌率(%)=(對照病菌菌落寬度-處理病菌菌落寬度)÷(對照病菌菌落寬度-接種時菌碟寬度)×100

1.2.2 發(fā)酵濃縮液 上述5株拮抗菌菌株用KB培養(yǎng)基活化培養(yǎng)2 d后，分別接種于200 mL KB液體培養(yǎng)液中，在28℃，120 r/min恒溫雙層搖床中振蕩培養(yǎng)5 d后，經(jīng)4000 r/min離心25 min，取上清液用直徑0．22μm微孔濾膜過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至30 mL。此為拮抗菌發(fā)酵濃縮液。

抑菌活性測定采用紙片法。先PDA平板中間放入直徑8 mm的人參銹腐病菌的菌碟1片，在菌碟兩邊10 mm處放置滴200μL拮抗菌濃縮液的濾紙2片(2片對稱)，以只放置人參銹腐病菌菌碟的為對照，每個處理重復(fù)5個培養(yǎng)皿，放入20℃恒溫箱培養(yǎng)4 d，測人參銹腐病菌菌落直徑，計算抑菌率。1.3 5株拮抗菌對人參銹腐病田間防治試驗(yàn) 試驗(yàn)地在延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)田(龍井)，人參銹腐病發(fā)生十分嚴(yán)重，基本上不能種植人參。2 L的KB培 養(yǎng) 液 中 分 別 接Y-S-Y12，YBN13，YBN18，YBN20，YBN21拮抗菌菌株，在28℃，120 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)7 d后備用。人參苗移栽前(4月份)，拮抗菌培養(yǎng)液稀釋成40倍液，人參苗浸泡其中20 min，撈出移栽。試驗(yàn)地設(shè)12個小區(qū)，每小區(qū)面積30 m2，試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，2次重復(fù)。KB培養(yǎng)液的稀釋液中浸泡的苗為對照。栽植人參苗的株距10 cm，行距30 cm。正常管理。10月中旬，取出3行參根調(diào)查成活率、病株率、參根的地莖、根長、根重，并取整個小區(qū)參根測小區(qū)產(chǎn)量。

1.4 Y-S-Y12菌株及其發(fā)酵濃縮液對6種植物病原菌菌絲生長的抑制作用選用在PDA平板中已活化培養(yǎng)的人參銹腐病菌、人參黑斑病菌、人參灰霉病菌、水稻紋枯病菌、水稻惡苗病菌和楊樹腐爛病菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。Y-S-Y12菌株抑菌測定方法同1．2．1，發(fā)酵濃縮液制作方法和抑菌試驗(yàn)同1．2．2。

1.5 不同溫度和pH值下Y-S-Y12菌株及其發(fā)酵濃縮液對人參銹病菌的抑菌作用

1

.5.1 不同溫度

(1)Y-S-Y12菌株對病菌菌絲生長的抑制作用。Y-S-Y12菌株在KB培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)2 d。在PDA平板中間放置直徑8 mm的人參銹腐病菌的菌碟1片，在距離菌碟15 mm處接入Y-S-Y12菌株(2點(diǎn)對稱)，以只放置人參銹腐病菌菌碟的為對照，分別放置5，10，15，20，25，30℃恒溫箱中培養(yǎng)，每個處理重復(fù)5個培養(yǎng)皿。培養(yǎng)6 d后測人參銹腐病菌菌落直徑，并計算抑菌率。

(2)Y-S-Y12菌株的發(fā)酵濃縮液對病菌菌絲生長的抑制作用。在PDA平板中間放置直徑8 mm的人參銹腐病菌的菌碟1片，在距離菌碟15 mm處放置滴Y-S-Y12菌株的發(fā)酵濃縮液200μL的濾紙2片(2片對稱)，以只放置人參銹腐病菌碟的為對照，每個處理重復(fù)5個培養(yǎng)皿，分別放置5，10，15，20，25，30℃恒溫箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)6 d后測人參銹腐病菌菌落直徑，并計算抑菌率。

(3)Y-S-Y12菌株的發(fā)酵濃縮液對病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 d的人參銹腐病菌菌落制成孢子懸浮液(每個視野大約100孢子)，并測500個孢子中的孢子萌發(fā)率(處理前的萌發(fā)率)。取0．2 mL人參銹腐病菌孢子懸浮液和0．2 mL Y-S-Y12菌株的發(fā)酵濃縮液的混合液滴入凹玻片中，0．2 mL人參銹腐病菌孢子懸浮液和0．2 mL KB培養(yǎng)液的混合液為對照，分別放置5，10，15，20，25，30℃恒溫箱中培養(yǎng)。8 h后，用顯微鏡觀察不同處理中的500個孢子中的孢子萌發(fā)數(shù)，并計算萌發(fā)率和孢子萌發(fā)抑制率。

萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn):芽管長度以超過孢子短直徑長度1/3為已萌發(fā)孢子。

孢子萌發(fā)抑制率(%)=［對照組孢子萌發(fā)率(8 h)-處理組孢子萌發(fā)率(8 h)］÷(對照組孢子萌發(fā)率(8 h)-處理前孢子萌發(fā)率)×100

1.5.2 不同pH值

(1)Y-S-Y12菌株對病菌菌絲生長的抑制作用。分別配制pH值為5，6．18(未調(diào)pH的PDA培養(yǎng)基，以下相同)，7，9，11的PDA培養(yǎng)基。具體抑菌試驗(yàn)方法見1．5．1中的(1)，放入20℃恒溫箱中培養(yǎng)。

(2)Y-S-Y12菌株的發(fā)酵濃縮液對病菌菌絲生長的抑制作用。分別配制pH值為5，6，7，9，11的PDA培養(yǎng)基。具體抑菌試驗(yàn)方法見1．5．1中的(2)，放入20℃恒溫箱中培養(yǎng)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析采用Excel軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總和單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同拮抗菌菌株及其發(fā)酵濃縮液對人參銹腐病菌菌絲生長的抑制作用5株拮抗菌菌株對人參銹腐病菌菌絲生長的抑菌率均在85%以上，其中Y-S-Y12菌株的抑菌率最高，達(dá)到95．13%;其次為YBN13和YBN18，其抑菌率分別為91．39%和90．26%。5株拮抗菌株的發(fā)酵濃縮液對人參銹腐病菌菌絲生長均具有較強(qiáng)的抑菌活性，其抑菌率均為50%以上。其中Y-S-Y12菌株的發(fā)酵濃縮液抑菌率為69．41%，抑菌活性顯著高于其它拮抗菌發(fā)酵濃縮液;其次為YBN13發(fā)酵濃縮液，抑菌率為62．65%;再次為YBN18、YBN21發(fā)酵濃縮液，并兩者之間沒有顯著性差異(表1)。

表1 拮抗菌菌株及其發(fā)酵濃縮液對人參銹腐病菌菌絲的抑制效果

2.2 拮抗菌菌株防治人參銹腐病田間效果

2.2.1 不同拮抗菌株對人參銹腐病病情指標(biāo)的影響 對人參苗成活株數(shù)和銹腐病病株數(shù)進(jìn)行方差分析，處理間差異均達(dá)到了極顯著水平［F成活株數(shù)=147．63 ＞ F0．01(2，6)=10．92;F病株數(shù)=147．63 ＞F0．01(2，6)=10．92］。對此進(jìn)行了多重比較，用拮抗菌菌株處理的人參苗成活株數(shù)顯著多于對照，其中用Y-S-Y12菌株處理的人參植株成活數(shù)最多，成活率為92．73%;其次為YBN18和YBN13，成活率分別為83．64%和82．73%，并它們之間沒有顯著差異;再次為YBN20，成活率75．45%;YBN21處理的人參苗成活數(shù)最少，成活率僅為48．18%。

對照的人參苗病株顯著多于處理的，Y-S-Y12菌株、YBN13菌株和YBN18菌株處理的人參苗病株數(shù)顯著少于其它處理，并它們之間沒有顯著性差異，防效分別為75．79%，73．68%，73．68%;其次為YBN20，防效為52．63%;YBN21菌株處理的病株數(shù)較多，防效僅為34．74%(表2)。

表2 人參銹腐病用不同拮抗菌株防治后的病情指標(biāo)(2012年)

2.2.2 不同拮抗菌處理對人參產(chǎn)量的影響 對人參根莖、根長和小區(qū)產(chǎn)量進(jìn)行方差分析，處理間差異均達(dá)到極顯著水平［F根莖=21．17＞F0．01(2，6)=10．92;F根長=147．63＞F0．01(2，6)=10．92;F小區(qū)產(chǎn)量=109．42＞F0．01(2，6)=10．92］。對此進(jìn)行了多重比較，Y-S-Y12和YBN13處理的人參根莖最粗;其次為YBN18和YBN20;YBN21處理的人參根莖與對照沒有顯著性差異。

不同拮抗菌株處理的人參根長之間具有顯著性差異，其中Y-S-Y12、YBN13和YBN18處理的人參根最長，并它們之間沒有顯著性差異;其次為YBN20和YBN21，它們之間也沒有顯著性差異。

不同拮抗菌株處理的試驗(yàn)小區(qū)人參產(chǎn)量顯著高于對照，其中Y-S-Y12和YBN18處理小區(qū)人參產(chǎn)量最多，并它們之間沒有顯著性差異;其次為YBN13;再次為YBN20。

從人參單根重上看，用Y-S-Y12，YBN13，YBN18，YBN20菌株處理的人參單根重明顯多于對照，其中Y-S-Y12處理的人參單根重比對照增多25．95%;其次為YBN13，比對照增多21．79%;再次為YBN18，比對照增多14．99%。說明這幾種拮抗菌對人參根生長有明顯的促進(jìn)作用(表3)。

表3 不同拮抗菌處理后的人參產(chǎn)量指標(biāo)(2012年)

2.3 Y-S-Y12菌株及其發(fā)酵濃縮液對6種植物病原菌菌絲生長的抑制作用Y-S-Y12菌株與植物病原菌的室內(nèi)對峙培養(yǎng)結(jié)果顯示，Y-S-Y12菌株對供試的6種植物病原菌均具有很強(qiáng)的抑制作用。其中對楊樹腐爛病菌抑菌率最高，達(dá)到100%;其次是對人參銹腐病菌和人參灰霉病菌，抑菌率達(dá)到96%和95．44%;再次是對人參黑斑病菌，抑菌率94．19%;對水稻惡苗病菌的抑制率最低，只有88．86%。

Y-S-Y12菌株的發(fā)酵濃縮液對供試的6種植物病原菌均具有較強(qiáng)的抑菌作用。其中對水稻紋枯病菌的抑菌率最高，達(dá)到78．73%;其次為對楊樹腐爛病菌、人參銹腐病菌和人參灰霉病菌的抑菌率，分別達(dá)到了68．23%，67．94%，67．34%;對水稻惡苗病菌的抑菌率最低，僅為47．59%(表4)。

表4 拮抗菌Y-S-Y12菌株及其發(fā)酵濃縮液對6種植物病原菌菌絲生長的抑制作用

2.4 不同溫度和pH條件下Y-S-Y12菌株及發(fā)酵濃縮液對人參銹腐病菌的抑菌作用

2.4.1 不同溫度 10～30℃條件下Y-S-Y12菌株對人參銹腐病菌菌絲生長均有抑制作用。其中20℃時的抑菌作用最強(qiáng)，抑菌率為91．46%;其次為25℃，其抑菌率83．63%;再次為15℃和30℃，其抑菌率分別為74．61%和76．47%。但30℃時人參銹腐病菌菌絲生長已受到嚴(yán)重抑制，5℃時人參銹腐病菌停止生長，不能表現(xiàn)拮抗菌株的抑菌作用。說明20℃左右的條件下，Y-S-Y12菌株對人參銹腐病菌具有較強(qiáng)的抑菌作用。

隨著溫度的增高Y-S-Y12菌株的發(fā)酵濃縮液對人參銹腐病菌的抑菌作用呈拋物線增加趨勢，20～25℃時對人參銹腐病菌菌絲生長抑制作用最強(qiáng)，其抑菌率在69．31%～69．45%;30℃時抑菌率急劇下降，只有5．88%(表5)。

表5 不同溫度下Y-S-Y12對人參銹腐病菌菌絲生長的抑制

在20℃條件下Y-S-Y12菌株的發(fā)酵濃縮液對人參銹腐病菌孢子萌發(fā)抑制作用最強(qiáng)，其抑制率為81．69%。其次是15℃和25℃，抑制率分別為63．27%和65．71%(表6)。

表6 不同溫度條件下Y-S-Y12菌株發(fā)酵濃縮液對人參銹腐病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

2.4.2 不同pH值 Y-S-Y12菌株在pH6．18時(在未調(diào)pH值的PDA培養(yǎng)基)對人參銹腐病菌菌絲生長抑制作用最強(qiáng)，抑菌率92．50%;其次為pH7，pH9，pH11，抑菌率為82．24%～84．48%;pH5時的抑菌作用較差，抑菌率78．21%。說明偏酸性條件下，Y-S-Y12菌株對人參銹腐病菌的抑菌作用最強(qiáng)。

在pH5～7的偏酸性條件下，Y-S-Y12菌株的發(fā)酵濃縮液對人參銹腐病菌菌絲生長抑制作用最強(qiáng)，其抑菌率為68．59%～69．38%;在堿性條件下抑菌率有下降趨勢(表7)。

表7 不同p H值條件下Y-S-Y12菌株及其發(fā)酵濃縮液對人參銹腐病菌菌絲生長的抑制作用

3 討論

解淀粉芽孢桿菌在其自身的生長過程中可以產(chǎn)生一系列的代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物具有抑制真菌和細(xì)菌的活性［7］，但未見有關(guān)人參病害防治方面的應(yīng)用報道。本研究采用楊樹中分離得到的內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌菌株Y-S-Y12及其發(fā)酵濃縮液進(jìn)行室內(nèi)抑菌試驗(yàn)的結(jié)果表明，對人參銹腐病菌菌絲生長抑菌率分別為95．13%和69．41%;Y-S-Y12菌株發(fā)酵液(含活菌)田間防病試驗(yàn)結(jié)果為人參苗成活率比對照增加了51．82%，對銹腐病的防效75．79%，小區(qū)人參產(chǎn)量比對照增加了154．73%。

據(jù)報道解淀粉芽孢桿菌對多種植物病原菌具有較強(qiáng)的抑菌作用，如抑制花生青枯病菌、柑橘綠霉菌、水稻細(xì)菌性條斑病、對香蕉枯萎病病原菌、辣椒疫霉菌、根癌土壤桿菌、稻瘟病菌和野油菜黃單胞桿菌野油菜致病變種等［8-12］。研究Y-S-Y12菌株及發(fā)酵濃縮液的抑菌譜結(jié)果顯示，對供試的6種植物病原菌菌絲生長均具有較強(qiáng)的抑制作用。其中YS-Y12菌株對楊樹腐爛病菌和人參銹腐病菌的抑制作用最強(qiáng)，其抑菌率分別為100%和96%;其發(fā)酵濃縮液對供試的6種植物病原菌均具有較強(qiáng)的抑菌作用，其中對水稻紋枯病菌的抑菌作用最強(qiáng)，其抑菌率為78．73%。

生防菌劑施用于田間后的溫度、pH等生態(tài)因子都會嚴(yán)重影響生防菌的定殖、存活及有效性。本試驗(yàn)顯示，在10～30℃條件下Y-S-Y12菌株及其發(fā)酵濃縮液對人參銹腐病菌均具有抑菌作用，其中20℃條件下的抑菌作用最強(qiáng)，菌株對菌絲生長的抑菌率為91．46%;發(fā)酵濃縮液對菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑菌率分別為69．45%和81．69%。這與陳成 等［13］的40℃以下解淀粉芽孢桿菌菌株的抑菌活性最強(qiáng)的結(jié)果不吻合。在pH 5～11范圍內(nèi)，Y-S-Y12菌株及發(fā)酵濃縮液對人參銹腐病菌均具有抑菌作用，其中pH6．18的微酸性條件下的菌絲生長抑菌作用最強(qiáng)，抑菌率分別為92．50%和69．38%，這與陳成等［13］的pH在7～8范圍內(nèi)解淀粉芽孢桿菌菌株的抑菌活性最強(qiáng)的結(jié)果也不吻合。本文中的Y-S-Y12菌株對人參銹腐病菌抑菌活性最強(qiáng)的溫度和pH值均與人參銹腐病菌適合生長的溫度和pH值［14-15］相吻合，這可能是Y-S-Y12菌株對人參銹腐病的防效較高的主要原因之一。

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