王 彬 石景柱 易 良 鐘 誠(chéng)（通訊作者）

1）重慶市永川區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)外科 重慶 402160 2）第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院神經(jīng)外科 重慶 400042

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)較常見的一種惡性腫瘤，占成人顱內(nèi)腫瘤的40%～50%。多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，不足5%患者能夠達(dá)到5a的生存期，平均生存期僅26～52周［1-2］。本文研究HCMV 感染和腦膠質(zhì)瘤的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選擇我院神經(jīng)外科2010-05—2012-02 膠質(zhì)瘤患者的手術(shù)標(biāo)本68例，男35例，女33例；年齡4～75歲，平均（38．5±3．5）歲；其中少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤11例，Ⅰ級(jí)星形細(xì)胞瘤7例，Ⅱ級(jí)星形細(xì)胞瘤13例，Ⅲ級(jí)星形細(xì)胞瘤18例，Ⅳ級(jí)星形細(xì)胞瘤13例，間變少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤6例。選取65例外傷腦組織為對(duì)照研究，女31 例，男34 例；年齡5～73歲，平均（37．5±3．0）歲；以上患者術(shù)前未進(jìn)行任何特殊治療，也無其他系統(tǒng)的腫瘤病史。見表1。

表1 2組一般資料比較

1．2 試劑和標(biāo)本 蛋白酶K、氯仿、苯酚、醋酸鈉、異丙醇、無水乙醇等均于國(guó)內(nèi)廠家購(gòu)置；DNA 分子量Marker、PCR Master Mix（北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）。選擇所培養(yǎng)的已經(jīng)感染HCMV 的肺成纖維細(xì)胞的DNA 陽性對(duì)照，人肺成纖維細(xì)胞的DNA 陰性對(duì)照、同時(shí)選擇離子水作空白對(duì)照。選擇65例腦外傷病人的腦組織DNA 進(jìn)行比較。手術(shù)切除組織后立即置入無菌凍存管凍存待檢。

1．3 方法

1．3．1 DNA 提?。壕诔瑑艄ぷ髋_(tái)上進(jìn)行組織的總DNA提取操作。切割-80 ℃保存組織小塊放入Ep管內(nèi)，使用消毒剪剪碎組織后立即加入500μL 的細(xì)胞裂解液、4mL 蛋白酶K，于37 ℃的水浴中過夜處理；使用等體積飽和酚、氯仿和異戊醇依次萃取DNA，使用5μL 3mol·L-1pH 5．2的醋酸鈉和1mL 的預(yù)冷無水乙醇-20 ℃沉淀DNA 過夜處理；離心后于預(yù)冷80%的乙醇洗鹽中，先使用200μL 的TE 緩沖液溶解DNA，再用0．8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳處理，再檢測(cè)DNA 的提取質(zhì)量；使用紫外分光光度計(jì)將DNA 的終濃度定量調(diào)整至0．1μg·μL-1，-20 ℃環(huán)境保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3．2 PCR 擴(kuò)增：選擇20μL 的擴(kuò)增體系。事先對(duì)所有的樣品進(jìn)行β-actin的PCR 擴(kuò)增分析DNA 的質(zhì)量。采用外引物擴(kuò)增體系和條件：PCR MasterMix 2μL，組織DNA 1μL，下游外引物0．4μL，上游外引物0．4μL，加入無菌雙蒸水到20μL。反應(yīng)管置入PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，具體參數(shù)：94℃5min變性，每個(gè)循環(huán)94 ℃40s，然后56 ℃40s，再72 ℃40s，循環(huán)25次后，延伸72 ℃10min。內(nèi)引物擴(kuò)增反應(yīng)體系及參數(shù)同上，循環(huán)30次最后延伸，72 ℃10min。2%的瓊脂糖凝膠100V 電泳30min，于紫外燈下進(jìn)行觀察，采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用卡方檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

正常腦組織中未見到HCMV 基因片段，而膠質(zhì)瘤腦組織的63例DNA 中擴(kuò)增出HCMV 基因片段，5例未擴(kuò)增出HCMV 片段，其中4例Ⅰ級(jí)星形細(xì)胞瘤，1例Ⅱ級(jí)星形細(xì)胞瘤。見表2。

表2 正常腦組織與膠質(zhì)瘤腦組織PCR 擴(kuò)增結(jié)果HCMV 陽性率比較

3 討論

HCMV 是一種皰疹病毒科的β屬雙鏈DNA 病毒，完整的基因組約235kbp，一共編碼約165個(gè)基因。其中HCMV是胞內(nèi)寄生的病毒，正常人群普遍對(duì)其易感。處于隱性感染時(shí)病毒并不會(huì)復(fù)制，也不會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞的病理損害；而當(dāng)病毒發(fā)生活化后則可以復(fù)制和傳播，基因組整合會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化［3-4］。研究表明，HCMV 是一種致瘤因素，參與多種腫瘤發(fā)病，特別是與結(jié)直腸癌、宮頸癌、前列腺癌、霍奇金淋巴瘤等惡性腫瘤的關(guān)系極其密切［5-6］。本研究結(jié)果顯示，68例患者中，63例檢測(cè)出HCMV 基因，65 例正常的腦組織中未檢測(cè)出HCMV 基因，2 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。膠質(zhì)瘤腦組織的63例DNA 中擴(kuò)增出HCMV基因片段，5例未擴(kuò)增出HCMV 片段，其中4例Ⅰ級(jí)星形細(xì)胞瘤，1例Ⅱ級(jí)星形細(xì)胞瘤。HCMV 能夠通過促進(jìn)cyclin E和cyclin D1的過表達(dá)而引起DNA 的復(fù)制發(fā)生異常以及細(xì)胞周期的失調(diào)。發(fā)生于S期的感染則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期的阻滯，使細(xì)胞開始異常增殖，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生，抑制凋亡［7-11］。近年，國(guó)外的多家機(jī)構(gòu)使用免疫組化和原位雜交以及RT-PCR技術(shù)陸續(xù)從腦膠質(zhì)瘤的標(biāo)本中分離出HCMV 的特異性抗原和相關(guān)的DNA 片段，明確HCMV 在腦膠質(zhì)瘤中是存在的［12-13］。Miller［14］分別使用暴露在HCMV 的特異 性抗原免疫細(xì)胞以及針對(duì)HCMV 抗病毒的藥物對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行治療，結(jié)果顯示，患者生存期有明顯延長(zhǎng)，且通過MRI也確認(rèn)病灶有明顯的縮小趨勢(shì)。說明針對(duì)HCMV 進(jìn)行治療，可明顯改善腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后情況［15-16］。最新研究顯示，HCMV 能誘導(dǎo)關(guān)鍵細(xì)胞調(diào)控通路障礙以及細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，具有致瘤性，如引起細(xì)胞周期的調(diào)控失常、基因突變、抑制或促進(jìn)細(xì)胞的凋亡、細(xì)胞免疫耐受、新生血管的形成、調(diào)控宿主合成分泌細(xì)胞因子等。Maussang等將經(jīng)US28基因轉(zhuǎn)染的鼠成纖維細(xì)胞（NIH 3T3細(xì)胞）接種在裸鼠的皮下組織，3周后所有經(jīng)接種的裸鼠均形成腫瘤，同時(shí)空白對(duì)照以及陰性對(duì)照則未見到腫瘤，由此可見HCMV 感染具有致瘤性。Cobbs將HCMV 轉(zhuǎn)入膠質(zhì)瘤細(xì)胞，能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)增強(qiáng)腫瘤的侵襲性。研究顯示，HCMV 的感染會(huì)在膠質(zhì)瘤的發(fā)生以及發(fā)展中起關(guān)鍵作用。近幾年文獻(xiàn)報(bào)道，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和腦膠質(zhì)瘤間存在一種緊密內(nèi)在聯(lián)系。由于神經(jīng)干細(xì)胞的自身基因突變或是轉(zhuǎn)染外源性的基因等可導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化至膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，被稱為腦膠質(zhì)瘤“種子”細(xì)胞，在起源、轉(zhuǎn)移、發(fā)展和復(fù)發(fā)及治療的敏感性等問題上有決定性作用。

綜上所述，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤患者存在HCMV 的感染，其感染的可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生以及發(fā)展中起重要作用。

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