張洪志，徐慶陽(yáng)

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457）

糖水解酶抑制劑，例如淀粉酶抑制劑和葡糖酶抑制劑，是眾所周知的治療和預(yù)防糖尿病、高脂蛋白血癥、高脂血癥、肥胖或由這些疾病引起的其他次要癥狀的藥物。在最早研發(fā)新型α-淀粉酶抑制劑的過(guò)程中，Geng peng等[1]發(fā)現(xiàn)了由天藍(lán)黃鏈霉菌發(fā)酵得到6個(gè)化學(xué)單體，被確定為阿卡波糖（acarbose）的類似物，它們對(duì)豬胰α-淀粉酶具有顯著的抑制作用。這些阿卡波糖類似物有一個(gè)核心結(jié)構(gòu)，即一個(gè)acarviosine中的脫氧葡萄糖單位和一個(gè)正常D-葡萄糖單位間形成脫氧葡萄糖苷鍵，這樣三個(gè)單元形成一個(gè)“假三糖”單位，重復(fù)不同次數(shù)，形成多種擬低聚糖化合物。另外，在不同重復(fù)次數(shù)的假三糖單位兩側(cè)，還可以連接不同數(shù)目的D-葡萄糖單位。據(jù)此，將這些擬低聚糖命名為阿卡他定（acarviostatin），即含有 acarviosine核心的低聚糖。以一個(gè)羅馬數(shù)字表示假三糖單位的重復(fù)次數(shù)，以第一個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字表示非還原端葡萄糖單位的個(gè)數(shù)，以第二個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字表示還原端葡萄糖單位的個(gè)數(shù)。圖1中的6個(gè)擬低聚糖即被命名為阿卡他定I03、阿卡他定II03//阿卡他定III03//阿卡他定IV03、阿卡他定II23和阿卡他定II13[2]。

圖1 阿卡波糖類似物化學(xué)結(jié)構(gòu)

阿卡波糖類似物（acarbose analogues）與阿卡波糖（acarbose）具有相同的核心結(jié)構(gòu)（acarviose），即由4-氨基-4,6-二脫氧葡萄糖和氨基環(huán)醇組成的二單位。因此阿卡波糖類似物擁有與阿卡波糖類似的作用機(jī)制，能夠顯著地抑制α-糖苷酶的活性，延緩碳水化合物在小腸內(nèi)的水解，以維持機(jī)體內(nèi)血糖水平的穩(wěn)定。阿卡波糖類似物較阿卡波糖（acarbose）具有更好的抑制活性[2]，所以阿卡波糖類似物可以被開(kāi)發(fā)成為一種新型的治療Ⅱ型糖尿病的降糖藥物，使它具有服用劑量小、作用時(shí)間長(zhǎng)、安全高效等優(yōu)點(diǎn)。

1 阿卡波糖類似物合成途徑及轉(zhuǎn)運(yùn)途徑

由圖2可知，阿卡波糖是一種含氮的假性四糖，包括氨基環(huán)醇、4-氨基-4,6-二脫氧葡萄糖和一分子麥芽糖三部分。形成一分子的阿卡波糖，理論上需要二分子的葡萄糖和一分子的麥芽糖[3-5]。

圖2 阿卡波糖分子結(jié)構(gòu)圖

1.1 阿卡波糖的合成

游動(dòng)放線菌和鏈霉菌是阿卡波糖的主要產(chǎn)生菌[4]。近年來(lái)，科技工作者一直致力于研究阿卡波糖及其類似物在微生物體內(nèi)合成的具體路徑，以及合成過(guò)程中所運(yùn)用的相關(guān)生物酶，以期為該類藥物的大工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的理論基礎(chǔ)。到現(xiàn)在為止，阿卡波糖及其類似物的生物合成路徑已經(jīng)基本清楚，如圖3所示[6]。

作為一種典型的C7N-氨基環(huán)醇類物質(zhì)，阿卡波糖由氨基環(huán)醇、4-氨基-4,6-雙脫氧葡萄糖和一分子麥芽糖三部分組成，其生物合成途徑可以概括為以下3個(gè)過(guò)程[7]。

1.1.1 氨基環(huán)醇的合成

1）在環(huán)化酶的作用下，7-P-景天庚糖（sedoheptulose7-P）分子內(nèi)環(huán)化得到前體物質(zhì)2-epi-5-epi-valiolone，再磷酸化生成2-epi-5-epi-valiolone-7-phosphate[8]。C-7位的磷酸化是生物體的一種自我保護(hù)機(jī)制[9]。有研究證明，在阿卡波糖的合成過(guò)程中會(huì)生成多種含有C-7環(huán)醇和acarviosyl的物質(zhì)，他們對(duì)細(xì)胞質(zhì)中的許多水解酶（如α-葡萄糖苷酶和葡甘露聚糖酶）有抑制作用。當(dāng)阿卡波糖的氨基環(huán)醇C-7位被磷酸化后，微生物體內(nèi)的糖苷酶等各種生物酶不受阿卡波糖及其類似物的抑制，以保證細(xì)胞對(duì)各種糖源的利用，用以維持細(xì)胞的正常生命代謝活動(dòng)；2）微生物體內(nèi)的差向異構(gòu)酶能夠催化2-epi-5-epi-valiolone-7-P發(fā)生結(jié)構(gòu)的改變，并最終生成5-epi-valiolone-7-P，這個(gè)催化反應(yīng)是由差向異構(gòu)酶獨(dú)自完成的，不需要其他輔助因子的直接參與，而且與任何已知的差向異構(gòu)酶都沒(méi)有相似性，所以它很可能代表了一類全新的差向異構(gòu)酶[8]；3）在NADH-依賴型脫氫酶的作用下，5-epi-valiolone-7-phosphateC-1酮被還原生成 5-epi-valiolol-7-phosphate；4）在脫水酶的作用下，5-epi-valiolone-7-P脫水生成1-epi-valienol-7-phosphate；5）1-epi-valiolone-7-P物質(zhì)的第一位C原子在生物酶的作用下繼續(xù)被磷酸化，生成1-epi-valiolone-1,7-diP，對(duì)于這一步反應(yīng)所用到的生物酶還未明確，但這一步反應(yīng)被認(rèn)為是最重要的一步反應(yīng)；6）1-epi-valiolone-1,7-P在ADP-葡萄糖合酶GlgC的催化作用下，最終生成NDP-1-epi-valiolone-7-P，即氨基環(huán)醇[6]。

圖3 阿卡波糖合成途徑

1.1.2 4-氨基-4,6-雙脫氧葡萄糖的合成

1）D-1-磷酸葡萄糖（D-glucose-1-phosphate）核苷酸化為dTDP-D-葡萄糖。由dTDP-葡萄糖合成酶（AcbA）催化；2）dTDP-D-葡萄糖生成 dTDP-4-酮-6-脫氧-葡萄糖。由dTDP-葡萄糖-4,6-脫水酶（AcbB）催化；3）dTDP-4-酮-6-脫氧-葡萄糖生成dTDP-4-氨基-4,6-雙脫氧葡萄糖[10]。

1.1.3 阿卡波糖及其類似物的合成

1）NDP-1-epi-valienol-7-P 和 dTDP-4-氨基-4,6-雙脫氧-葡萄糖在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下結(jié)合生成dTDP-acarviose-7-P。目前的研究認(rèn)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的合成到此為止全部完成，但是dTDP-acarviose-7-P不是唯一的終產(chǎn)物，它還有可能再結(jié)合 1～2 個(gè)單糖基[6]；2）dTDP-acarviose-7-P 以及結(jié)合了不同數(shù)目糖基的dTDP-acarviose-7-P-Glc(n)在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的幫助下轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外，然后在轉(zhuǎn)移酶作用下與麥芽糖結(jié)合，生成阿卡波糖[12]。事實(shí)上，這一過(guò)程中還生成了許多阿卡波糖的類似物（圖 4）。

圖4 阿卡波糖及其類似物

1.2 阿卡波糖類似物的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑

當(dāng)微生物所處的環(huán)境中缺少單糖葡萄糖等能源物質(zhì)時(shí)，微生物體內(nèi)合成的acarbose-7-P以及其他的一些類似物就會(huì)通過(guò)細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)移至菌體外，與環(huán)境中存在的多糖鏈以及寡糖結(jié)合生成結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜的阿卡波糖類似物。然后這種復(fù)合物再通過(guò)細(xì)胞膜上另外一種通道蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)作用轉(zhuǎn)移至菌體內(nèi)，在各種生物酶的催化作用下，這種復(fù)合物重新水解成阿卡波糖的核心結(jié)構(gòu)（acarviose）和多糖鏈或者寡糖，多糖或者寡糖進(jìn)入微生物的代謝系統(tǒng)被菌體吸收，而核心結(jié)構(gòu)（acarviose）在通道蛋白的作用下又被轉(zhuǎn)運(yùn)到菌體外，連續(xù)地進(jìn)行多糖或者寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)[12]。在轉(zhuǎn)運(yùn)能源物質(zhì)的過(guò)程中，所生成的復(fù)合物在體外酶的作用下能夠與核心結(jié)構(gòu)（acarviose）或者其他的多糖鏈發(fā)生化合反應(yīng)，生成分子結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的化合物，由于這類化合物與阿卡波糖一樣能夠顯著地抑制α-糖苷酶的生物活性，因此我們稱這類化合物為“阿卡波糖類似物”。阿卡波糖類似物的合成過(guò)程如圖5所示[2]。

2 阿卡波糖類似物發(fā)酵工藝研究

2.1 碳源的影響

阿卡波糖類似物的核心結(jié)構(gòu)（acarviose）是具有假性三糖的結(jié)構(gòu)，這說(shuō)明該類物質(zhì)在微生物體內(nèi)的生物合成與周圍環(huán)境中的碳源有著非常緊密的聯(lián)系，碳源的種類以及碳源的濃度都會(huì)對(duì)菌體的代謝以及目的產(chǎn)物的合成產(chǎn)生巨大的影響，因此優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源種類以及碳源的濃度對(duì)提高阿卡波糖類似物的產(chǎn)量有十分重要的意義。

Choi B T等[13]對(duì)放線菌CKD發(fā)酵生產(chǎn)阿卡波糖做了深入的研究，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄糖、麥芽糖既是阿卡波糖的能源物質(zhì)又是其合成的前體物質(zhì)，葡萄糖在發(fā)酵早期就被耗盡，而麥芽糖在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中緩慢地被利用，并且在葡萄糖耗盡之后，充當(dāng)能源物質(zhì)。同時(shí)，因?yàn)辂溠刻菚?huì)直接摻入阿卡波糖的結(jié)構(gòu)中，所以葡萄糖在早期耗完之后，后期麥芽糖含量減少會(huì)顯著制約阿卡波糖的產(chǎn)量，因此必須嚴(yán)格控制葡萄糖的含量并保持麥芽糖在發(fā)酵液中的高濃度來(lái)促進(jìn)阿卡波糖的合成。

程新[14]等人的研究結(jié)果表明，當(dāng)選用麥芽糖和葡萄糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基中的碳源，且其配比（質(zhì)量比）分別為 3∶1 和 4∶1 時(shí)，最利于阿卡波糖的合成。在游動(dòng)放線菌A-5.6發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)碳源的選擇和補(bǔ)加，使發(fā)酵液的總糖濃度保持在合適的水平，可以大幅提高阿卡波糖的產(chǎn)量。

2.2 氮源的影響

氮源可以分為有機(jī)氮源與無(wú)機(jī)氮源，有機(jī)氮源是指含有氮元素的有機(jī)物，比如玉米漿、豆?jié)?、黃豆餅粉、蛋白胨以及酵母粉等；無(wú)機(jī)氮源分子結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，屬于無(wú)機(jī)物，比如氯化銨、硝酸銨等[15]。氮源對(duì)于微生物的生長(zhǎng)具有重要的促進(jìn)作用，微生物體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸分子的生物合成過(guò)程均需要氮元素的參與。因此，培養(yǎng)基中氮源的種類以及氮源的濃度對(duì)微生物的生長(zhǎng)和繁殖均有十分重要的影響。

圖5 阿卡波糖類似物合成途徑

在阿卡波糖類似物的核心結(jié)構(gòu)（acarviose）中也存在著一個(gè)氮原子，說(shuō)明培養(yǎng)基中的氮源與阿卡波糖類似物的合成有著非常重要的關(guān)系。Lee S等[16]采用同位素標(biāo)記法探索核心結(jié)構(gòu)（acarviose）中N原子的來(lái)源，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明核心結(jié)構(gòu)（acarviose）中的N原子大部分來(lái)源于谷氨酸的α-N，少部分來(lái)自谷氨酰胺中的α-N以及氯化銨中標(biāo)記的N原子。這就說(shuō)明，谷氨酸的α-N是核心結(jié)構(gòu)（acarviose）中N原子的直接來(lái)源，谷氨酸可以作為前體物質(zhì)直接添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中。

2.3 滲透壓的影響

在阿卡波糖的發(fā)酵過(guò)程中，滲透壓對(duì)其產(chǎn)量有著決定性的作用。一方面由于在阿卡波糖的生物合成中麥芽糖可直接滲入阿卡波糖的分子結(jié)構(gòu)中，提高培養(yǎng)液的滲透壓，可促進(jìn)麥芽糖向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，從而提高阿卡波糖的產(chǎn)率；另一方面，碳源濃度過(guò)高會(huì)使培養(yǎng)基的滲透壓過(guò)高，影響菌體的生長(zhǎng)和代謝，產(chǎn)生分解代謝物阻遏效應(yīng)，降低產(chǎn)物的濃度。因此，在發(fā)酵過(guò)程中，要嚴(yán)格控制培養(yǎng)基的組成及滲透壓。Beunink J等[17]利用游動(dòng)放線菌合成阿卡波糖，發(fā)現(xiàn)阿卡波糖的產(chǎn)量與培養(yǎng)液的滲透壓有著密切的關(guān)系。最適宜的滲透壓值為400 mOsm/kg，高于或低于該值，阿卡波糖的產(chǎn)量都會(huì)下降，滲透壓過(guò)高或過(guò)低時(shí)，甚至沒(méi)有阿卡波糖的產(chǎn)生。

3 展望

口服α-淀粉酶/糖苷酶抑制劑因能直接延緩腸道中淀粉的消化和吸收，進(jìn)而有效降低餐后高血糖，因此已成為最便捷安全有效的一線降糖藥物之一。目前市售α-淀粉酶/糖苷酶抑制劑主要是阿卡波糖的各類制品，其專利為國(guó)外機(jī)構(gòu)所有。而目前國(guó)內(nèi)的α-淀粉酶/糖苷酶抑制劑制品也多是阿卡波糖的仿制品，競(jìng)爭(zhēng)力較低。因此開(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的，生物活性強(qiáng)于阿卡波糖的新型α-淀粉酶/糖苷酶抑制劑具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

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