張培培　周悅　董海焦　殷貴宏　李在峰　劉大群

摘要：為了明確周麥11、西農(nóng)1163-4抗葉銹病基因與周8425B中LrZH84的關系，用葉銹菌小種THTT接種周麥11/中國春的145個F2單株，而另一葉銹菌生理小種FHTT分別接種周麥11/中國春的285個F2單株、西農(nóng)1163-4/Thatcher的232個F2單株；2個與LrZH84緊密連鎖的標記gwm582、ω-secalin/Glu-B3用于檢測3個群體中是否攜帶抗葉銹病基因LrZH84。結(jié)果顯示：周麥11對葉銹菌生理小種THTT的抗性由2個顯性抗病基因控制，經(jīng)標記檢測發(fā)現(xiàn)，周麥11中1個抗病基因是LrZH84，另1個抗葉銹病基因為未知基因；周麥11對葉銹菌生理小種FHTT的抗性由單基因控制，標記檢測發(fā)現(xiàn)該基因不同于LrZH84，為未知抗葉銹病基因；西農(nóng)1163-4對葉銹菌生理小種FHTT的抗性由單基因控制，分子標記檢測結(jié)果表明，該基因可能為LrXi，由于LrZH84對FHTT表現(xiàn)感病，表明LrXi不同于LrZH84。通過研究證實，周麥11中含有LrZH84和1個未知的抗葉銹病基因，西農(nóng)1163-4中的抗葉銹病基因LrXi與LrZH84不同；同時，周麥11、西農(nóng)1163-4中可能還含有其他抗病基因，有待進一步研究。研究將為抗病基因聚合、基因布局、培育抗病新品種奠定理論基礎。

關鍵詞：小麥；抗葉銹病基因；基因鑒定；周麥11；西農(nóng)1163-4；周8425B；LrZH84

中圖分類號：S435.121.4+3 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）10-0033-03

禾本科作物小麥（Triticum aestivum L.）是全世界重要的糧食作物，其總產(chǎn)量僅次于玉米，至今已有5 000多年的種植歷史，全世界35%～40%的人口以小麥為主糧。小麥葉銹病是由小麥葉銹菌（Puccinia triticina）引起的世界性病害，主要為害小麥葉片，很少發(fā)生在葉鞘及莖稈上，小麥葉銹病主要通過影響小麥的光合作用而最終影響小麥產(chǎn)量，其在全球小麥種植區(qū)包括北美洲、歐洲、亞洲、澳洲、非洲等許多國家都有發(fā)生，在流行年份會造成高達40%的產(chǎn)量損失[1]，我國分別于1969、1973、1975、1979、2012年發(fā)生5次小麥葉銹病大流行[2]。雖然殺菌劑可以控制小麥銹病的發(fā)生與危害，但是培育和利用抗銹病的小麥品種，科學地在時間和空間上布局含有不同抗性基因的小麥品種，對于防止葉銹病大暴發(fā)，是最為經(jīng)濟、環(huán)保、有效的措施。

小麥抗葉銹性主要包括垂直、水平抗性兩類。垂直抗性又稱生理小種?；剐浴①|(zhì)量性狀抗性、苗期抗性或主效基因抗性等，它在遺傳上受1個或少數(shù)幾個主效基因控制，受環(huán)境影響小，抗性易喪失；水平抗性又稱非小種專化抗性、數(shù)量性狀抗性或微效基因抗病性，也叫成株慢銹性，在遺傳上受多個微效基因控制，受環(huán)境影響大，抗性較為持久[3]。到目前為止，已有72個抗葉銹病基因被正式命名[4]，其中慢銹性基因只有Lr34、Lr46、Lr67、Lr68[5-9]，大多數(shù)為小種?；剐曰颉＿@些抗病基因符合基因?qū)蚣僬f，往往會由于病菌小種的變異而很快“喪失”抗性。目前，我國小麥中有效抗病基因缺乏，僅有少數(shù)幾個抗病基因，如Lr9、Lr19、Lr24、Lr38等對我國的小麥葉銹菌具有良好抗性[10]。因此，研究我國小麥抗葉銹病遺傳規(guī)律，不斷發(fā)掘和定位我國小麥材料中的抗葉銹病基因，對利用基因操作持久控制小麥葉銹病具有重要的理論和實際意義。近年來，筆者所在實驗室在小麥葉銹病的研究方面取得了一定進展，Zhao等在小麥品種周8425B中定位了1個苗期抗病基因LrZH84，位于1BL染色體上，該基因與SSR標記gwm582、barc8緊密連鎖；此外發(fā)現(xiàn)，周8425B中還攜帶已知抗葉銹病基因Lr26，目前Lr26對我國多數(shù)葉銹菌生理小種已喪失抗性[11]。李星等在西農(nóng)1163-4中定位了1個苗期抗病基因LrXi，該基因同樣位于1BL染色體上，并且位置與LrZH84接近[12]。Zhou等通過等位性檢測試驗發(fā)現(xiàn)，LrZH84、LrXi位置相近，為等位基因或者緊密連鎖的2個基因[13]。

周麥11（豫麥51 號）為河南省周口市農(nóng)業(yè)科學院雜交育成的新品種，具有高抗小麥葉銹病、條銹病、白粉病、赤霉病以及高產(chǎn)等特點，在抗病育種和生產(chǎn)上具有重要應用價值。周麥11來自于周8425B/豫麥17，抗性比周8425B好，利用周麥11和中國春雜交得到的F2群體可確定周麥11中的抗葉銹基因，還可進一步確定周麥11中的抗病基因與LrZH84的關系。西農(nóng)1163-4對中國大多數(shù)小種表現(xiàn)為高抗。LrZH84、LrXi為等位基因，但是這2個基因是否為同一個基因有待進一步研究。本試驗的目的就是確定周麥11中的抗病基因和LrZH84的關系，以及LrZH84和LrXi的關系，以期為抗病基因聚合、基因布局和培育抗病新品種奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 小麥材料與葉銹菌菌種

抗病親本周麥11與感病親本中國春進行雜交自交獲得了2個F2群體，群體大小分別為145、285個單株，抗病親本西農(nóng)1163-4、感病親本Thatcher進行雜交自交獲得了232個F2單株。供試菌種材料為THTT、FHTT，由河北農(nóng)業(yè)大學銹病研究中心保存，致病類型按Long等的小麥葉銹菌密碼命名系統(tǒng)（Prt-code System）[14]命名。

1.2 菌種的純化及擴繁

將菌種于冰箱中取出，在40～45 ℃水中活化5～10 min，然后于黑暗水化10 h；水化后，采用涂抹法將菌種接種于感病品種鄭州5389上。當?shù)?張葉片完全伸展時，先用手指蘸取清水脫除葉片表面臘質(zhì)層，以便于葉銹菌的侵染，再將葉銹菌孢子輕涂于葉片正面。接種后噴灑0.05%吐溫液，在黑暗中保濕16～24 h后，置于溫室內(nèi)。葉片現(xiàn)斑時，進行單侵染點分離。分離后放置于光照培養(yǎng)箱中，采用培養(yǎng)溫度18 ℃、光照時間14 h進行離體培養(yǎng)。接種6～7 d后，葉片上出現(xiàn)孢子堆，10 d左右孢子堆成熟。因單個孢子堆獲得的菌量太少，先在離體的完整葉片上進行1次繁殖，待孢子堆成熟后接種于感病品種鄭州5389上進行菌種的擴繁。

1.3 苗期抗葉銹菌鑒定

周麥11/中國春的145個F2單株群體接種葉銹菌生理小種THTT，周麥11/中國春的285個F2單株、西農(nóng)1163-4/Thatcher的232個F2單株接種葉銹菌生理小種FHTT。THTT對中國春有致病力，對西農(nóng)1163-4、周麥11、周8425B均無致病力；FHTT對周8425B、中國春、Thatcher有致病力，對西農(nóng)1163-4、周麥11均無致病力。鑒定材料種植于溫室中，當小麥的第1張葉片完全展開時，用掃抹法接種小麥葉銹菌菌種。接種后，在15 ℃、100%相對濕度條件下黑暗放置24 h，之后轉(zhuǎn)入溫室中。接種后15 d發(fā)病充分時，進行表型鑒定，鑒定時按照0、；、1、2、3、4等6級標準調(diào)查記載反應型[15]。根據(jù)F2代植株的抗感分離比例，確定這些材料中所含抗葉銹基因的遺傳方式，用卡方值檢驗其適合度。

1.4 DNA提取

參照Sharp等提供的CTAB法[16]提取小麥葉片基因組DNA，用紫外分光光度計測定DNA濃度、相對純度，用ddH2O將DNA稀釋成濃度為50 ng/μL備用。

1.5 分子標記檢測

2個與LrZH84緊密連鎖的標記gwm582、ω-secalin/Glu-B3[11]用于檢測周麥11與中國春、西農(nóng)1163-4與Thatcher雜交并自交所得的F2群體。PCR反應體系及反應程序見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 周麥11抗葉銹病基因的遺傳解析

葉銹菌生理小種THTT在苗期接種周麥11、中國春及其雜交自交獲得的145個F2單株，抗病鑒定結(jié)果（表2）表明，周麥11對葉銹菌生理小種THTT表現(xiàn)為高抗（反應型為1），中國春表現(xiàn)為高感（反應型為4）；145個F2單株中，137株表現(xiàn)為抗?。ǚ磻蜑?～2），8株表現(xiàn)為感病（反應型為3～4）。經(jīng)過卡方（χ2）檢驗其適合度，結(jié)果表明后代符合15 ∶ 1的分離比（χ215 ∶ 1 =0.133，1df，P>0.25），說明周麥11的抗性由2對抗葉銹病基因控制。苗期基因推導結(jié)果顯示，所有對周8425B表現(xiàn)無毒性的小種（PHQT、FCQR、FCST、PCBT、TCGT、PGSN、FGSQ、FKQT、PCHS、FBHT、FHST、PHSS、FHGS、FHTS、PGTT、PCJT、PHST、FHHQ、FHTR、PHJT、THTT、FCTT、PCGR）對周麥11均表現(xiàn)抗病[17-18]，由于周麥11來源于周8425B和豫麥17，因此周麥11中1個抗病基因可能是LrZH84，而另1個抗病基因則可能來源于豫麥17。進一步用2個與LrZH84緊密連鎖的標記gwm582、ω-secalin/Glu-B3檢測8個感病單株，全部為感病親本中國春的帶型，這就證實周麥11中1個抗病基因為LrZH84。

在另1個苗期試驗中，葉銹菌小種FHTT接種周8425B、周麥11、中國春、周麥11/中國春的285個F2單株，鑒定結(jié)果（表2）顯示，周麥11對葉銹菌生理小種FHTT表現(xiàn)抗病（反應型為1）；周8425B、中國春均表現(xiàn)感病（反應型為4）；285個F2單株中，220株表現(xiàn)為抗病（反應型為0～2），65株表現(xiàn)為感?。ǚ磻蜑?～4）。經(jīng)過卡方（χ2）檢驗其適合度，結(jié)果表明后代符合3 ∶ 1的分離比（χ23 ∶ 1=0.730 9，1df，P>0.25），說明周麥11對葉銹菌生理小種FHTT的抗性由1對基因控制。2個與LrZH84緊密連鎖的標記gwm582、ω-secalin/Glu-B3檢測10個抗病單株、10個感病單株，結(jié)果表明該抗病基因與LrZH84位置不同。由于LrZH84對小種FHTT感病，因此周麥11中對FHTT的抗性由另外1個未知小麥抗葉銹病基因提供。

2.2 西農(nóng)1163-4中抗葉銹病基因與LrZH84的關系

葉銹菌小種FHTT接種周8425B、西農(nóng)1163-4、Thatcher，以及西農(nóng)1163-4、Thatcher雜交自交所得232個F2單株。

表3結(jié)果顯示，周8425B表現(xiàn)感病，反應型為4級；西農(nóng)1163-4對葉銹菌生理小種FHTT表現(xiàn)為高抗，反應型為1；Thatcher表現(xiàn)為高感，反應型為4；232個F2單株中，172個單株表現(xiàn)為抗?。ǚ磻蜑?～2），60個單株表現(xiàn)為感?。ǚ磻蜑?～4）。經(jīng)過卡方（χ2）檢驗其適合度，結(jié)果表明后代符合3 ∶ 1的分離比（χ23 ∶ 1=0.092，1df，P>0.75），說明西農(nóng)1163-4的抗性由1對抗葉銹病基因控制。2個與LrZH84緊密連鎖的標記gwm582、ω-secalin/Glu-B3檢測西農(nóng)1163-4、Thatcher雜交所得的10個抗病單株和10個感病單株，電泳結(jié)果表明，該基因同標記是緊密連鎖的，根據(jù)其位置可知[12]，小種FHTT鑒定出的抗病基因很可能是LrXi。這些結(jié)果表明，LrXi對FHTT表現(xiàn)抗性，而LrZH84對FHTT表現(xiàn)感病，由此可知盡管LrXi、LrZH84的位置相同或相近[13]，但它們卻是2個不同的抗病基因。

3 結(jié)論與討論

3.1 周麥11、西農(nóng)1163-4中的抗病基因

周麥11抗性優(yōu)于周8425B，根據(jù)試驗結(jié)果可知，周麥11中除了攜帶LrZH84外還有1個未知的抗葉銹病基因，目前正在進行該基因的定位工作。西農(nóng)1163-4對中國的大多數(shù)生理小種表現(xiàn)為抗病[12]，抗性優(yōu)于周8425B，可能還含有其他抗葉銹病基因，需要利用其他生理小種進行進一步鑒定。目前發(fā)現(xiàn)的多數(shù)小麥抗葉銹病基因具有小種專化性，當新毒性小種出現(xiàn)時其抗病性就會喪失，因此在生產(chǎn)上需要不斷發(fā)掘和定位新抗病基因來應對新毒性小種的不斷涌現(xiàn)，周麥11、西農(nóng)1163-4都有良好的抗病性，明確其中所攜帶的抗病基因是非常有必要的。

3.2 我國小麥抗葉銹病育種

我國抗葉銹小麥資源豐富，但對于我國小麥品種及種質(zhì)中的抗葉銹基因及基因布局了解很少。早在20世紀70年代攜帶有1BL.1RS易位系（Lr26）的品種如洛夫林13、山前麥、高加索、牛朱特及其的衍生品系被廣泛運用于我國小麥育種[19]，結(jié)果導致一半以上的小麥攜帶1BL.1RS易位系[17，20]，造成我國小麥抗葉銹基因單一，新葉銹菌生理小種的產(chǎn)生使得Lr26對目前葉銹菌喪失了抗性。因此，使用多系品種、聚合育種、抗病品種的合理布局、利用成株慢銹性品種等方法，可以有效地防止抗病基因的喪失，這些方法的核心是實現(xiàn)抗病基因的合理利用，使抗病基因和病菌毒性基因互作趨于穩(wěn)定狀態(tài)，從而延緩毒性小種產(chǎn)生和發(fā)展。無論采取何種途徑，要實現(xiàn)小麥品種抗葉銹病基因多樣化，必須掌握豐富的明確抗病基因的抗源，只有了解抗源的基因背景和抗病基因遺傳特點，才能對其合理利用。因此，廣泛收集抗源并對其抗病基因進行鑒別，了解不同抗病基因的遺傳特點，有助于合理并有效地利用抗病基因；同時應在小麥育種中發(fā)掘和利用新的抗病基因，擴大與充實抗病基因庫，為培育抗病品種提供更加豐富廣泛的抗源和抗病基因。

參考文獻：

[1]Knott D R. The wheat rusts-breeding for resistance[M]. Berlin Heidelberg：Springer-Verlag，1989.

[2]Zhou H，Xia X，He Z，et al. Molecular mapping of leaf rust resistance gene LrNJ97 in Chinese wheat line Neijiang 977671[J]. Theoretical and Applied Genetics，2013，126（8）：2141-2147.

[3]何中虎，蘭彩霞，陳新民，等. 小麥條銹病和白粉病成株抗性研究進展與展望[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2011，44（11）：2193-2215.

[4]McIntosh R A，Yamazaki Y，Dubcovsky J，et al. Catalogue of gene symbols for wheat：2013 supplement[EB/OL]. http：//www.shigen.nig.ac.jp/wheat/komugi/genes/macgene/2013/GeneCatalogueIntroduction.pdf

[5]Dyck P L. Genetics of leaf rust reaction in three introductions of common wheat[J]. Canadian Journal of Genetics and Cytology，1977，19（4）：711-716.

[6]Singh R P，Mujeeb-Kazi A，Huerta-Espino J. Lr46：a gene conferring slow-rusting resistance to leaf rust in wheat[J]. Phytopathology，1998，88（9）：890-894.

[7]Herrera-Foessel S A，Lagudah E S，Huerta-Espino J，et al. New slow-rusting leaf rust and stripe rust resistance genes Lr67 and Yr46 in wheat are pleiotropic or closely linked[J]. Theoretical and Applied Genetics，2011，122（1）：239-249.

[8]Herrera-Foessel S A. Singh R P，Huerta-Espino J，et al. Lr68：a new gene conferring slow rusting resistance to leaf rust in wheat[J]. Theoretical and Applied Genetics，2012，124（8）：1475-1486.

[9]Li Z F，Lan C X，He Z H，et al. Overview and application of QTL for adult plant resistance to leaf rust and powdery mildew in wheat[J]. Crop Science，2014，54（5）：1907-1925.

[10]袁軍海，劉太國，陳萬權(quán). 中國47個小麥新品種（系）苗期抗葉銹基因推導[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2007，40（9）：1925-1935.

[11]Zhao X L，Zheng T C，Xia X C，et al. Molecular mapping of leaf rust resistance gene LrZH84 in Chinese wheat line Zhou 8425B[J]. Theoretical and Applied Genetics，2008，117（7）：1069-1075.

[12]李 星，李在峰，李亞寧，等. 小麥品系西農(nóng)1163-4抗葉銹病基因的遺傳分析和分子作圖[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2010，43（12）：2397-2402.

[13]Zhou Y，Xia X，He Z，et al. Fine mapping of leaf rust resistance gene LrZH84 using expressed sequence tag and sequence-tagged site markers，and allelism with other genes on wheat chromosome 1B[J]. Phytopathology，2013，103（2）：169-174.

[14]Long D L，Kolmer J A. A North American system of nomenclature for Puccinia recondita f. sp. tritici[J]. Phytopathology，1989，79：525-529.

[15]Roelfs A P，Singh R P，Saari E E. Rust diseases of wheat：concepts and methods of disease management[M]. Mexico：CIMMYT，1992.

[16]Sharp P J，Kreis M，Shewry P R，et al. Location of β-amylase sequences in wheat and its relatives[J]. Theoretical and Applied Genetics，1988，75（2）：286-290.

[17]Li Z F，Xia X C，He Z H，et al. Seedling and slow rusting resistance to leaf rust in Chinese wheat cultivars[J]. Plant Disease，2010，94（1）：45-53.

[18]Luig N H，McIntosh R A. Location and linkage of genes on wheat chromosome 2D[J]. Canadian Journal of Genetics and Cytology，1968，10，99-105.

[19]He Z H，Rajaram S，Xin Z Y，et al.A History of wheat breeding in China[M]. Mexico：CIMMYT，2001.

[20]吳立人，楊華安，袁文煥，等. 1985—1990年我國小麥條銹菌生理?；芯縖J]. 植物病理學報，1993，23（3）：79-84.李 娟，曹芳芳，權(quán) 哲，等. 山葡萄黃烷酮3-羥化酶VamF3H基因及其克隆[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2015，43（10）：36-40.