宋輝　趙術(shù)珍　侯蕾　喬善良　趙傳志　李?lèi)?ài)芹　王興軍

摘要：脂肪氧合酶（lipoxygenases，LOX）是生物體內(nèi)一種重要的雙加氧酶，其在植物發(fā)育以及響應(yīng)生物和非生物脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用。本研究從Arachis duranensis和Arachis ipaensis兩個(gè)野生花生基因組中各鑒定出18個(gè)LOX基因，分別命名為AdLOX1～18和AiLOX1～18。在AdLOX5、AdLOX7、AiLOX8和AiLOX18基因的CDS序列中發(fā)現(xiàn)提前終止翻譯的終止密碼子，而AiLOX9基因的CDS序列過(guò)短，推測(cè)這些基因可能是假基因。染色體定位結(jié)果顯示，AdLOX和AiLOX基因主要分布在2、3、6、8、9和10號(hào)染色體上，且其直系同源基因分布在兩套染色體相同或相近的位置。通過(guò)分析AdLOX和AiLOX基因與已知功能LOX基因的親緣關(guān)系發(fā)現(xiàn)，AdLOX6、、AdLOX9、AdLOX11、AdLOX12、AdLOX17、AiLOX1、AiLOX4、AiLOX6、AiLOX16和AiLOX17基因可能參與花生的抗病過(guò)程，啟動(dòng)子分析結(jié)果也支持這一結(jié)論?；蜻x擇壓力研究表明，AdLOX和AiLOX基因在進(jìn)化歷程中受到純化選擇。

關(guān)鍵詞：野生花生；LOX基因家族；抗病；系統(tǒng)發(fā)育；選擇壓力

中圖分類(lèi)號(hào)：S656.201

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A

文章編號(hào)：1001-4942（2015）10-0001-07

花生（Arachis hypogaea L.）作為重要的油料經(jīng)濟(jì)作物被廣泛地種植在熱帶和亞熱帶地區(qū)。目前，花生屬中已經(jīng)鑒定了80個(gè)種。大多數(shù)的野生花生為二倍體，而栽培花生為異源四倍體（AABB）植物。大量研究表明，栽培花生的二倍體祖先分別是提供A基因組的Arachis duranensis和提供B基因組的Arachis ipaensis。栽培花生對(duì)多種病蟲(chóng)害的抗性低，近年來(lái)，病蟲(chóng)害危害嚴(yán)重，造成花生大面積減產(chǎn)。而野生花生由于長(zhǎng)期適應(yīng)不同的惡劣環(huán)境，對(duì)病蟲(chóng)害有很高的抗性，甚至對(duì)有些嚴(yán)重影響栽培花生的病害免疫。因此，研究野生花生對(duì)病原菌的抗性機(jī)理，鑒定、挖掘野生花生中的抗病基因資源，對(duì)培育抗病能力強(qiáng)的優(yōu)異花生新品種具有重要意義。2014年，A.duranensis和A.ipaensis全基因組測(cè)序工作已經(jīng)完成，為從全基因組水平上分析和鑒定野生花生的抗病基因、研究其抗病機(jī)理奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

LOX蛋白是一種非血紅素鐵酶（non-hemeiron containing enzymes），該酶廣泛地分布在動(dòng)物、植物和微生物中。其主要功能是通過(guò)LOX途徑降低多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fattyacids）的含量。在LOX途徑中，過(guò)氧化氫物（hydroperoxides）被轉(zhuǎn)化為氧化脂類(lèi)（oxylipins），而氧化脂類(lèi)能激活LOX途徑下游的多種酶，包括過(guò)氧化氫裂解酶（hydroperoxide lyase）、過(guò)氧化氫環(huán)化酶（peroxygenase）、丙二烯氧合酶（allene oxide synthase）和二乙烯基醚合酶（divinyl ether synthase）。在植物中，氧化脂類(lèi)和其衍生物，例如茉莉酸和乙醛等，已經(jīng)被證實(shí)參與植物的抗病和抗蟲(chóng)等過(guò)程。因此，研究LOX基因?qū)﹃U明植物的抗病和抗蟲(chóng)機(jī)理具有重要的作用。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，AtLOX2基因被確定參與茉莉酸途徑；當(dāng)擬南芥受到生物脅迫時(shí)，AtLOX1基因的表達(dá)也會(huì)上調(diào)。栽培花生LOX基因在抗病方面的研究已有報(bào)道。Burow等克隆了栽培花生AhLOX1基因，當(dāng)花生受到茉莉酸、傷害和曲霉侵染時(shí)，該基因的表達(dá)會(huì)顯著提高。在栽培花生成熟種子中過(guò)量表達(dá)AhLOX2和AhLOX3基因，會(huì)提高其抵御黃曲霉侵染的能力。但花生LOX基因家族的系統(tǒng)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

目前，關(guān)于LOX基因家族的分類(lèi)主要有兩種方法。第一種方法是根據(jù)亞油酸（linoleic acid）被氧化的順序分為9-LOX（C-atom 9）和13-LOX（C-atom 13）。第二種方法是根據(jù)氨基酸序列的相似性將LOX基因分為T(mén)ype I-LOX和TypeⅡ-LOX，Type I-LOX的序列相似性約為75%，其N(xiāo)段缺少一段葉綠體運(yùn)輸多肽；而TypeⅡ-LOX的序列相似性約為35%，其N(xiāo)段存在葉綠體運(yùn)輸多肽，且具有13-LOX活性。

本研究利用生物信息學(xué)方法從A.duranensis和A.ipaensis基因組中分別鑒定出18個(gè)LOX基因，從分子系統(tǒng)進(jìn)化、染色體定位和選擇壓力方面對(duì)AdLOX和AiLOX基因進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，并參考已報(bào)道的參與植物免疫過(guò)程的LOX基因，預(yù)測(cè)了在A.duranensis和A.ipaensis中參與植物免疫反應(yīng)的LOX基因。

1材料與方法

1.1二倍體野生花生LOX基因序列的獲得

從花生基因組計(jì)劃網(wǎng)站（http：//peanutbase.org/）下載A.duranensis和A.ipaensis基因組序列。以A.duranensis和A.ipaensis的氨基酸序列作為數(shù)據(jù)庫(kù)，使用Lipoxygenase結(jié)構(gòu)域（PF00305.15）作為查詢(xún)序列，采用HMMER程序分別搜尋以上兩個(gè)物種的LOX氨基酸序列。將得到的所有序列重新提交到Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)，剔除只含有Lipoxygenase結(jié)構(gòu)域的序列，保留同時(shí)含有Lipoxygenase和PLAT/LH兩種結(jié)構(gòu)域的序列。

1.2LOX基因的系統(tǒng)進(jìn)化和染色體定位分析

為對(duì)AdLOX和AiLOX基因進(jìn)行分類(lèi)和明確其進(jìn)化關(guān)系，本研究在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了單子葉植物大麥（Hordeum vulgare）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）和小麥（Triticum aestivum）以及雙子葉植物擬南芥、花生、大豆（Glycine max）、豌豆（Pisum sativum）和菜豆（Phaseolus vulgaris）的LOX基因信息，使用MEGA 6.0軟件對(duì)下載的LOX氨基酸序列及AdLOX和AiLOX氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)采用鄰接法（NJ），自舉值（bootstrap）設(shè)置為1000。另外，為挖掘兩種二倍體野生花生LOX基因的直系同源基因，使用AdLOX和AiLOX氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如果AdLOX和AiLOX聚集在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)末端的同一個(gè)分支上，則認(rèn)為該基因?qū)橹毕低椿?。endprint

AdLOX和AiLOX基因在染色體上的定位信息從公布基因組序列的在線數(shù)據(jù)庫(kù)http：//pea-nutbase.org/獲得。使用MapInspect軟件（http：//mapinspect.software.informer.com/）構(gòu)建基因的染色體定位圖。

1.3LOX基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

順式作用元件（cis-acting element）位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游區(qū)域，具有調(diào)控基因表達(dá)的功能。為預(yù)測(cè)抗病相關(guān)LOX基因的順式元件，本研究使用在線數(shù)據(jù)庫(kù)PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）作為分析工具、以轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)上游2000bp序列作為分析序列進(jìn)行分析。

1.4選擇壓力分析

基因在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)受不同的選擇壓力。評(píng)價(jià)基因在進(jìn)化中所受選擇壓力的參數(shù)主要有兩個(gè)：同一性替換（synonymous substitution，Ks）和非同一性替換（Non-synonymous substitution，Ka）。如果Ka/Ks>1，則表示受正選擇壓力；Ka/Ks=1，表示受中性選擇；Ka/Ks<1，表示受純化選擇。本研究使用PAML程序的位點(diǎn)模型（site model）分別計(jì)算AdLOX和AiLOX蛋白在進(jìn)化中所受的選擇壓力。設(shè)置M0（one ratio）、M1a（neutral）、M2a（selection）、M3（discrete）、M7（β）和M8[（β+ω）>1]6種計(jì)算模型，根據(jù)LRT的值判斷在M1a vs M2a、M0 vs M3和M7 vs M8下的選擇壓力。

2結(jié)果與分析

2.1LOX基因的鑒定與分類(lèi)

本研究使用HMMER程序共檢測(cè)到23條AdLOX和25條AiLOX氨基酸序列含有Lipoxygenase結(jié)構(gòu)域。先前的研究已經(jīng)證實(shí)，只有同時(shí)含有Lipoxygenase和PLAT/LH結(jié)構(gòu)域的序列才為L(zhǎng)OX基因家族。使用Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)分析23條AdLOX和25條AiLOX氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，18條AdLOX和18條AiLOX氨基酸序列同時(shí)含有以上兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。根據(jù)測(cè)序的ID號(hào)，分別將AdLOX和AiLOX序列命名為AdLOX1～18和AiLOX1～18。進(jìn)一步分析CDS和氨基酸序列證實(shí)，AdLOX5、AdLOX7、AiLOX8和AiLOX18的CDS序列中均含有提前終止翻譯的終止密碼子；AiLOX9的CDS序列長(zhǎng)度只有525bp。推測(cè)以上序列可能是假基因或由于測(cè)序質(zhì)量導(dǎo)致，在本研究中不對(duì)以上序列進(jìn)行分析。余下16條AdLOX的CDS序列長(zhǎng)度在1530～4374bp之間，氨基酸長(zhǎng)度為509～1457aa；15條AiLOX的CDS序列長(zhǎng)度為1737～2793bp，氨基酸序列長(zhǎng)度為578～930aa（表1）。

LOX基因家族可以分為2個(gè)亞族，即9-LOX和13-LOX，根據(jù)其氨基酸結(jié)構(gòu)可以進(jìn)一步將13-LOX分為兩類(lèi)，即Type I 13-LOX和TypeⅡ13-LOX。使用單子葉植物大麥、水稻、小麥和玉米以及雙子葉植物擬南芥、大豆、菜豆和豌豆的LOX氨基酸序列與野生花生AdLOX和AiLOX氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明，AdLOX分別含有3個(gè)9-LOX、8個(gè)Type I 13-LOX和5個(gè)TypeⅡ13-LOX類(lèi)型基因。AiLOX分別含有2個(gè)9-LOX、7個(gè)Type I 13-LOX和6個(gè)TypeⅡ13-LOX基因（圖1）。此外，Type I 13-LOX的分支中僅含有雙子葉豆科植物L(fēng)OX基因，而9-LOX和TypeⅡ13-LOX分支中同時(shí)含有雙子葉植物和單子葉植物L(fēng)OX基因，表明Type I13-LOX類(lèi)型基因是在豆科植物分化以后形成的，而9-LOX和TypeⅡ13-LOX類(lèi)型基因是在單子葉植物和雙子葉植物分化之前已經(jīng)出現(xiàn)。

由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，AdLOX和AiLOX基因與AtLOX1、AtLOX3、AtLOX4、AtLOX5、GmLOX4、OsLOX10、PsLOXG、PvLOX1、PvLOX1b和PvLOX2b的親緣關(guān)系較近（圖1）。其中，AtLOX1與AdLOX6、AdLOX9和AiLOX17聚集在一個(gè)分支；AtLOX3和AtLOX4與AiLOX1和AiLOX16聚集在一個(gè)分支；AtLOX5與AdLOX12和AiLOX4聚集在一個(gè)分支。研究發(fā)現(xiàn)，AtLOX1和AtLOX5的表達(dá)能提高植物體對(duì)病原菌和蚜蟲(chóng)的抗性，而AtLOX3和AtLOX4的過(guò)量表達(dá)能提高植物對(duì)線蟲(chóng)的抗性。由此推斷，AdLOX6、AdLOX9、AdLOX12、AiLOX1、AiLOX4、AiLOX16和AiLOX17基因可能參與野生花生的免疫反應(yīng)。在栽培花生中已確定AhLOX2和AhLOX3基因參與花生的抗病過(guò)程。在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，AhLOX2和AhLOX3基因和AdLOX11、AdLOX17以及AiLOX6聚集在同一個(gè)分支上，由此推測(cè)，AdLOX11、AdLOX17和AiLOX6也可能在野生花生抗病過(guò)程中起著重要作用。先前的研究證實(shí)，PvLOX1基因在植物的發(fā)育過(guò)程中起一定的作用，AdLOX2和AiLOX14基因與其聚集在同一個(gè)分支，由此判斷這兩個(gè)基因也可能具有相似的功能；而GmLOX4、OsLOX10、PsLOXG、PvLOX1b和PvLOX2b基因的功能尚不完全明確，與這些基因聚集在一起的AdLOX和AiLOX基因的功能需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

2.2LOX基因染色體定位

二倍體野生花生共有10條染色體。根據(jù)AdLOX和AiLOX基因在染色體上的定位信息可知AdLOX基因分布在6條染色體上，分別是2、3、6、8、9和10號(hào)染色體；AiLOX基因分布在7條染色體上，分別是2、3、4、6、8、9和10號(hào)染色體（圖2）。AdLOX基因在9號(hào)染色體上分布的最多，有8個(gè)成員；其次，3和8號(hào)染色體上分別有3個(gè)AdLOX基因；6號(hào)染色體上含有2個(gè)AdLOX基因；而2和10號(hào)染色體上分別有1個(gè)AdLOX基因。于此相似，AiLOX基因在9號(hào)染色體上分布最多，共有7個(gè)；3和6號(hào)染色體上各3個(gè)；8號(hào)染色體上2個(gè)；2、4和10號(hào)染色體上各分布1個(gè)AiLOX基因。進(jìn)一步分析表明，AdLOX和AiLOX基因在9號(hào)染色體上成簇集中分布，其中在A基因組的9號(hào)染色體和B基因組的9號(hào)染色體6.3Mb和10.2Mb的范圍內(nèi)各有6個(gè)LOX基因（表1和圖2），表明9號(hào)染色體是LOX基因的起源位點(diǎn)。該結(jié)果對(duì)野生花生與栽培花生近緣雜交、野生種質(zhì)抗病基因資源的利用以及分子標(biāo)記輔助選擇具有重要指導(dǎo)意義。endprint

通過(guò)使用系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)法共鑒定出12對(duì)AdLOX和AiLOX基因的直系同源基因?qū)Γ▓D3）。A.duranensis和A.ipaensis直系同源基因?qū)Ψ謩e分布在2、3、6、8和9號(hào)染色體上，其中9號(hào)染色體上分布的最多，有6對(duì)；3和8號(hào)染色體上各有2對(duì)，2和6號(hào)染色體上各有1對(duì)。對(duì)直系同源基因?qū)Φ姆治霭l(fā)現(xiàn)，這些基因?qū)?duì)應(yīng)于A.duranensis和A.ipaensis染色體上相同或相似的位置，且其結(jié)構(gòu)域保守，表明這些基因在功能上也相對(duì)保守；相反，有些在兩套染色體相同或相近位置上的基因卻不存在直系同源關(guān)系，如AdLOX5和AiLOX13（圖2），可能這些基因?qū)υ谶M(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了變異，或已分化出不同的生物學(xué)功能。

2.3啟動(dòng)子抗病相關(guān)順式作用元件分析

通過(guò)分析AdLOX和AiLOX順式作用元件發(fā)現(xiàn)，所有預(yù)測(cè)到參與抗病過(guò)程的AdLOX和AiLOX基因的啟動(dòng)子區(qū)域均含有參與抗病響應(yīng)的順式作用元件，包括Box-W1、CGTCA-motif、TC-richrepeats、TCA-element和TGACG-motif，主要參與真菌誘導(dǎo)響應(yīng)、茉莉酸途徑、免疫防御響應(yīng)和水楊酸途徑（表2）。在10個(gè)抗病相關(guān)的LOX基因中，除了AdLOX9，其他9個(gè)基因均含有響應(yīng)水楊酸或茉莉酸的順式作用元件。茉莉酸途徑主要響應(yīng)死體型病原菌（necrotrophic pathogen）的侵入，而水楊酸途徑主要響應(yīng)活體營(yíng)養(yǎng)性病原菌（biotrophic pathogen）的侵入。雖然茉莉酸和水楊酸途徑響應(yīng)不同類(lèi)型病原菌的侵入，但也有研究表明，這兩種植物激素在防御病原菌侵入的過(guò)程中具有協(xié)同效應(yīng)（synergistic effect）。參與抗病反應(yīng)的AdLOX和AiLOX基因具有響應(yīng)水楊酸和（或）茉莉酸途徑的順式作用元件，表明AdLOX和AiLOX基因能抵御多種病原菌的侵入。

2.4選擇壓力分析

為了檢測(cè)哪種選擇壓力影響AdLOX和AiLOX基因的結(jié)構(gòu)（或功能），本研究使用PAML程序中的位點(diǎn)模型分別計(jì)算了AdLOX和AiLOX蛋白所受的選擇壓力。由表3可知，大多數(shù)Ka/Ks<1，且未檢測(cè)到正選擇位點(diǎn)，表明AdLOX和AiLOX基因在進(jìn)化過(guò)程中受到純化選擇。純化選擇會(huì)使基因的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能更加保守。Chen等對(duì)毛果楊（Populus trichocarpa）LOX基因在進(jìn)化過(guò)程中所受到的選擇壓力研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)旁系同源基因?qū)a/Ks<0.4，表明這些基因在進(jìn)化歷程中受到純化選擇。這些結(jié)果表明，LOX基因可能在蛋白質(zhì)水平上的進(jìn)化相對(duì)緩慢。

3結(jié)論

本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)兩個(gè)野生花生種的LOX基因家族進(jìn)行了鑒定和分類(lèi)，共確定了18個(gè)AdLOX和18個(gè)AiLOX基因。通過(guò)分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，AdLOX6、AdLOX9、AdLOX11、AdLOX12、AdLOX17、AiLOX1、AiLOX4、AiLOX6、AiLOX16和AiLOX17基因可能參與植物體的抗病過(guò)程，其中，直系同源基因的功能相對(duì)保守。AdLOX和AiLOX基因在進(jìn)化過(guò)程中受到純化選擇作用。endprint