鄒運(yùn)乾，劉 洋，許 拓，周春陵，庫旭鋼，何啟蓋

（1.農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070）

一例豬腹瀉病的診斷及免疫防控評估

鄒運(yùn)乾1，2，劉 洋1，2，許 拓1，2，周春陵1，2，庫旭鋼1，2，何啟蓋1，2

（1.農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070）

豬流行性腹瀉（PED）是豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的一種豬的急性腸道傳染病。該病主要呈現(xiàn)哺乳仔豬高發(fā)病率、高致死率的特點(diǎn)。2014年11月開始至2015年6月，河北某豬場長期暴發(fā)仔豬腹瀉病，死亡率高達(dá)50%以上。通過現(xiàn)場調(diào)查、病理解剖、實(shí)驗(yàn)室病原診斷，確定該疾病主要由PEDV造成。并針對該場實(shí)際情況采用本實(shí)驗(yàn)室研制的PEDV新毒株弱毒疫苗與某商品滅活疫苗，以3種不同免疫方案進(jìn)行免疫效果評估，綜合安全性、免疫效力與生產(chǎn)成績情況，結(jié)果顯示兩種疫苗聯(lián)合使用及弱毒疫苗組免疫方案較僅使用商品滅活疫苗的滅活疫苗組有較高安全性、免疫保護(hù)效果及生產(chǎn)成績。

豬流行性腹瀉；診斷；免疫防控

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 疫苗、試劑、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源

試驗(yàn)所用弱毒疫苗為本實(shí)驗(yàn)室試制的豬流行性腹瀉新毒株弱毒疫苗，商品滅活疫苗為豬傳染性胃腸炎-豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗。總RNA提取試劑盒購自Genemark公司，豬流行性腹瀉 IgA和IgG間接ELISA檢測試劑盒為本實(shí)驗(yàn)室研制[1]，細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑與材料購自gibco和hyclone公司。本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源于河北某規(guī)?；i場。

表1 不同疫苗組合免疫程序表

1.2 臨床觀察及病理解剖

觀察該場患病仔豬臨床表現(xiàn)，包括精神、食欲狀況及是否腹瀉、消瘦。解剖腹瀉嚴(yán)重仔豬，觀察病理變化，并取材備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測

采集患病仔豬小腸樣品，研磨后反復(fù)凍融3次，采用TRIzol法提取總RNA，使用同時(shí)可擴(kuò)增PEDV M基因、TGEV（豬傳染性胃腸炎病毒）N基因、GAR（豬A群輪狀病毒）VP7基因的多重RT-PCR方法檢測樣品[2]。

1.4 免疫評估內(nèi)容

本試驗(yàn)主要對該場選用的母豬3種不同免疫程序的防控效果進(jìn)行評估。根據(jù)所使用疫苗種類我們將此3組分為滅活疫苗組，聯(lián)合疫苗組，弱毒疫苗組。相關(guān)免疫程序見表1。

免疫防控的評估內(nèi)容主要包括：安全性評價(jià)，即RT-PCR病原學(xué)檢測母豬糞樣中PEDV排毒情況，觀察母豬及新生仔豬精神、食欲及腹瀉情況等；免疫效力實(shí)驗(yàn)室評價(jià)，即通過ELISA檢測抗PEDV IgA抗體、IgG抗體及通過中和試驗(yàn)檢測中和抗體水平；臨床生產(chǎn)成績評價(jià)，即統(tǒng)計(jì)母豬產(chǎn)后7 d窩均活仔數(shù)和存活率。

1.5 間接ELISA

采集該3組母豬初乳共計(jì)42份，于4 ℃，12 000 r/min離心5 min，棄去上層乳脂層，用滅菌槍頭小心吸取中間層的乳清，分離后使用本實(shí)驗(yàn)室研制的試劑盒檢測豬流行性腹瀉病毒的IgA、IgG抗體，檢測方法依據(jù)試劑盒說明書。各抗體結(jié)果判定依據(jù)如下所述，以S/P值作為衡量IgA水平的標(biāo)準(zhǔn)，S/P值≥0.148為陽性；S/P值＜0.148為陰性。以O(shè)D值作為衡量IgG水平的標(biāo)準(zhǔn)，OD值≥0.433為陽性；OD值＜0.433為陰性。

1.6 中和試驗(yàn)

將測好TCID50的PEDV-YN144毒株病毒液稀釋成200 TCID50/50μL的病毒懸液。在96孔微量培養(yǎng)板中將上述處理的乳清作連續(xù)2倍倍比稀釋，在上述各孔內(nèi)加入50 μL稀釋好的病毒液，混勻后放入37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中作用60 min。同時(shí)設(shè)乳清對照，陰、陽性血清對照，病毒對照和正常細(xì)胞對照，其中病毒對照作200、20、2、0.2 TCID50共4個(gè)梯度對照。操作完成后棄去混合液并用DMEM洗滌2次，后每孔加入200 μL DMEM維持液，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察并按Reed-Muench兩氏法計(jì)算結(jié)果，稀釋液、洗滌液和維持液均為含10μg/mL胰酶的DMEM。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察及病理解剖結(jié)果

臨床可見部分仔豬發(fā)病嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為嘔吐且多發(fā)于吃奶后，排黃白或灰色水樣稀便（圖1A），糞便惡臭。病豬表現(xiàn)為精神沉郁、食欲衰退，消瘦，脫水，患病仔豬常抱團(tuán)（圖1B）。新生仔豬多發(fā)，且死亡率高達(dá)50%以上，一般腹瀉3～4 d后死亡，嚴(yán)重時(shí)常有整窩發(fā)病死亡情況。母豬未見腹瀉癥狀。剖檢主要病變?yōu)樾∧c膨脹，腸壁變?。▓D1C），充滿淡黃色液體或灰黃色液體（圖1D），個(gè)別小腸黏膜有出血點(diǎn)，腸系膜淋巴結(jié)水腫。胃內(nèi)容物少，或充滿膽汁樣的黃色液體。其他實(shí)質(zhì)性器官無明顯病變。

圖1 臨床表現(xiàn)與剖檢變化

2.2 病原學(xué)檢測結(jié)果

患病仔豬小腸樣品RT-PCR檢測結(jié)果如圖2所示，7份小腸樣品種有6份均為PEDV陽性（85.7%），TGEV與GAR均為陰性。

2.3 免疫防控效果評估

2.3.1 安全性

RT-PCR檢測疫苗免疫前后母豬糞樣，在無PEDV疫情區(qū)域內(nèi)觀察結(jié)果顯示3個(gè)組中免疫母豬均未出現(xiàn)排毒情況，且母豬精神、食欲等表現(xiàn)正常，無腹瀉現(xiàn)象。疫苗免疫母豬所產(chǎn)仔豬，精神、食欲良好，無腹瀉情況，顯示出各免疫程序均有較高安全性。

圖2 腹瀉仔豬腸樣病原檢測電泳圖

圖3 抗PEDV IgA、IgG抗體水平

圖4 中和抗體效價(jià)水平

2.3.2 抗體水平

ELISA檢測抗PEDV IgA抗體結(jié)果表明，所有組的母豬初乳樣品IgA抗體均為陽性，其中弱毒疫苗組初乳S/P平均值為0.77，聯(lián)合疫苗組與滅活疫苗組相近，S/P值分別為0.63與0.62，差異均不顯著。所有樣品均為抗PEDV IgG抗體陽性，弱毒疫苗組、聯(lián)合疫苗組和滅活疫苗組OD值分別為2.00，1.84和2.10，組間差異不顯著（圖3）。

中和試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，弱毒疫苗組平均中和效價(jià)為1∶351，聯(lián)合疫苗組中和抗體平均效價(jià)為1∶188，滅活疫苗組平均中和效價(jià)為1∶4.1，3組組間差異顯著（P＜0.05）。

2.3.3 臨床觀察及生產(chǎn)成績

觀察該3組中母豬對應(yīng)窩內(nèi)仔豬腹瀉情況，弱毒疫苗組仔豬腹瀉率為35.7%，少數(shù)腹瀉仔豬食欲較弱，精神較差；聯(lián)合疫苗組仔豬無腹瀉情況，仔豬精神狀況良好；滅活疫苗組仔豬腹瀉情況最嚴(yán)重，腹瀉率為55.6%，對應(yīng)腹瀉仔豬消瘦、畏寒、扎堆，精神差。

考慮到可行性，本研究主要從產(chǎn)后7 d窩均活仔數(shù)、存活率方面評價(jià)各組生產(chǎn)成績。如圖5所示，窩均活仔數(shù)與存活率最高的為聯(lián)合疫苗組（9.4頭，99.2%）；其次為弱毒疫苗組（9.3頭，84.9%）；滅活疫苗組表現(xiàn)最差（8.3頭，77.3%），其中存活率指標(biāo)聯(lián)合疫苗組與滅活疫苗組差異顯著（P＜0.05）。

3 討論

3.1 病原診斷

圖5 窩均活仔數(shù)及平均存活率比較

PEDV、TGEV、GAR以及其他病原均可引起高度接觸性腹瀉疾病，其臨床癥狀、病理變化和流行病學(xué)較為相似，在臨床和組織病理學(xué)上很難區(qū)分。本案例在分析實(shí)地調(diào)查、實(shí)驗(yàn)室剖檢結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用PEDV、TGEV、GAR三重RT-PCR方法診斷，結(jié)果顯示患病仔豬小腸樣品中PEDV陽性、TGEV和GAR均為陰性，說明該場腹瀉疫病由PEDV引起。

3.2 免疫防控評估

在該場PED疫病出現(xiàn)后，選擇使用本實(shí)驗(yàn)室研制的PEDV 新毒株弱毒疫苗以及商品滅活疫苗組成不同的免疫程序比較安全性、抗體水平及生產(chǎn)成績，希望可以為豬場解決PED疫病提供較好的解決方法。本試驗(yàn)中，各免疫程序安全性良好，接種后懷孕母豬均未出現(xiàn)排毒及腹瀉現(xiàn)象，對應(yīng)仔豬也表現(xiàn)正常，無腹瀉現(xiàn)象。本研究所用弱毒苗在Vero細(xì)胞系上連續(xù)傳代144F致弱，此前使用初生仔豬進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)已證明本弱毒疫苗對仔豬有較高安全性，此結(jié)論在本試驗(yàn)中亦被證明。滅活苗安全性高眾所周知，因此，本試驗(yàn)中3種免疫程序均有較高安全性。

疫苗免疫效力主要通過ELISA方法測定初乳中抗PEDV IgA、IgG抗體，中和試驗(yàn)測定中和抗體效價(jià)，觀察使用效果及比較生產(chǎn)成績（窩均活仔數(shù)、產(chǎn)后7 d存活率）予以綜合考量。PED發(fā)病機(jī)理是病毒通過口感染后，進(jìn)入小腸絨毛上皮細(xì)胞漿中復(fù)制，造成細(xì)胞器損傷，導(dǎo)致腸絨毛萎縮，進(jìn)而引起營養(yǎng)物質(zhì)吸收障礙，嚴(yán)重腹瀉引起脫水導(dǎo)致豬發(fā)病死亡。因此，在病毒性腹瀉的免疫機(jī)制中，黏膜免疫具有非常重要的作用。腸道黏膜分泌的分泌型IgA（sIgA）抗體能在小腸上皮細(xì)胞表面抵御入侵的病原菌?？诜呙缒艽碳ゐつっ庖?，產(chǎn)生黏膜和血清保護(hù)性IgA抗體，直接從腸道阻斷受體與病毒的結(jié)合，是預(yù)防腸道傳染病的有效途徑[3]。另外，從被動(dòng)免疫角度考慮，初乳中的IgA的含量決定了疫苗對小豬的保護(hù)效果，當(dāng)母豬腸道受到PEDV刺激后，分泌IgA的免疫細(xì)胞就遷移至乳腺，在乳腺定居后向乳汁中分泌IgA抗體。通過腸-乳腺軸途徑，仔豬獲得IgA，從而讓仔豬獲得針對PEDV的特異性免疫。另外，與IgM和IgG相比，IgA能夠有效抵抗消化道蛋白水解酶的降解，所以IgA是中和通過腸道感染的病毒的最主要的抗體[4]。

本試驗(yàn)中，3組母豬初乳均為陽性，但弱毒疫苗組母豬初乳中有最高的IgA抗體，聯(lián)合疫苗組與滅活疫苗組相當(dāng)，一定程度上佐證了上述理論，但與其他2組差異不顯著，分析可能是由于弱毒疫苗口服后部分在消化道被降解而降低了效果。而IgG作為輔助指標(biāo)，3組之間差異不明顯，但均呈較高陽性。3組母豬初乳中和抗體差異顯著，弱毒疫苗組平均中和效價(jià)顯著高于聯(lián)合疫苗組和滅活疫苗組，且僅免疫一次弱毒苗的聯(lián)合疫苗組中和抗體也顯著高于完全使用滅活疫苗的滅活疫苗組，說明口服本弱毒疫苗效果較好，顯著優(yōu)于滅活苗。分析認(rèn)為滅活疫苗存在固有劣勢，免疫效果不確實(shí)，免疫效力相對較弱，所能激發(fā)的局部黏膜免疫十分有限。另外，PEDV S基因變異頻繁[5]，已有研究表明臨床出現(xiàn)變異株，與商品滅活疫苗所使用的CV777毒株之間存在較大變異，一定程度上也影響該滅活疫苗臨床使用效果。

就免疫后臨床效果觀察及比較生產(chǎn)成績方面，弱毒疫苗組母豬所產(chǎn)仔豬少數(shù)出現(xiàn)腹瀉，聯(lián)合疫苗組仔豬無腹瀉情況，精神良好，而滅活疫苗組超過50%仔豬仍出現(xiàn)腹瀉、食欲不振及消瘦現(xiàn)象，與抗體水平結(jié)果基本保持一致。由于新生仔豬腹瀉后多在2～4 d內(nèi)死亡[6]，因此本研究統(tǒng)計(jì)各組母豬產(chǎn)后7 d窩均活仔數(shù)和存活率。產(chǎn)后7 d存活率窩均活仔數(shù)與存活率最高的為聯(lián)合疫苗組，與弱毒疫苗組差異不顯著，但存活率指標(biāo)與滅活疫苗組差異顯著，說明聯(lián)合疫苗組與弱毒疫苗組免疫程序均能對仔豬提供優(yōu)于滅活疫苗組的保護(hù)力。

綜合看來，母乳中抗PEDV特異性抗體水平越高，中和抗體水平越高，仔豬腹瀉率越低，對應(yīng)仔豬存活率也相應(yīng)越高，使用本實(shí)驗(yàn)室試制的弱毒疫苗與商品滅活苗的聯(lián)合疫苗組或單獨(dú)使用該弱毒疫苗的弱毒疫苗組免疫方案相對較好，明顯優(yōu)于滅活疫苗組。該弱毒疫苗通過口服免疫雖然可以更好地激發(fā)腸道局部黏膜免疫，但如何合理的解決致弱病毒安全通過自口腔開始前往腸道的過程問題，還有待繼續(xù)研究。同時(shí)，提示豬場需及時(shí)關(guān)注臨床PEDV變異情況，且應(yīng)加快PEDV新型疫苗的研發(fā)速度。

[1] 丁振江，庫旭鋼，閆貴偉，等. 豬流行性腹瀉IgA抗體間接ELISA檢測方法的建立[J].畜牧與獸醫(yī)，2014(11)：1-5.

[2] 張坤，何啟蓋.豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬A群輪狀病毒多重RT-PCR檢測方法的建立及臨床應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，41(8)：1001-1005.

[3] Song D S， Park B K，et al.Oral efficacy of Vero Cell Attenuated Porcine Epidemic Diarrhea Virus DR13 Strain[J]. Res Vet Sci， 2007. 82（1）： 134-140.

[4] De Arriba M L，Carvajal， Pozo J，et al.Mucosal and systemic isotypespeci- fic antibody responses and protection in conventional pigs exposed to virulent or attenuated porcine epidemic diarrhea virus[J]. Vet Immunol Immunopathol，2002. 85：85-97.

[5] Sun M， Ma J， Wang Y，et al. Genomic and epidemiological characteristics provide new insights into the phylogeographical and spatiotemporal spread of porcine epidemic diarrhea virus in Asia. Journal of clinical microbiology. 2015；53：1484-92.

[6] 甘振磊，湯德元，李春燕，等. 豬流行性腹瀉流行特點(diǎn)及流行現(xiàn)狀的研究[J].豬業(yè)科學(xué)，2010，27（12）：24-28.

2015-09-24）

國家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-36）

鄒運(yùn)乾（1991-），男，湖北荊州人，碩士，研究方向：動(dòng)物傳染病。

何啟蓋，男，教授，博士生導(dǎo)師，從事動(dòng)物細(xì)菌性及病毒性傳染病研究，E-mail:he628@mail.hzau.edu.cn