梁靜，李琳，吳麗杰，凌斌，孫靄萍

（中日友好醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100029）

泛素化是一個(gè)具有普遍意義的免疫生物學(xué)現(xiàn)象，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)泛素化降解是蛋白質(zhì)重要的轉(zhuǎn)錄后修飾方式之一，泛素-蛋白酶體途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞增生與分化，以及信號(hào)傳導(dǎo)等多種細(xì)胞生理過程［1］。泛素系統(tǒng)的紊亂與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。

泛素結(jié)合酶E2-EPF（ubiquitin-conjugating enzyme E2-EPF）是E2泛素結(jié)合酶家族成員之一，在多種腫瘤組織中高表達(dá)［2-3］，無論是在常氧還是低氧情況下，都可以抑制抑癌基因von Hippel-Lindau［4］，穩(wěn)定低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α），啟動(dòng)HIF-1α下游反應(yīng)鏈，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲［5-7］。前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，E2-EPF 在宮頸癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)水平與臨床分期和病理分級(jí)密切相關(guān)，并參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等［8］。但有文獻(xiàn)報(bào)道，在不同的宮頸癌細(xì)胞株中E2-EPF 的作用存在差異［9-10］。因此，我們?cè)俅瓮ㄟ^siRNA 下調(diào)Caski細(xì)胞株中E2-EPF 的表達(dá)，研究其在細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖以及放、化療反應(yīng)等方面的影響，探討E2-EPF在宮頸癌中的作用。

資料和方法

一、材料

1.試劑：E2-EPF-siRNA 質(zhì)粒、對(duì)照質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑盒、羊抗兔多克隆抗體（Santa Cruz，美國）；Isogen試劑（Nippon Gene，日本）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、E2-EPF探針、GAPDH 探 針 及PCR 反 應(yīng) 試 劑（Applied Biosystems，美 國）；M-PER 蛋 白 提 取 劑 及BCA 蛋白定量試劑盒（Pierce，美國）；蛋白酶抑制劑（Roche，美國）；E2-EPF C-term 抗體及β-actin抗體（ABGENT，美國）；RPMI 1640培養(yǎng)基、Opti-MEM低血清培養(yǎng)基（Gibco，美國）；MTT 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)試劑盒（Promega，美國）；Annexin V-FITC 凋亡試劑盒（武漢華美生物）。

2.細(xì)胞系來源及培養(yǎng)：人類宮頸癌細(xì)胞Caski（日本東京醫(yī)科大學(xué)），培養(yǎng)于含有10% FBS 的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)期的Caski細(xì)胞，按3×105／孔種于6 孔板中，培養(yǎng)于含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2。24h后，取100μl E2-EPF-siRNA（siRNA 組）和對(duì)照質(zhì)粒（對(duì)照組），按說明分別進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。

2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR：按說明提取兩組細(xì)胞總RNA，以 波 長(zhǎng)A260／280 進(jìn) 行 定 量。取1 μg 總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。E2-EPF 探針上游序列為：5’-C GACCTCCAGGTCACCAT-3’；下游序列為：5 ’-GGAACAGACCTCCAGCATATGG-3 ’。 以GAPDH作為內(nèi)參，于StepOnePlus Real-time PCR system 中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件是：95℃10min；95℃15s，50℃10s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)。以StepOne software v2.0進(jìn)行定量分析。

3.Western blot：將M-PER 蛋白提取液和蛋白酶抑制劑按50ml∶1片的比例制成混合液加于兩組細(xì)胞沉淀中，于冰上裂解30min后，14 800 g 離心15min，取上清，BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量。兩組細(xì)胞分別提取30μg總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，一抗E2-EPF C-term濃度1∶250，4℃搖床孵育過夜，二抗?jié)舛?∶500，室溫?fù)u床孵育30min。以β-actin為內(nèi)參。

4.細(xì)胞周期檢測(cè)：將兩組細(xì)胞消化分離成單細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞，以70%乙醇固定過夜。4ml PBS 洗 滌 細(xì) 胞 兩 次，加 入 含 有100 μg／ml RNase A 的100μg／ml碘化丙啶染液，孵育30min。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

5.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將1×103Caski細(xì)胞接種于96孔板，6h后分別轉(zhuǎn)染E2-EPF-siRNA 質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒，繼續(xù)培養(yǎng)1～9d后，按說明進(jìn)行MTT 實(shí)驗(yàn)，于酶標(biāo)儀上測(cè)量570nm OD 值。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，取平均值。

6.放療后細(xì)胞死亡與凋亡檢測(cè)：取3×105的Caski細(xì)胞種于6孔板中，6h后分別轉(zhuǎn)染E2-EPFsiRNA 質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒，于37℃，5%CO2培養(yǎng)24h后，將兩組細(xì)胞分別經(jīng)0Gy、4Gy、7Gy、10Gy 4個(gè)不同劑量X 線照射，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h 和96h。取2×105細(xì)胞，PBS洗滌，400μl結(jié)合緩沖液懸浮后，加入5μl Annexin V-FITC，室溫避光10 min，再加入5μl碘化丙啶，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞死亡和凋亡比例。每組設(shè)3復(fù)孔，重復(fù)3次，取平均值。

7.化療藥物實(shí)驗(yàn)：取2×104Caski細(xì)胞種于96孔板中，6h后分別轉(zhuǎn)染E2-EPF-siRNA 質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒，37℃、5%CO2培養(yǎng)24h。加入不同濃度的順鉑（Cisplatin，5μmol／L、20μmol／L、40μmol／L），或紫杉醇（Taxol，10nmol／L、20nmol／L、50nmol／L），或 拓 撲 替 康（Topotecan，0.5nmol／L、1nmol／L、2nmol／L），或 依 托 鉑 苷（Etoposide，0.5 μg／ml、5μg／ml、15μg／ml），24h后進(jìn)行MTT 檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)量。細(xì)胞存活率以加藥組OD／未加藥組OD×100%表示。不同藥物劑量的兩組細(xì)胞均行3復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，取平均值。

三、統(tǒng)計(jì)分析

結(jié) 果

一、siRNA 下調(diào)Caski細(xì)胞內(nèi)E2-EPF水平

通過RNAi 技術(shù)下調(diào)Caski 細(xì)胞內(nèi)源性E2-EPF水平，并分別通過Real-time PCR 和Western blot在mRNA 和蛋白水平上進(jìn)行驗(yàn)證（圖1）。

二、流式細(xì)胞周期檢測(cè)及細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

下調(diào)E2-EPF水平后，細(xì)胞內(nèi)G0-G1期細(xì)胞百分比顯著增加；S和G2-M 期細(xì)胞總數(shù)比例減少（圖2）；細(xì)胞的生長(zhǎng)速率明顯低于對(duì)照組，再次證實(shí)了E2-EPF參與Caski細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)（圖3）。

圖1 Caski細(xì)胞株轉(zhuǎn)染E2-EPF-siRNA 質(zhì)粒后內(nèi)源性E2-EPF的表達(dá)情況

圖2 Caski細(xì)胞株轉(zhuǎn)染E2-EPF-siRNA質(zhì)粒后細(xì)胞周期檢測(cè)

圖3 Caski細(xì)胞株轉(zhuǎn)染E2-EPF-siRNA質(zhì)粒后細(xì)胞增殖MTT 實(shí)驗(yàn)

三、X 線放療實(shí)驗(yàn)

經(jīng)不同劑量（0Gy、4Gy、7Gy、10Gy）X 線照射后，未發(fā)現(xiàn)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)源性E2-EPF 對(duì)細(xì)胞死亡及凋亡的影響。兩組細(xì)胞經(jīng)照射后24h，細(xì)胞死亡與凋亡檢測(cè)結(jié)果如圖4。照射后48h及96h，兩組間細(xì)胞死亡與凋亡也無明顯差異（數(shù)據(jù)未顯示）。

四、化療藥物實(shí)驗(yàn)

下調(diào)Caski細(xì)胞內(nèi)源性E2-EPF水平對(duì)紫杉醇和順鉑的反應(yīng)無明顯作用，但能增強(qiáng)對(duì)Topotecan-拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑和Etoposide-拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑的敏感性（圖5）。

圖4 不同劑量放療處理24h對(duì)于轉(zhuǎn)染E2-EPF-siRNA質(zhì)粒Caski細(xì)胞株的影響

圖5 不同濃度Topotecan和Etoposide作用24h對(duì)兩組細(xì)胞活率的影響

討 論

近年陸續(xù)有報(bào)道，E2-EPF 在乳腺癌和食道癌組織中也參與腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，但是對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)作用結(jié)果不一［9-10］。前期研究已經(jīng)證實(shí)E2-2PF 在宮頸鱗癌組織中呈高表達(dá)水平，其表達(dá)水平與臨床分期和病理分級(jí)密切相關(guān)，為了進(jìn)一步研究E2-EPF 在不同宮頸癌細(xì)胞株中的作用，本文再次針對(duì)Caski進(jìn)行研究。利用RNAi瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，下調(diào)Caski細(xì)胞株內(nèi)E2-EPF水平，可以調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，減緩細(xì)胞的生長(zhǎng)速度。由此可見，E2-EPF參與Caski細(xì)胞周期的調(diào)控及細(xì)胞的增殖，對(duì)于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有重要的意義。

Topotecan作為拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的抑制劑可以與拓?fù)洚悩?gòu)酶I-DNA 三元復(fù)合物結(jié)合，從而阻礙斷裂DNA 單鏈的重新連接，并影響拓?fù)洚悩?gòu)酶I的再循環(huán)利用，使哺乳動(dòng)物細(xì)胞無法有效地修復(fù)損傷的DNA 雙鏈，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［11-13］。細(xì)胞毒性作用主要作用于DNA 合成的S期，同樣也作用于DNA損傷后的修復(fù)和基因表達(dá)過程［13］。由于拓?fù)洚悩?gòu)酶I的濃度在增生期細(xì)胞中隨整個(gè)細(xì)胞周期保持穩(wěn)定，在靜止期細(xì)胞中此酶也有表達(dá)，因此對(duì)增殖緩慢及耐藥的實(shí)體瘤均有潛在作用［14］。本實(shí)驗(yàn)中，在0.5nmol／L、1nmol／L 和2nmol／L 三 個(gè) 濃 度 的Topotecan作用下，siRNA 組與對(duì)照組間均有顯著差異。

Etoposide作用于DNA-拓?fù)洚悩?gòu)酶II，形成藥物-酶-DNA 復(fù)合物，阻礙DNA 修復(fù)造成DNA 鏈斷裂，作用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期的G2期［15］。高濃度（≥10μg／ml）時(shí)，Etoposide使進(jìn)入有絲分裂期的細(xì)胞溶解，而低濃度（0.3～10μg／ml）時(shí)，則抑制細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂的前期。本實(shí)驗(yàn)中，在0.5μg／ml、5 μg／ml和15μg／ml三個(gè)不同濃度下，下調(diào)E2-EPF使細(xì)胞對(duì)Etoposide的敏感性均顯著增加，這一結(jié)果與其藥理特性相吻合。

結(jié)合前期研究結(jié)果［8］，在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中，E2-EPF參與細(xì)胞周期的調(diào)控與細(xì)胞增殖，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有重要意義。下調(diào)細(xì)胞內(nèi)源性E2-EPF，可以使HIF-1α蛋白水平下降，明顯減弱細(xì)胞的增殖、侵襲和體外成瘤性，并可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑和拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑的敏感性。

【致謝】 本實(shí)驗(yàn)部分于日本東京醫(yī)科大學(xué)產(chǎn)婦人科實(shí)驗(yàn)室完成，特別感謝井本惠一教授、西洋孝醫(yī)師及樋熊千夏給予的支持及幫助。

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