趙　煜，張　濤，劉煥義，徐紅玉，楊　波，蘇曉妹，朱亞杰，劉　楨

中國人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院腫瘤中心(四川 成都 610083)

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IL-15對體外培養(yǎng)的DC致敏的T淋巴細胞的作用研究

趙煜，張濤，劉煥義，徐紅玉，楊波，蘇曉妹，朱亞杰，劉楨

中國人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院腫瘤中心(四川 成都 610083)

【摘要】目的通過與IL-2進行比較，觀察IL-15激活T細胞反應(yīng)，增強DC細胞疫苗抗腫瘤的免疫反應(yīng)。方法將骨髓來源的樹突狀細胞(BMDCs)皮下注射小鼠作為初次免疫，14d后取小鼠脾臟，制備淋巴細胞，與細胞因子(IL-2、IL-15)和BMDCs共同培養(yǎng)作為再次免疫，產(chǎn)生細胞毒T淋巴細胞(CTL)。流式細胞術(shù)檢測細胞因子(IL-2或IL-15)聯(lián)合BMDCs刺激小鼠淋巴細胞CD62L、CD69、CD44的表達情況；采用Cr51釋放實驗檢測CTL對Levis肺癌細胞的殺傷作用；采用酶聯(lián)免疫斑點實驗(ELISPOT)檢測分泌干擾素γ(IFN-γ)細胞亞群比例。結(jié)果IL-15聯(lián)合 BMDCs疫苗上調(diào)CD8+T細胞表達CD69+、CD44+，增強對腫瘤細胞的殺傷活性，并能產(chǎn)生更多的IFN-γ分泌細胞。結(jié)論IL-15可能較IL-2更能增強DC疫苗抗腫瘤的免疫反應(yīng)，為IL-15和DC疫苗的聯(lián)合免疫治療提供重要的試驗依據(jù)和臨床前研究的理論基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】白細胞介素15;白細胞介素2;CD8+T細胞;樹突狀細胞

手術(shù)、化療和放療是傳統(tǒng)的腫瘤治療三大手段，而現(xiàn)在生物治療以其獨特的優(yōu)勢已成為繼這三種治療手段后的第四種手段，而免疫治療是腫瘤生物治療的核心。正常情況下，機體存在以T淋巴細胞、 NK細胞和巨噬細胞為主的細胞免疫發(fā)揮主要的抗腫瘤作用。而腫瘤在人體免疫功能下仍能發(fā)生、發(fā)展，表明人體的抗腫瘤免疫作用不足，其原因可能與腫瘤逃避免疫監(jiān)視，使人體不能有效的遞呈腫瘤抗原，從而不能有效活化細胞毒性T細胞(CTL)有關(guān)[1]。

樹突狀細胞(dendritic cell，DC) 提呈抗原的能力遠遠強于B細胞、巨噬細胞等抗原提呈細胞(antigen presenting cells，APCs)，是迄今所知機體內(nèi)功能最強的抗原提呈細胞。DC可以對腫瘤抗原進行攝取和加工，并結(jié)合MHC-Ⅱ分子提呈于細胞表面，從而誘導(dǎo)CTL的抗腫瘤免疫反應(yīng)[2]；并且DC是細胞免疫應(yīng)答的啟動者，可以活化初始型T細胞。許多研究表明，腫瘤患者體內(nèi)的DC不只數(shù)量有所下降，而且功能也受到不同程度的抑制，從而使T淋巴細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答不能被有效的激活。因此如何改善DCs疫苗的免疫狀態(tài)，近年來逐漸成為腫瘤免疫學(xué)研究的熱點[3-4]。

細胞因子在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，對DC的發(fā)育、成熟、免疫功能有著重要影響。IL-12、IL-2、粒-巨噬細胞集落刺激因子(grain-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)等常作為DC疫苗的免疫佐劑，使DC疫苗誘導(dǎo)的T細胞反應(yīng)得以增強。IL-15是一種新近發(fā)現(xiàn)的細胞因子，具有與IL-2類似的激活T細胞、B細胞和NK細胞的作用，但其具有IL-2不具備的優(yōu)勢：目前認為它能激活、維持和擴增CD8+記憶性T細胞[5-6]，但IL-2卻抑制CD8+記憶性T細胞在體內(nèi)的存活；IL-15不激活調(diào)節(jié)性T淋巴細胞 (tregs)，并解除tregs對T細胞的抑制作用[7]，IL-2卻激活并維持tregs的活性和功能，而tregs對免疫的各個方面都有負調(diào)節(jié)作用[8]；IL-15不會誘導(dǎo)活化誘導(dǎo)的細胞死亡(AICD),IL-2的作用正好相反。所以在腫瘤的免疫治療中，IL-15可能是一種更好的DC免疫佐劑。本研究以IL-2為對照，觀察IL-15對DC疫苗誘導(dǎo)的T淋巴細胞免疫反應(yīng)的作用。

1材料與方法

1.1實驗材料IL-15購自Peprotech公司。IL-2購自eBioscience公司。GM-CSF購自R&D公司。IL-4購自eBioscience公司。脂多糖 (LPS) 購自美國Sigma公司。PE-CD69 mAb購自eBioscience公司，PE-Cy5-抗CD8單抗(mAb)，PE-CD44 mAb，PE-CD62L mAb。ELISPOT試劑盒購自MABTECH公司。C57BL/6小鼠，雄性，7~8周齡購自成都醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。Levis肺癌細胞株購自ATCC,由本實驗室保種儲存。其它均為常用試劑。

1.2實驗方法

1.2.1凍融法制備Levis肺癌細胞抗原Levis肺癌細胞復(fù)蘇，用RPMl-l640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化、傳代。取對數(shù)生長期的細胞，用PBS重懸細胞數(shù)為2×107/mL。置于液氮10min后放入37℃水浴中融化，反復(fù)5個循環(huán)。離心取上清即制成腫瘤細胞裂解液，置-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2小鼠骨髓DC細胞(BMDCs)的獲取與制備無菌取小鼠脛骨和股骨，用注射器吸取RPMI-1640培養(yǎng)基反復(fù)沖洗髓腔，沖洗液離心后棄上清。用紅細胞裂解液裂解紅細胞，離心后棄上清。用DC細胞培養(yǎng)基(RPMI-1640培養(yǎng)基：GM-CSF 1000U/mL、5%FCS和IL-4 500U/mL)調(diào)整細胞濃度為6×105/mL，加入6孔板(每孔含細胞1.8×106)。培養(yǎng)到第8d每孔加入0.1mL腫瘤細胞裂解液(2×107腫瘤細胞得來)，培養(yǎng)4h后，加入LPS(終濃度1μg/mL)混勻誘導(dǎo)細胞成熟[9]。

1.2.3小鼠脾臟T淋巴細胞的制備無菌取得小鼠脾臟,無菌注射器芯研磨過200目鋼網(wǎng)，離心棄上清，加入紅細胞裂解液裂解紅細胞后，RPMI-1640培養(yǎng)基3mL重懸置37℃孵箱備用。將尼龍毛柱加入預(yù)熱為37℃的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基置孵箱1h平衡尼龍毛柱。取出柱子加入3mL脾細胞懸液，37℃孵箱孵育45min。加入20mL37℃的RPMI-1640培養(yǎng)基，以1滴/s的速度洗柱子，得到小鼠脾臟T淋巴細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為3×106/mL。

1.2.4淋巴細胞免疫表型測定采用流式細胞術(shù)直接免疫熒光標記法檢測小鼠脾臟淋巴細胞免疫表型。收集培養(yǎng)第3、7、14d各組(IL-2，IL-15)T淋巴細胞，調(diào)整細胞濃度為1×106/mL，吸取1mL用PBS洗滌后，加入PBS緩沖液50μL及40μL各標記物(PE標記的抗CD44 mAb、 CD62L mAb、CD69 mAb或同型對照)，室溫避光孵育40min。采用不同濃度的IL-2(5、10、20或40mg/mL)，IL-15(25、125、250或500ng/mL)培養(yǎng)淋巴細胞，在3、7、14d采用流式細胞術(shù)檢測淋巴細胞免疫表型。

1.2.5腫瘤抗原負載的BMDCs誘導(dǎo)T淋巴細胞對腫瘤細胞殺傷活性的分析

1.2.5.1效應(yīng)細胞的制備無菌取健康小鼠的脾臟淋巴細胞，制備T細胞懸液(步驟見上述)。調(diào)整細胞濃度為1×106/mL，取500μL/孔加入6孔板中。腫瘤抗原負載的BMDCs用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×105/mL，取400μL/孔加入已置有T細胞的6孔板中，補足培養(yǎng)基為3mL，每組分別加入125ng/mL IL-15、10ng/mL IL-2或不加入細胞因子，37℃孵箱孵育7d，收集懸浮細胞作為效應(yīng)細胞，以含10%FCS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基稀釋備用。

1.2.5.2用51Cr釋放法檢測效應(yīng)細胞對Levis肺癌細胞的殺傷作用取1mL濃度為3×106/mL的Levis肺癌細胞作為靶細胞,加入100Ci Na51CrO4，混勻后置于37℃孵箱孵育2h。用Hanks液洗滌后加入RPMI-1640培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細胞濃度為1×106/mL。將各組效應(yīng)細胞與靶細胞按照效靶比(E/T)=160∶1、80∶1、40∶1、20∶1加入到96孔U型板中,各設(shè)4個復(fù)孔。同時設(shè)最小釋放組(100μL靶細胞、100μL RPMl-l640培養(yǎng)基)、最大釋放組(100μL靶細胞、100μL破膜劑l%triton-X100)，于37℃孵箱孵育4h。離心取上清100μL于專用試管中。用γ記數(shù)器分別計數(shù)每管上清液的cpm值。細胞特異性殺傷率按以下公式計算:細胞特異性殺傷率%=(樣本釋放cpm平均值-最小釋放cpm平均值)/(最大釋放cpm平均值-最小釋放cpm平均值) ×100%

1.2.6檢測干擾素γ(Interferon-γ，IFN-γ)分泌細胞實驗操作步驟按照ELISPPOT試劑盒說明書操作。調(diào)整效應(yīng)細胞為1×106個/mL(制備步驟見1.2.5.1), 將100μL細胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中每孔,各設(shè)4個復(fù)孔,孵育時間為24h。將ELISPPOT板置于解剖顯微鏡下(×40)，記錄黑紫色斑點，拍照，作統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，各組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1IL-2和IL-15對CD8+T細胞免疫表型的影響

在第7d時，10ng/mL IL-2 、125ng/mL IL-15上調(diào)CD8+T細胞表達CD69+、CD44+，同時下調(diào)CD62L分子的能力較好。所以本實驗選擇在第7d時，以10ng/mL IL-2或125ng/mL IL-15檢測T淋巴細胞的殺傷活性和IFN-γ分泌細胞,見圖1。

圖1　流式細胞術(shù)分析CD8+T細胞的表型特征

2.2腫瘤抗原負載的DC疫苗誘導(dǎo)的T淋巴細胞對腫瘤細胞殺傷活性的影響在聯(lián)合DC疫苗的情況下，將IL-15作為免疫佐劑這組對靶細胞的殺傷活性強于將IL-2作為免疫佐劑這組，而兩者均顯著高于對照組(P<0.05)，見圖2。

圖2　DC疫苗再次免疫時，T淋巴細胞對腫瘤細胞殺傷活性的分析

2.3檢測IFN-γ分泌細胞經(jīng)DC疫苗再次刺激后，用含IL-15的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每10萬個細胞有約120個IFN-γ分泌細胞；而在IL-2培養(yǎng)的細胞中，每10萬個細胞有約45個IFN-γ分泌細胞，兩者之間有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),而兩者均高于對照組(P<0.05)，見圖3。

圖3　DC疫苗再次免疫時，分泌IFN-γ的細胞檢測

3　討論

在機體存在多種抗腫瘤免疫機制中，以T細胞介導(dǎo)的特異性細胞免疫起著主導(dǎo)作用。機體的免疫應(yīng)答首先由APCs將腫瘤抗原進行攝取、加工，并將信息提呈給T淋巴細胞，進而引發(fā)特異性免疫應(yīng)答。DC細胞是目前己知功能最強的APCs，細胞因子對DC細胞的發(fā)育、成熟，以及免疫功能的發(fā)揮至關(guān)重要，例如激活T細胞反應(yīng)。許多細胞因子(如IL-2、IL-12、GM-CSF等)作為DC的免疫佐劑，從而使DC疫苗誘導(dǎo)的T細胞反應(yīng)得以增強。因此以DC細胞為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療成為醫(yī)學(xué)界研究的熱點。

IL-15在空間構(gòu)象上與IL-2相似，兩者都屬于4-螺旋的造血因子家族，螺旋為up-up-down-down的結(jié)構(gòu)取向； IL-15受體(IL-15R)與IL-2受體(IL-2R)一樣，包含IL-15Rα，IL-15Rβ，IL-15Rγ3條鏈。其中兩者的β和γ亞單位相同，這可以解釋實驗中觀察到的IL-15具有與IL-2相同的刺激T淋巴細胞增殖并維持其活性的作用。

但IL-15R本身有特異的IL-15α，是IL-15的高親和力受體。與β，γ亞基結(jié)合后，IL-15Rαβγ成為IL-15的高親和力受體，但IL-2Rαβγ對IL-2的親和力沒有改變。其次IL-15Rα在機體的表達更為廣泛，主要激活單核細胞和DCs表達，而IL-2Rα主要由激活的T細胞和B細胞表達，這些有可能是兩者具有不同生物學(xué)效應(yīng)的原因之一。IL-2抑制記憶性T細胞在體內(nèi)的存活，但是IL-15卻能激活，維持和擴增CD8+記憶性T細胞。IL-2可以誘導(dǎo)AICD，而IL-15則不會誘導(dǎo)此作用。IL-2激活tregs，并維持其活性和功能，而tregs細胞對免疫的各個方面都有負調(diào)節(jié)作用，而IL-15不激活tregs，解除tregs對T細胞的抑制作用。長時間的使用IL-2仍然存在一定的毒副作用，其中最常見、最嚴重的是毛細血管滲漏綜合癥，而IL-15毒性較小。這可

以解釋我們實驗觀察到了IL-15較IL-2更能刺激T淋巴細胞增殖，維持T淋巴細胞活性的作用。

鑒于以上分析，在腫瘤的免疫治療中，IL-15可能是一種更好的DC免疫佐劑，具有更好的免疫治療效果和臨床應(yīng)用前景[10]。

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·論著·

A Study on IL-15 as an Adjuvant for DC Vaccine Strategy to T Cell Response in Vitro

ZHAO Yu,ZHANG Tao,LIU Huan-yi,etal.

(DepartmentofMedicalOncology,CentralLabofChengduMilitaryGeneralHospital,Chengdu610083,China)

【Abstract】Objective Interleukin-15 (IL-15), compared with IL-2, was used as a potent adjuvant for dendritic cells (DCs)-directed vaccine strategy to activate T cell responses in vitro.Methods Bone marrow-derived DCs (BMDCs) were pulsed with tumor antigens and were injected subcutaneously into mice,14 days later, splenocytes were harvested and cultured in vitro with BMDCs to stimulate lymphocyte responses in the presence of IL-2 or IL-15 for 7 days. The activated T lymphocytes were examined by flow cytometric analysis, interferon-γ (IFN-γ ) enzyme-linked immunospot and cytotoxicity assays.Results IL-15 could enhance the expression of CD69+and CD44+、cytotoxicity and IFN-γ production.Conclusion The use of IL-15 acting as a potent adjuvant for DC-directed vaccine strategy may offer alternative choices for the immunotherapy of cancer.

【Key words】interlekin 15; interlekin 2;CD8+T cell response; dendritic cells

[收稿日期2014-06-15]

【中圖分類號】R392

【文獻標識碼】A

【文章編號】1008-8164(2014)03-0001-04

作者簡介趙煜(1983- )，女，四川綿陽人，碩士，研究方向：腫瘤生物治療。