摘要:文章系利用硅酸(由tetramethoxysilane水解產(chǎn)生)及polyallylamine進(jìn)行仿生氧化硅包覆脂解酶(from Pseudomonas cepacia),并以包覆后脂解酶催化大豆油或廢食用油與甲醇進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。以反應(yīng)曲面法和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)探討反應(yīng)溫度、受質(zhì)莫耳比(methanol/oil)、含水量(w/w of oil)對生質(zhì)柴油含量的影響。
關(guān)鍵詞:包覆;相脂解酶;硅酸;催化特性;脂肪酸 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A
中圖分類號:TQ645 文章編號:1009-2374(2015)31-0005-02 DOI:10.13535/j.cnki.11-4406/n.2015.31.003
1 脂解酶簡介
1.1 脂解酶根據(jù)其催化特性分類
1.1.1 非特異性脂解酶(non-specific lipase)。此類脂解酶并不對三酸甘油酯的酯鍵有選擇性,即脂解酶對三個酯鍵均可以進(jìn)行反應(yīng)(如水解、轉(zhuǎn)酯化反應(yīng))。
1.1.2 1,3特異性脂解酶(1,3-specific lipase)。此類脂解酶只會對三酸甘油酯上之第1、3位之酯鍵進(jìn)行反應(yīng),第2位之酯鍵則否。以水解三酸甘油酯為例:當(dāng)1,3特定位脂解酶將三酸甘油酯水解成1,2或(2,3)-diglycerides,此時(shí)第2位酯鍵會自發(fā)性進(jìn)行?;D(zhuǎn)移(acyl migration)至第1或(3)位,進(jìn)而再被1,3特異性脂解酶水解。
1.1.3 特定脂肪酸脂解酶(fatty acid specific lipase)。如Geotricbum candidium生產(chǎn)之脂解酶只對特定結(jié)構(gòu)之脂肪酸有活性。此脂解酶只對三酸甘油酯中,第九個碳上有順式雙鍵的不飽和脂肪酸進(jìn)行反應(yīng)。對于飽和脂肪酸(無雙鍵)、第九個碳上為單鍵則無反應(yīng)。
1.2 生理及物理之特性
1.2.1 微生物脂解酶通常比植物或動物脂解酶更具穩(wěn)定性。
1.2.2 嗜熱微生物脂解酶在高溫與不利的化學(xué)環(huán)境下較為穩(wěn)定,極具工業(yè)應(yīng)用之潛力。
1.2.3 由于酵素的專一性,不必要的副產(chǎn)物可以減少。
脂解酶是水解酵素的成員之一,作用于羧酸酯鍵。其生理角色是水解三酸甘油酯產(chǎn)生雙酸甘油酯、單酸甘油酯、脂肪酸、甘油。除了可水解羧酸酯鍵,脂解酶亦可在非水相環(huán)境下催化酯化反應(yīng)、內(nèi)酯化反應(yīng)、轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。因此,多元化的催化能力使得脂解酶可以應(yīng)用于食品、清潔劑、制藥、皮革、紡織、化妝品、造紙工業(yè)等(Hasan et al.,2006)。
2 Pseudomonas cepacia脂解酶介紹
在醇解反應(yīng)中探討不同微生物來源之脂解酶,其中Pseudomonas cepacia脂解酶催化醇解反應(yīng)并加入油重1~20wt%之水分,反應(yīng)90h后脂肪酸甲酯含量超過80%。當(dāng)水含量低時(shí),Candida rugosa及P.fluorescens脂解酶其反應(yīng)速度顯著下降,顯示水可避免甲醇使這些酵素失活。另外,P.cepacia脂解酶于醇解反應(yīng)中醇油莫耳比高達(dá)2∶1或3∶1時(shí),仍能達(dá)到高甲基酯含量,故P.cepacia脂解酶較其他微生物來源之脂解酶對醇類耐受性較高。
以X-ray結(jié)晶法分析P.cepacia脂解酶在無抑制劑下之結(jié)晶結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)顯示脂解酶含有α/β水解酶折迭以及三個具催化活性之殘基Ser87、His286、Asp264。此酵素與同源之P.glumae脂解酶及Chromobacterium viscosum脂解酶在結(jié)構(gòu)上有數(shù)個共通點(diǎn),其中包含Ca2+結(jié)合位。此脂解酶呈現(xiàn)openconformation,其中包含溶劑可接觸之活性位;相較于P.glumae脂解酶,其活性位隱藏于關(guān)上之“l(fā)id”之下。P.cepacia脂解酶之open conformation顯示此酵素可在油水接口活化,活化時(shí)應(yīng)伴隨二級結(jié)構(gòu)之調(diào)整使“l(fā)id”開啟,將活化位暴露于外。
3 包覆相脂解酶活性分析
(1)包覆相脂解酶活性測量方法是將810μL的50mM Tris HCl buffer,pH8.0(含有0.4% TritonX-100及0.1%arabic gum)、90μL pNPL與100μL包覆相脂解酶溶液混合;(2)將此反應(yīng)置于hybridization oven中反應(yīng)溫度37℃,50rpm,反應(yīng)10min;(3)離心5min后抽取上清液,以去離子水稀釋10倍后在A410下測量其吸收,再利用pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算活性。
4 制備包覆相脂解酶
(1)取228μL tetramethoxysilane(TMOS)并加入1272μL 1mM HCl,于室溫下反應(yīng)15min使其水解,最終濃度為1M。由于水解后之TMOS長時(shí)間儲存會凝結(jié)成膠,故每次包覆前均需準(zhǔn)備全新之TMOS水解溶液;(2)包覆之反應(yīng)溶液中包含7.5mL 0.1M KH2PO4(pH7.8,含有0.1NNaOH)、1.5mL 1M TMOS、1.5mL 500mg/mL脂解酶與1.5mL去離子水,最后加入3mL 5mM PAA以起始反應(yīng);(3)于室溫下反應(yīng)5min后,以離心(×100g,2min)進(jìn)行固液分離并抽出上清液,接著使用15mL去離子水清洗包覆相脂解酶兩次,懸浮于去離子水中,最后將其冷凍干燥備用;(4)包覆效率系以下列公式計(jì)算:,殘余脂解酶量系指上清液及清洗液中脂解酶之含量,測定其脂解酶之活性,并由脂解酶濃度-活性標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算;(5)活性回收系以下列公式計(jì)算:。
5 包覆相脂解酶之特性
本研究中包覆效率(包覆相酵素質(zhì)量/添加酵素質(zhì)量)為93%±9%。未包覆脂解酶其比活性為24±11U/mg,包覆相脂解酶之比活性為15±8U/mg;平均活性回收(包覆相脂解酶比活性/液相脂解酶比活性)為58±5%,以上實(shí)驗(yàn)次數(shù)均為5次。先前研究中以TMOS將P.cepacia脂解酶包覆;其包覆率為96%,活性回收為51%,與本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近。而McAuliffe等人(2005)以polyethyleneimine(PEI)催化仿生氧化硅形成,用以包覆脂解酶,其活性回收低于10%;明顯較本研究為低。
經(jīng)鉬硅酸鹽比色法之結(jié)果顯示,以PAA為形成氧化硅之模板,其氧化硅產(chǎn)量為每100μl反應(yīng)體積產(chǎn)生0.73±0.09mg(N=3),可換算出酵素承載量為6.7±0.8g脂解酶/g SiO2(N=3)。Pencreac'h與Baratti指出Amano公司之商業(yè)化脂解酶,經(jīng)過Lowry法之檢測,脂解酶粉末所含之蛋白質(zhì)約只占其質(zhì)量6%(60mg/g powder,6%),水分約占2.3%。相較于Chen等人之研究結(jié)果,其氧化硅產(chǎn)量為每100μL反應(yīng)體積產(chǎn)生0.24mg;其原因可能為本研究采用PAA之濃度為5倍(5mM vs.1mM),先前研究指出氧化硅生成量與催化劑使用濃度有關(guān)。
6 轉(zhuǎn)酯化條件
無論有無包含脂解酶或經(jīng)冷凍干燥處理,其形態(tài)并無明顯之差異,均為顆粒與顆粒彼此相互融合或團(tuán)聚而形成之結(jié)構(gòu)。為準(zhǔn)確控制含水量,采經(jīng)冷凍干燥后之包覆相脂解酶進(jìn)行生質(zhì)柴油轉(zhuǎn)化。
進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)時(shí),許多條件均會影響轉(zhuǎn)酯化之結(jié)果,如反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、醇油莫耳比、甲醇批次添加與否、含水量、酵素添加量等。以上諸多因子中選取有影響性之因子,再以反應(yīng)曲面法探討因子間之交互關(guān)系并找出最適化之反應(yīng)條件。
制備生質(zhì)柴油最常以蔬菜油為原料,但其成本過于高昂又有與民爭食之疑慮,因此,選擇成本較低廉之廢食用油是為經(jīng)濟(jì)又環(huán)保的做法。
大豆油與廢食用油之酸價(jià)分別為0.3±0.1、1.4±0.1mg KOH/g(N=3),顯示廢食用油于使用過程中可能發(fā)生氧化及水解,使酸價(jià)較大豆油高約5倍。而本研究所使用之大豆油及廢食用油之皂化價(jià)分為175及195mg KOH/g,兩者無明顯差距。
7 結(jié)語
溫度是決定酵素反應(yīng)速率的因素之一,在一定的溫度范圍內(nèi)酵素活性隨溫度升高而增加。高于此溫度范圍后,酵素之構(gòu)型改變造成不可逆之活性喪失;低溫時(shí),酵素作用減緩,然其活性可藉由升溫再度回復(fù)。
Noureddini等人研究固定化P.cepacia脂解酶之最適溫度,發(fā)現(xiàn)于35℃時(shí)有最佳之轉(zhuǎn)酯化活性。以反應(yīng)曲面法探討生質(zhì)柴油之反應(yīng)溫度(40℃、50℃、60℃),結(jié)果最佳溫度為52.1℃。
作者簡介:李志紅(1981-),女,義馬煤業(yè)集團(tuán)煤生化高科技工程有限公司助理工程師,研究方向:生物科學(xué)技術(shù)。
(責(zé)任編輯:周 瓊)