繡球菌水溶多糖的提取及其抑菌效果

亢 爽，劉 娜，張麗霞*

(大慶師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江大慶 163712)

摘要[目的] 從繡球菌中提取水溶多糖，研究其抑菌的效果，為繡球菌的開發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)。[方法] 采用水煮醇沉法獲得繡球菌水溶粗多糖，并采用三氯乙酸法對(duì)其進(jìn)行脫蛋白后，通過(guò)濾紙片法和平板打洞法研究水溶粗多糖與脫蛋白后多糖的抑菌效果。[結(jié)果] 水溶粗多糖含量與得率分別為28.5%、3.0%；脫蛋白后糖含量與得率分別為48.9%、2.2%。繡球菌水溶多糖與去蛋白多糖對(duì)大腸桿菌抑菌效果明顯，濾紙片法去蛋白多糖最小抑菌濃度低于1.6 mg/ml;平板打洞法去蛋白多糖最小抑菌濃度低于25 mg/ml, 對(duì)釀酒酵母、根霉菌、黑曲霉具有抑菌效果；去蛋白水溶多糖抑菌效果較水溶粗多糖好。[結(jié)論]繡球菌水溶多糖對(duì)不同菌具有不同的抑菌效果。

關(guān)鍵詞繡球菌；水溶多糖；脫蛋白；抑菌效果

中圖分類號(hào)S-03

基金項(xiàng)目黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201410235006)。

作者簡(jiǎn)介亢爽(1992-)，男，黑龍江哈爾濱人，本科生，專業(yè)：生物技術(shù)。*

收稿日期2015-06-10

Extraction of Water Soluble Polysaccharide inParassiscrispaand Its Antibacterial Effect

KANG Shuang, LIU Na, ZHANG Li-xia*(School of Life Science, Daqing Normal College, Daqing，Heilongjiang 163712)

Abstract[Objective] The water soluble polysaccharide was extracted from Parassis crispa and the antibacterial effect was studied to provide the experimental basis for the development and the utilization of Parassis crispa. [Method] The water boiling and alcohol precipitation was adopted to obtain the water soluble crude polysaccharide in Parassis crispa, and trichloroacetic acid method was used to deproteinize the polysaccharide. The antibacterial effects of water soluble polysaccharide and deproteinization polysaccharide were studied with filter paper method and agar plate hole method. [Result] The content of water soluble crude polysaccharide and the yield were 28.5% and 3.0%, and the content of deproteinization polysaccharide and the yield was 48.9% and 2.2% respectively. The antibacterial effect of water soluble polysaccharide and deproteinization polysaccharide on Escherichia coli was obvious, and the minimal inhibitory concentration of deproteinization polysaccharide with the filter paper method was below 1.6 mg/ml. Minimal inhibitory concentration of deproteinization polysaccharide with agar plate hole method was below 25 mg/ml. It had the antibacterial effect on Saccharomyces cerevisiae, Rhizopus and Aspergillus niger. And the bacterial effect of deproteinization polysaccharide was better than that of water soluble polysaccharide. [Conclusion] The water soluble polysaccharide in Parassis crispa has different antibacterial effect.

Key wordsParassiscrispa; Water soluble polysaccharide; Deproteinization; Antibacterial effect

真菌多糖是一類天然高分子化合物。隨著藥理學(xué)研究的不斷深入，真菌多糖的研究已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的極大興趣。真菌多糖作為生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑，主要作用于機(jī)體的免疫系統(tǒng)，是通過(guò)對(duì)人體細(xì)胞的保健功能來(lái)實(shí)現(xiàn)的。目前，真菌多糖的研究主要集中在免疫調(diào)節(jié)功能、抗腫瘤、降血糖作用和抗氧化作用等方面，對(duì)真菌多糖的抑菌作用卻鮮見報(bào)道。

繡球菌(Sparassiscrispa(Wulfl)Frl)又名繡球蘑、花椰菜菌、地花蘑、白地花、白繡球花，屬無(wú)褶菌目(Aphyllophorales)繡球菌科(Sparass-idaceae)，是一種珍貴的食、藥兩用真菌，其高分子多糖含量可高達(dá)50%，具有抗氧化、抗衰老、防癌抗癌、增強(qiáng)免疫力的功能[1-3]。香菇、杏鮑菇、榆耳等菌多糖對(duì)幾種食品致病菌有明顯的抑菌作用，抗菌作用機(jī)制與多糖成分有一定的關(guān)系[4]。我國(guó)目前對(duì)繡球菌多糖的研究主要集中在培養(yǎng)栽培等方面，對(duì)繡球菌多糖抑菌方面的研究鮮有報(bào)道，因此對(duì)繡球菌多糖抑菌效果的研究很有必要。

1 材料與方法

1.1材料繡球菌子實(shí)體、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、根霉、黑曲霉、釀酒酵母、細(xì)菌培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，組成為牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 000 ml;真菌培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基，組成為馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 000 ml。

1.2方法

1.2.1水溶多糖的提取。采取水煮醇沉法。取繡球菌子實(shí)體，烘干，粉粹，水溶浸提2次，離心，合并濾液，濃縮，醇沉過(guò)夜，離心，沉淀洗滌，常規(guī)干燥，得到水溶粗多糖。

1.2.2多糖含量的測(cè)定。

1.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。取無(wú)水葡萄糖50 mg，定容500 ml，取不同體積于試管中，加水至1.0 ml，加入濃度5%苯酚1.0 ml，混勻，再加入濃硫酸2.5 ml，混勻，靜置，在490 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2多糖含量的測(cè)定。準(zhǔn)確稱取待測(cè)多糖5 mg，置于50 ml容量瓶，定容。吸取1.0 ml，加濃度5%苯酚1.0 ml，混勻，再加濃硫酸2.5 ml，混勻，靜置，490 nm測(cè)吸光度，計(jì)算多糖含量。

1.2.3多糖的初步純化。采取三氯乙酸法脫蛋白。取濃度50%粗多糖，將樣品制成濃度5%糖溶液，冰浴，加入等體積濃度5%三氯乙酸，攪拌，在4 ℃放置4 h，調(diào)pH至中性，濃縮至原體積，離心，取上清液，置于干燥器干燥，得去蛋白多糖。

1.2.4多糖抑菌效果的影響。

1.2.4.1培養(yǎng)基配制。

(1)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。稱取牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂粉20 g，加入蒸餾水1 000 ml，攪拌溶化，分裝，121 ℃，20 min高壓蒸汽滅菌。

(2)PDA培養(yǎng)基。馬鈴薯去皮切塊，加1 000 ml蒸餾水，煮沸10～20 min，紗布過(guò)濾，補(bǔ)加蒸餾水至1 000 ml，加入葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，攪拌溶化，分裝，121 ℃，20 min高壓蒸汽滅菌。

1.2.4.2 供試菌種的活化及均懸液的制備。將供試菌接種于斜面，培養(yǎng)，活化，取一環(huán)于生理鹽水，制備菌懸液，冷藏，備用。

1.2.4.3 濾紙片的制備。用打孔器將定性濾紙片制成直徑5.0 mm的圓形濾紙片，滅菌，備用。

1.2.4.4 多糖對(duì)供試菌最小抑菌濃度的測(cè)定。配制多糖溶液，稀釋不同濃度，浸泡濾紙片，將菌液涂平板，貼濾紙片，在恒溫箱培養(yǎng)，觀察抑菌效果。

1.2.4.5 水溶粗多糖與去蛋白多糖抑菌效果的比較。

(1)濾紙片法[5]。配制粗多糖和去蛋白多糖溶液，浸泡濾紙片，將菌液涂平板，貼濾紙片，在恒溫箱培養(yǎng)，測(cè)定抑菌圈直徑，比較抑菌效果。

(2)平板打洞法[6-7]。配制粗多糖和去蛋白多糖溶液，將菌液涂平板，在培養(yǎng)基上打孔，加入適量粗多糖和去蛋白多糖，恒溫箱培養(yǎng)，測(cè)定抑菌圈直徑，比較抑菌效果。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理。 利用SPSS軟件，處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1繡球菌多糖含量與得率精確稱取10 g繡球菌粉末，采用水煮醇沉法提取繡球菌多糖。采用三氯乙酸法脫蛋白后，得去蛋白水溶多糖。根據(jù)酚硫酸法，得葡萄糖回歸方程為：A=4.6×10-1C+1.1×10-3(R2=0.999 401)。

由表1可知，隨著脫蛋白除雜，繡球菌水溶多糖含量明顯增加，但多糖得率降低。

表1　繡球菌水溶多糖含量與得率　%

2.2多糖抑菌效果 由表2可知，繡球菌水溶多糖對(duì)釀酒酵母、根霉菌和大腸桿菌均有抑制作用，且不同菌受不同多糖種類的抑制，如大腸桿菌極易受脫蛋白的多糖抑制，最小抑菌濃度為1.6 mg/ml。

表2　采取濾紙片法測(cè)定繡球菌水溶多糖的抑菌效果　mg/ml

注：“0”表示無(wú)最小抑菌濃度。

表3　平板打洞法測(cè)定繡球菌水溶多糖的抑菌效果　mg/ml

注：“0”表示無(wú)最小抑菌濃度。

由表3可知，采取平板打洞法繡球菌多糖對(duì)根霉菌、黑曲霉和大腸桿菌均有抑制作用，最小抑菌濃度均為25 mg/ml。但是，不同菌受不同多糖種類的抑制。

3小結(jié)

一定濃度的繡球菌水溶多糖與去蛋白多糖對(duì)細(xì)菌及少數(shù)真菌均具有抑制作用，且脫蛋白水溶多糖較水溶粗多糖效果更顯著。真菌較細(xì)菌不易受繡球菌多糖的影響，可能是由于其細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)的作用；去蛋白多糖較粗多糖的抑菌效果顯著，可能是與多糖中某種成分的含量有關(guān)；采取濾紙片法測(cè)定繡球菌水溶多糖的抑菌效果較采取平板打洞法顯著，可能是由于濾紙片具有滲透作用，使得多糖與菌液充分接觸。

參考文獻(xiàn)

[1] 裘維蕃,于永年.菌物學(xué)大全[M].北京:科學(xué)出版社,1998.

[2] 王雪冰,趙天瑞,樊建.食用菌多糖提取技術(shù)研究概況[J].中國(guó)食用菌,2010,29(2):3-6.

[3] 李穎,李慶典.桑葚多糖抗氧化作用的探究[J].中國(guó)釀造,2010,217(4):59-61.

[4] 陳穎，朱繼紅，雷秀云，等.榆耳發(fā)酵液抑菌作用的探討[J]中國(guó)食用菌，1990，9(4)：5-7.

[5] 馬建風(fēng),劉華剛,朱丹.中藥體外抑菌研究的方法學(xué)進(jìn)展[J].藥物評(píng)價(jià)研究,2010,33(1):42-45.

[6] 曾維才,譚敏,張佳琪.不同抑菌方法在食品防腐劑效果評(píng)價(jià)方面的比較[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2010,27(3):112-117.

[7] 侯文九,楊鳳影,王維新.中草藥對(duì)刺參腐皮綜合癥病原菌的抑菌試驗(yàn)[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2013,29(5):76-80.