滕 瑤， 王亞光， 費講馳， 劉祝祥， 陳義光， 何則強*

(1.吉首大學 生物資源與環(huán)境科學學院，湖南 吉首 416000；2.中南大學 冶金與環(huán)境學院，湖南 長沙 410083)

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4株高效產(chǎn)電菌的電化學活性及其生物學特征

滕 瑤1， 王亞光1， 費講馳2， 劉祝祥1， 陳義光1， 何則強1*

(1.吉首大學 生物資源與環(huán)境科學學院，湖南 吉首 416000；2.中南大學 冶金與環(huán)境學院，湖南 長沙 410083)

采用循環(huán)伏安法對從湖南省吉首大田灣污水處理廠曝氣池活性污泥中富集和篩選的37株產(chǎn)電菌的電化學活性進行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4株菌株(F012、F015、F021、F026)的電化學活性較為顯著，其中F026的電化學活性最好。對4株產(chǎn)電菌的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，菌株F012屬于Dyella屬，與DyellamarensisCS5-B2T系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切(相似性為97.22%)；菌株F015屬于Paludibacterium屬，與該屬的Paludibacteriumyongneupense5YN8-15T系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切(相似性為97.70%)；菌株F021和F026都屬于Pseudomonas屬，分別與該屬的PseudomonassimiaeOLiT和PseudomonasotitidisMCC10330T系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切(相似性分別為99.60%和98.62%)。生物學特性研究表明，電化學活性最好的產(chǎn)電菌F026的生長溫度范圍為20～40 ℃，最適宜生長溫度為30～35 ℃；生長pH范圍為5～9，最適pH生長范圍為8～9，適合作為微生物燃料電池的高效產(chǎn)電菌。

微生物燃料電池；產(chǎn)電菌；電化學活性；生物學特性

作為一種新型的綠色可再生能源利用技術(shù)，微生物燃料電池(Microbial Fuel Cell，MFC)由于其在有效處理廢水的同時可以產(chǎn)生電能，近年來引起研究者們的廣泛關(guān)注[1-4]。MFC是一種利用產(chǎn)電微生物(Electricigen，又稱產(chǎn)電菌)將有機物或無機物中的化學能轉(zhuǎn)化為電能的新型能源轉(zhuǎn)換裝置。MFC產(chǎn)電基本原理為，產(chǎn)電菌富集在陽極，降解有機物所產(chǎn)生的電子傳輸?shù)疥枠O，再通過外電路負載到達陰極，由此產(chǎn)生外電流；產(chǎn)電菌降解有機物所產(chǎn)生的質(zhì)子則從陽極室通過分隔材料到達陰極，在陰極上與電子、氧氣反應生成水，從而完成MFC內(nèi)電荷的傳遞[5-8]。在MFC整個產(chǎn)電過程中，起決定作用的是電子在陽極區(qū)的傳遞，其中能夠利用有機物維持生長，氧化有機物，并將獲得的電子傳遞到陽極的微生物即稱為產(chǎn)電菌。產(chǎn)電菌傳遞電子的過程是MFC實現(xiàn)能量轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵步驟，也是MFC整個產(chǎn)電過程的決速步驟[9]。由于不同的產(chǎn)電菌的產(chǎn)電能力差異很大，產(chǎn)電菌對MFC的功能與應用起著決定作用，被認為是MFC 體系的核心?，F(xiàn)有研究已經(jīng)表明，具有電化學活性的產(chǎn)電菌呈現(xiàn)多樣性[10-12]，而利用分子生物學手段分析中國地區(qū)陽極生物膜的優(yōu)勢菌群，所得結(jié)果中極少見到已有文獻報道的已分離出的菌屬[13-15]，說明不同地域有不同種類的優(yōu)勢產(chǎn)電菌群，不同種類產(chǎn)電菌產(chǎn)電機制也可能因不同的代謝機制而呈現(xiàn)不同的類型。因此運用富集、培養(yǎng)、分離、純化等手段篩選出產(chǎn)電菌，并獲得本區(qū)域主要的優(yōu)勢產(chǎn)電菌群，對于研究MFC產(chǎn)電機制、優(yōu)化MFC產(chǎn)電模型具有重要的理論與實踐意義。本課題組利用湖南省吉首市大田灣污水處理廠曝氣池中的污泥進行富集培養(yǎng)，應用純培養(yǎng)法分離純化得到了37株產(chǎn)電菌[16]，對其產(chǎn)電性能進行了研究[17]。本研究采用循環(huán)伏安法對分離得到的菌株進行電化學活性篩選，并對篩選得到的4株電化學活性顯著的產(chǎn)電菌的形態(tài)特征、生理生化特征進行分析，以期為高效產(chǎn)電菌的分離及其在MFC中的應用提供一定的理論依據(jù)和實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 所用菌種由本課題組對湖南省吉首市某污水處理廠曝氣池的產(chǎn)電菌富集、分離、培養(yǎng)和保藏[16]。

1.1.2 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基參照文獻[16]進行配制，富集采用NB培養(yǎng)基，而分離、培養(yǎng)和保藏采用NA培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑和儀器 萬用表(UT800，優(yōu)利德)；PCR儀(PE29600型，BIO-RAD公司)；電化學工作站(CHI660B，上海辰華)；玻碳電極(GC130，天津艾達恒晟)；鉑電極(Pt005，天津艾達恒晟)；Ag/AgCl 電極(R0302，天津艾達恒晟)；電解池(C001，天津艾達恒晟)。生理生化分析常用試劑同文獻[18]，PCR引物、PCR 常規(guī)操作所用試劑和酶均由上海生工生物工程有限公司提供，其他試劑和儀器均購自湖南邵陽科學儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的電化學活性篩選 為了測定分離所得菌株的電化學活性，將菌株放入已滅菌的NA液體培養(yǎng)基中，置入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱于28 ℃條件下培養(yǎng)48 h后取20 mL菌懸液，經(jīng)離心、清洗后重懸于50 mmol/L NaCl的磷酸鹽緩沖溶液中。以玻碳電極為工作電極、鉑絲電極為對電極、Ag/AgCl為參比電極構(gòu)成三電極體系，在CHI660B電化學工作站上進行循環(huán)伏安測試。測試時為保持厭氧條件，測試體系置于高純氮氣中，掃描速率為0.002 V/s、掃描電壓范圍為-1.0～0.6 V。

1.2.2 菌株生物學特征分析 形態(tài)觀察、培養(yǎng)條件、生理生化特性等生物學特征按文獻[19]推薦方法進行；革蘭染色用傳統(tǒng)染色法[20]和KOH法[21]進行。

1.2.3 16S rRNA 基因序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析 總DNA提取、16S rRNA 基因的PCR擴增、PCR產(chǎn)物純化和序列測定參照文獻[22]進行。根據(jù)測序結(jié)果提交到GenBank注冊，從GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中調(diào)出相似性較高的相關(guān)菌株的16S rRNA 基因序列。用CLUSTAL.X 軟件進行多重對比[23]，用MEGA 3.1軟件包采用鄰接法(Neighbor-joining method)進行聚類分析，進行同源性比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的電化學活性

在MFC研究中，常用循環(huán)伏安法來表征微生物菌株和菌群的電化學活性[25-27]，或者被用來判斷體系中是否存在由微生物產(chǎn)生的電子穿梭體或電子介體[28]。本研究采用循環(huán)伏安法對從剩余污泥中富集分離的菌株的電化學活性進行考察，以篩選出電化學活性較好的產(chǎn)電菌。結(jié)果表明，在52株菌受試中有37株菌具有不同程度的電化學活性，其中4株菌的電化學活性表現(xiàn)較為顯著，分別是F012、F015、F021和F026。圖1為4株菌的循環(huán)伏安曲線。為了比較，對沒有添加產(chǎn)電菌的體系的循環(huán)伏安也進行了測定[1]。圖1表明，沒有添加產(chǎn)電菌的體系，循環(huán)伏安曲線近似為一條電流為0的直線，說明該體系本身基本沒有電化學活性。而添加了產(chǎn)電菌的各體系的循環(huán)伏安曲線都體現(xiàn)出一定的氧化還原峰，表明各產(chǎn)電菌具有不同程度的電化學活性[1]。其中F012的循環(huán)伏安曲線包圍的面積最小，而F026的面積最大，說明在所研究的4株產(chǎn)電菌中F026具有最優(yōu)的電化學活性，可能適合作為微生物燃料電池的產(chǎn)電菌。

圖1 4株產(chǎn)電菌的循環(huán)伏安曲線Fig.1 Cyclic voltammetry curves of the four electricigens

2.2 產(chǎn)電菌的生物學特征

對4株電化學活性較好的菌株進行培養(yǎng)特征、形態(tài)特征和生理生化特征等部分主要生物學特性的觀察，結(jié)果見表1。由表1可知，4株高產(chǎn)電活性菌株均為革蘭陰性、無芽胞菌，均能水解尿素，但都不能水解淀粉和酪素；各產(chǎn)電菌最適生長溫度在25～35 ℃之間，最適pH生長范圍為7～9。其中電化學活性最好的產(chǎn)電菌F026的最適生長溫度為30～35℃，最適pH生長范圍為8～9。

表1 4株電化學活性較強的產(chǎn)電菌的生物學特性

Table 1 Biological characteristics of four electricigens with good electrochemical activities

特征F012F015F021F026菌落顏色乳白色淺粉色淺黃色淡黃色細胞形態(tài)桿狀球狀桿狀桿狀生長溫度/℃溫度范圍15～305～3015～3520～40最適溫度252520～3030～35生長pH值pH范圍5～95～95～105～9最適pH7～87～98～98～9多聚物水解明膠---++吐溫-20+W--吐溫-40+--+吐溫-60+W-+吐溫-80+--+

注：“+”代表陽性；“-”代表陰性；“W”代表微弱陽性

2.3 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析

對菌株F012、F015、F021、F026的16S rRNA基因進行了PCR、純化和序列測定，并進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，系統(tǒng)進化樹見圖2。結(jié)果表明，菌株F012屬于Dyella屬，與DyellamarensisCS5-B2T系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切(相似性為97.22%)；菌株F015屬于Paludibacterium屬，與該屬的Paludibacteriumyongneupense5YN8-15T系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切(相似性為97.70%)；菌株F021和F026均屬于Pseudomonas屬，分別與該屬的PseudomonassimiaeOLiT和PseudomonasotitidisMCC10330T系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切(相似性分別為99.60%和98.62%)。

根據(jù)圖2的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，采用16S rRNA 基因序列相似性大于97%的菌株屬于同一物種的歸類原則[23]，分離的菌株與其相關(guān)有效發(fā)表種的典型菌株的16S rRNA基因序列相似性在97.22%～99.60%之間，說明菌株與其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最密切的相關(guān)菌株間存在較大的遺傳差異。

圖2 4株產(chǎn)電菌及其從GenBank等數(shù)據(jù)庫中調(diào)集的相關(guān)屬種構(gòu)建的以16S rRNA基因序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)樹狀關(guān)系圖Fig.2 Neighbor-Joining tree constructed showing the phylogenetic relationships among four electricigens and other related strains from GenBank based on 16S rRNA gene sequence

3 討 論

產(chǎn)電菌具有豐富的物種多樣性。已在細菌域、古菌域和真核生物域中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)電菌，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)電菌種類會不斷增加。本研究以污水處理廠的剩余污泥為反應物，對其中產(chǎn)電菌進行富集和篩選，采用循環(huán)伏安法對各產(chǎn)電菌的電化學性能進行評價。通過基于16S rRNA 對電化學活性較強的產(chǎn)電菌進行基因序列的系統(tǒng)發(fā)育多樣性的分析，并對其進行生理生化分析對比。研究表明，從剩余污泥中富集分離得到的52株產(chǎn)電菌中有37株具有一定的電化學活性，其中4株產(chǎn)電菌(F012、F015、F021和F026)電化學活性較強，而F026電化學活性最強。4株產(chǎn)電菌的最適生長溫度在25～35 ℃之間，最適pH生長范圍為7～9，其中F026的最適生長溫度為30～35 ℃，最適pH生長范圍為8～9。研究結(jié)果說明F026可在30～35 ℃和弱堿性條件下生長，并體現(xiàn)出最好的電化學活性，有望應用于MFC中。由于產(chǎn)電菌是MFC的核心，如何通過選育優(yōu)質(zhì)產(chǎn)電菌并優(yōu)化其生長條件，對MFC在廢水處理中的應用及其產(chǎn)電性能的提高具有重要意義。

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Electrochemical Activities of Four Efficient Electric-Producing Bacteria & Their Biological Characteristics

TENG Yao1, WANG Ya-guang1, FEI Jiang-chi2, LIU Zhu-xiang1, CHEN Yi-guang1, HE Ze-qiang1

(1.Coll.ofBio-Res. &Environm’lSci.,JishouUni.,Jishou416000; 2.Schl.ofMetallurgy&Environm’t,CentralS.Uni.,Changsha410083)

Electrochemical activities of 37 electric-producing (EP) bacterial strains were enriched and screened from an aerator in Datianwan Sewage Treatment Plant located in Jishou city, Hunan Province. They were studied using cyclic volta-ampere technique. It was found in the results that four EP strains (F012, F015, F021 and F026) had fairly obvious electrochemical activities, among them strain F026 had the best. The phylogentic analyses of the four EP strains indicated that strain F012 was closely related to genusDyellawith 16S rRNA gene sequence similarity at 97.22% (DyellamarensisCS5-B2T); and strain F015 belonged to the genus ofPaludibacterium, and had the closest relation toPaludibacteriumyongneupense 5YN8-15Tof the genus with 16S rRNA gene sequence similarity at 97.70%. Strains F021 and F026 belonged to the genus ofPseudomonas, and had the closest relation toPseudomonassimiaeOLiTandPseudomonasotitidisMCC10330Twith 16S rRNA gene sequence similarity at 99.60% and 98.62% respectively. The results of biological characteristics showed that strain F026 had the best electrochemical activity and grew well at 20～40 ℃, with optimal temperatures at 30～35 ℃, pH range at 5～9 with optimal pH at 8～9, suggesting F026 is a promising efficient EP strain for microbial fuel cell (MFC).

microbial fuel cell (MFC); electric-producing bacteria; electrochemical activities; biological characteristics

國家自然科學基金項目(51262008，51472107)；湖南省自然科學基金項目(12JJ2005)；湖南省科技計劃重

滕瑤 女，碩士研究生。從事微生物燃料電池研究。E-mail:tell1030@126.com

* 通訊作者。男，博士，教授，碩士生導師。主要從事功能材料和廢物資源化利用研究。E-mail:csuhzq@163.com

2014-12-22；

2015-03-25

Q939.1

A

1005-7021(2015)06-0027-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.06.005

點項目(2012GK2017)；湖南省重點學科建設(shè)項目(JSU0713)