蔡順萍 李 幸 王瑞深

(1.深圳市光明新區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所,廣東深圳 518107;2.深圳市光明新區(qū)光明動植物防疫檢疫站,廣東深圳 518107)

口蹄疫病毒TaqMan 實時熒光定量PCR檢測試劑盒的比較試驗

蔡順萍 李 幸 王瑞深

(1.深圳市光明新區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所,廣東深圳 518107;2.深圳市光明新區(qū)光明動植物防疫檢疫站,廣東深圳 518107)

本研究通過對深圳市場上常見的3個品牌（A，B，C）的口蹄疫病毒TaqMan 實時熒光定量PCR檢測試劑盒的外觀和物理性狀、特異性、靈敏度、重復性和穩(wěn)定性符合率進行比對。結果顯示，試劑盒A外包裝完整，標簽牢固且采用了具有隔熱層的凍存管保存關鍵性試劑，包裝較為科學；3家試劑盒中反應時間最長的C（61.75min）與最短的B（56.75min）相差5min；A，B，C試劑盒對口蹄疫陽性樣本檢測均呈陽性，對豬瘟等6種非口蹄疫陽性樣本檢測呈陰性；A比B試劑盒的檢出Ct值提前1～2個Ct值，比C試劑盒檢出Ct值提前1～4個Ct值；在樣本濃度相對高時（稀釋梯度≥2×10-4），3個廠家的試劑盒都較穩(wěn)定，在樣本濃度相對低時（稀釋梯度在2×10-5時），3個廠家試劑盒都有不同程度的不穩(wěn)定，A試劑盒3個平行樣均有陽性擴增，但其中一個樣檢出熒光增量相對較低；B和C試劑盒均出現無擴增樣品。結論：3家試劑盒中，A產品使用具有隔熱層的凍存管保存關鍵性試劑，且靈敏度較高、特異性較強、穩(wěn)定性較佳，適用于臨床檢測。

熒光定量PCR 口蹄疫病毒 試劑盒比對

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒引起的急性、熱性、高度傳染性人畜共患病，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為15個A類傳染病之首。口蹄疫不僅嚴重危害畜牧業(yè)生產，影響食品安全，而且危及人類的健康。同時由于口蹄疫發(fā)生范圍較廣，單純依靠撲殺措施不僅難以控制疫情，還需付出巨大的代價。因此，世界上許多國家（包括我國）采取撲殺和疫苗接種相結合的防疫政策，所有大型養(yǎng)殖企業(yè)，偶蹄動物均需接受口蹄疫疫苗注射。但是，經過免疫的動物群攜帶病毒的現象仍時有發(fā)生，且免疫動物群中感染的微量病毒在免疫壓力的作用下，有可能進一步發(fā)生抗原變異，產生新的流行毒株[1]。動物接種疫苗后，常規(guī)的檢測方法由于不能區(qū)分感染抗體和疫苗免疫抗體，無法通過抗體監(jiān)測來發(fā)現病毒感染的動物群，致使對群體的野毒感染狀況無法調查。此外，現今屠宰檢疫主要依靠官方獸醫(yī)臨床檢疫來確定動物是否感染口蹄疫病毒，當遇到病畜感染初期或感染多種病菌而導致臨床病癥不明顯時，官方獸醫(yī)的臨床檢疫存在一定的困難，且存在一定的誤判。

實時熒光PCR技術，因其具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優(yōu)點而被廣泛應用于分子生物學研究、醫(yī)學研究和動植物疾病診斷中。因此，眾多動物疫病的國標檢測方法中，都包含了實時熒光PCR技術。作為一種法定的診斷方法，該技術應用于口蹄疫檢測也將成為預防動物疫病和動物部品檢疫的必然方向。目前，市場上檢測口蹄疫病毒的熒光試劑盒種類繁多，進口試劑盒價格昂貴；而國產試劑盒性價比高，但質量參差不齊。因此，為評估國產試劑盒的質量，本研究對深圳市場上常見的3家口蹄疫試劑盒進行各項指標的比對，為實驗室進行臨床檢驗提供一定的依據。

1 材料

1.1 試劑盒

采購深圳市場上3家口蹄疫病毒實時熒光PCR檢測試劑盒，分別用A、B、C代碼表示。RNA提取試劑盒購自澳東生物制品有限公司。

1.2 陽性樣本

口蹄疫病毒O型抗原購自中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.3 疫苗

用于比對的豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬流感病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2 型、豬細小病毒病疫苗購自武漢科前生物股份有限公司，此6種疫苗均已通過相應RT-PCR試劑盒確定為陽性樣本。

表1 3種口蹄疫熒光PCR試劑盒的外包裝和物理性質比較

1.4 主要儀器

由表1可看出，3家試劑盒外包裝均完整無損，但A試劑盒相對B試劑盒，有標簽穩(wěn)固不易脫落的優(yōu)點；相對于B和C試劑盒，使用了具有隔熱層的凍存管保存關鍵性試劑，降低了酶等試劑因溫度影響而失效的風險。因此，A試劑盒在包裝上優(yōu)于B和C試劑盒。

表2 3種試劑盒反應體系和反應總時間

3.2 反應體系和反應總時長

3家試劑盒中，反應體系的總時長最短的是B試劑盒的56.75min，其次是A試劑盒的58.83min，最長是C試劑盒的61.75分鐘之間，最長與最短反應總時長相差5min（表2），反應體系總時長無太大的差異。

3.3 特異性

3家試劑盒經特異性實驗結果顯示，口蹄疫病毒0型樣本提取的核酸檢測結果均呈陽性，而豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬流感病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2 型、豬細小病毒病提取的核酸檢測結果均呈陰性，說明3種試劑盒都有較好的特異性（圖1～圖3）。

圖1 A試劑盒特異性結果

圖2 B試劑盒特異性結果

圖3 C試劑盒特異性結果

3.4 靈敏度

3.4.1 Ct值的比較

根據3.2的3個試劑盒的反應體系對比可知，A試劑盒較B和C試劑盒多5個預循環(huán)，即檢測同一樣本時，該試劑盒檢測結果顯示的Ct值會比無預循環(huán)的試劑盒檢測結果提前5個Ct值，因此，用于比對的A試劑盒檢測結果的平均Ct值需額外加5個Ct值。

靈敏度檢測結果顯示（表3，圖4～圖6），將相同濃度樣本的3個平行樣的平均Ct值進行比對，A比B試劑盒的檢出Ct值提前1～2個Ct值，比C試劑盒檢出Ct值提前1～4個Ct值，即A優(yōu)于B，優(yōu)于C試劑盒。

圖4 A試劑盒靈敏度實驗結果

表3 3家試劑盒不同稀釋濃度的Ct值對比

圖5 B試劑盒靈敏度實驗結果

圖6 C試劑盒靈敏度實驗結果

3.4.2 穩(wěn)定性

同樣由靈敏度結果（表3，圖4、5、6）可知，在樣本濃度相對高時，（稀釋梯度≥2×10-4），3個廠家的試劑盒都較穩(wěn)定，在樣本濃度相對低時（稀釋梯度在2×10-5時），3個廠家試劑盒都有不同程度的不穩(wěn)定。其中在檢測口蹄疫RNA（2×10-5濃度梯度）樣本（3個平行樣）時A試劑盒3個平行樣均有陽性擴增，但其中一個樣檢出熒光增量相對較低；B試劑盒有一個樣品有陽性擴增；C的試劑盒有兩個樣品陽性擴增。

取B和C試劑盒，按2.4.2實驗方法對口蹄疫RNA（2X10-5濃度梯度）樣本進行3個平行樣的重復實驗結果顯示（圖），B試劑盒檢測的3個平行樣中有一個陽性擴增，Ct值為38、15、34，C試劑盒檢測的3個平行樣均無擴增（見圖7、8）。因此，A試劑盒的穩(wěn)定性比B、C試劑盒較好。

圖7 B家試劑盒檢測口蹄疫RNA（2X10-5）3個平行樣實驗結果

4 結論

通過對A，B，C3家口蹄疫病毒熒光PCR試劑盒的外觀，物理性質和對相同樣本的特異性、靈敏度和重復性實驗進行對比，結果顯示：A產品使用具有隔熱層的凍存管保存關鍵性試劑，且具有靈敏度較好，特異性強，重復性較好的特性。因此，A試劑盒要優(yōu)于B和C試劑盒，更適用于臨床檢測篩選。

圖8 C試劑盒檢測口蹄疫RNA（2X10-5濃）3個平行樣結果

5 討論

世界動物衛(wèi)生組織將口蹄疫列為法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病[5-6]。2013年至2014年，我國共計報告發(fā)生A型口蹄疫疫情22次，疫點分布廣東、青海和云南等6個省、自治區(qū)。從監(jiān)測陽性區(qū)域分布來看，我國口蹄疫病毒污染面較廣，病原長期存在，清除難度大。除此，境外毒株傳入風險增加，對我國口蹄疫防控構成重大威脅，每次從境外傳入我國一個新毒株，就會引發(fā)一輪疫情，如2005年Asia1型、2009年Sea-97G1毒株、2010年O型Mya-98毒株、2013年A型Sea-97 G2毒株，分別在我國引起4次高發(fā)[7]。另外，豬群免疫狀況參差不齊，存在疫情發(fā)生的風險，廣東的肉豬群免疫效果一般，抗體合格率接近70%，存在隱性感染和發(fā)病的可能[8]。而且，跨省區(qū)動物移動頻繁，也是導致病情擴散的原因。鑒于口蹄疫疫情危害的嚴重性和防控的困難性，及時、有效地檢測出被感染病豬，是控制疫情暴發(fā)和蔓延的有效措施。實時RT-PCR快速檢測方法的建立與應用，為動物衛(wèi)生部及時確診和有效處置口蹄疫疫情提供了堅實的技術支持。但是，隨著商品化檢測試劑盒的推出，在為檢測工作帶來便利的同時，由于不同廠家試劑盒的敏感性、特異性等有所差異，導致結果會有所偏差，有的甚至會漏檢。因此，需要對這些商品化試劑盒進行評估，以便為選擇最合適的試劑盒對口蹄疫病毒確診提供技術依據。

本研究所選的3個廠家的試劑盒是目前深圳市場常用的試劑盒。我們試驗表明，3家試劑盒均具有較好的特異性，但是依據各自評判標準的靈敏性和重復性試驗結果顯示，3個廠家試劑盒的有所差異，A試劑盒靈敏度和重復性最好，A檢出Ct值比B提前1～2個，比C提前1～4個Ct值，而且樣口濃度越低，差別越大；2X10-5濃度的3個平行樣檢測中，A均有擴增，其中一個平行樣熒光增量較低，B和C均有1-3個平行樣無擴增，這跟各家試劑盒的引物、探針的設計，反應體系和原材料的選擇不同有很大的關系。因此，在檢測樣品的Ct值處于試劑盒判定的臨界值時，建議重復檢測，避免檢測結果的誤判。另外，在日常檢測過程中，對商業(yè)化試劑盒進行定期的檢測結果差異實驗是很有必要的。

本研究所選擇的試劑盒中，有采用核酸片斷或克隆質粒作為陽性對照，無法質控核酸的提取過程。而病毒顆粒的傳染性和裸RNA的不穩(wěn)定性也無法作為RNA的理想質控品，已有應用的盔甲RNA質控品，是一種理想的質控品，可以彌補這一缺陷。

本研究的3家試劑盒，均需要經過提取RNA、反轉錄成cDNA 和PCR的3個步驟，從拿到樣品到出RT-PCR檢測結果，全程至少需要2 h。目前，已有直接擴增實時熒光RT-PCR技術的研究，該技術可以免去提取RNA的步驟，從樣品處理到擴增完成，全程不超過1.5 h，極大地縮短了檢測時間，如應用于臨床檢驗檢疫，將極高的提升檢測效率，對于重大動物疫病的診斷，防控，以及保障公共衛(wèi)生安全，具有重要意義。

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