夏駿，李勇，徐國茂，于學(xué)紅，陳玲珍

（1.江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西南昌 330029；2.南昌市農(nóng)產(chǎn)品檢驗測試中心）

動物源性食品中赭曲霉毒素A毒性和檢測方法研究進展

夏駿1，李勇1，徐國茂1，于學(xué)紅1，陳玲珍2

（1.江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西南昌 330029；2.南昌市農(nóng)產(chǎn)品檢驗測試中心）

赭曲霉素主要為赭曲霉、疣孢青霉和碳黑曲霉等三種霉菌的二級代謝產(chǎn)物。赭曲霉毒素A具有很強的肝臟毒性和腎臟毒性,并有致畸、致突變和致癌作用，且對于不同動物種屬的毒副作用具有差異。赭曲霉毒素A廣泛存在于谷物及谷物產(chǎn)品、草料及飼料產(chǎn)品中，一旦被動物食用后，容易在肌肉、組織中蓄積，進而嚴(yán)重危害人體健康。目前國內(nèi)僅對部分飼料和農(nóng)產(chǎn)品的進行了限量，對于動物源性食品的限量值和檢測方尚未規(guī)定，因此有必要建立快速、靈敏、簡便,適合我國具體國情的赭曲霉毒素A檢測方法，并盡快開展研究，制定動物源性食品的赭曲霉毒素A的限量標(biāo)準(zhǔn)。

赭曲霉毒素A；毒性；檢測方法

赭曲霉素主要為赭曲霉（Aspergillus Ochraceus）、疣孢青霉(Penicillium verrucosum)和碳黑曲霉（Aspergillus carbonarius）等三種霉菌的二級代謝產(chǎn)物。赭曲霉素共7種形式，其化學(xué)結(jié)構(gòu)極其相似，其中毒性最大、與人類健康關(guān)系最密切、對農(nóng)作物的污染最重、分布最廣的是赭曲霉素A（OTA）。飼料中OTA的污染嚴(yán)重，動物進食被OTA污染的飼料后會導(dǎo)致體內(nèi)OTA的蓄積，而且代謝緩慢。因此在動物性食品，尤其是豬組織、禽蛋及牛奶中常被檢出。OTA主要危及人和動物腎臟，還對免疫系統(tǒng)有毒性，并有致畸、致癌、致突變作用。1993年IARC評估后將赭曲霉毒素A歸為二類可能對人類致癌物。

1 OTA的理化性質(zhì)

圖1 赭曲霉素A化學(xué)結(jié)構(gòu)

OTA是異香豆素與苯丙氨酸結(jié)合體的衍生物，分子量為403.08，外觀性狀為無色結(jié)晶，弱酸性，溶于極性溶劑和碳酸氫鈉溶液，微溶于水，在紫外線照射下呈綠色熒光；在苯溶液中，OTA最大吸收波長為333nm，在純乙醇溶液中,最大發(fā)射波長為467 nm[1]?；瘜W(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，其甲醇溶液可在低溫狀態(tài)下保存一年。赭曲霉素耐熱，焙烤只能使其毒性減少20%，蒸煮對其毒性不具有破壞作用。

2 OTA的毒性

大多數(shù)研究結(jié)果表明，OTA具有腎毒性、致癌性和遺傳毒性，在多數(shù)動物體內(nèi)有較長的半衰期。但需要指出的是OTA的藥物吸收、代謝以及毒性對于不同種屬動物有較大差異。

2.1 反芻動物

一般而言，由于反芻動物的瘤胃微生物可代謝轉(zhuǎn)化部分霉菌毒素，所以比單胃動物更能抑制霉菌毒素的危害。研究結(jié)果表明，奶牛攝入OTA后，瘤胃微生物會很快將其轉(zhuǎn)化為低毒性的赭曲霉素-α，只有小部分的OTA吸收到奶牛體內(nèi)[2]。健康奶牛每攝入1kg飼料可代謝12mg的OTA[3]。當(dāng)奶牛攝入的OTA達到1.66mg/kg體重，可檢測到OTA及其代謝產(chǎn)物赭曲霉素-α[4]。同時也有文獻報道，在奶牛體內(nèi)，OTA還可轉(zhuǎn)化為赭曲霉素C，以及羥基-赭曲霉素A[5～6]。由于反芻動物對OTA的代謝主要是由于瘤胃微生物，因此瘤胃中微生物的生理環(huán)境對于OTA的代謝具有重要影響，Pattono的研究表明，由于不同的飼料會改變瘤胃pH，從而影響瘤胃微生物數(shù)量，最終影響OTA的代謝。該研究同時指出，基于此原因，有機牛奶受到OTA污染的風(fēng)險更大[7]。

2.2 非反芻哺乳動物

OTA對于非反芻動物的危害主要體現(xiàn)在腎毒性、神經(jīng)毒性和免疫毒性。豬食用霉變飼料后，約66%的OTA會被豬腸上皮細(xì)胞吸收進入體循環(huán)，吸收后在絕大部分OTA與血清白蛋白結(jié)合，結(jié)合率達99.98%[8]。Herbert的動力學(xué)實驗表明，以0.5mg/kg劑量對大鼠灌胃，24～48h血藥濃度達峰約為4.6～6.0μmol/L，96h后可在尿液和糞便中檢出OTA，完全清除需要230h。對于大部分哺乳動物，OTA主要通過腎臟代謝，對于嚙齒類，主要通過膽汁代謝[9]。

OTA具有強烈腎臟毒性，會抑制腎臟細(xì)胞的增殖，嚴(yán)重減少蛋白的合成，是造成人體巴爾干腎病和泌尿道腫瘤的主要致病因之一。RachedE，Hard GC等對雄性F344大鼠進行攻毒后發(fā)現(xiàn)，動物腎近端小管直部出現(xiàn)核增大和單細(xì)胞死亡，并且在腎細(xì)胞增殖上顯示出明顯的劑量和時間依賴性[10]。匈牙利的一項研究表明，長期飼喂OTA濃度為800μg/ kg的飼料就會導(dǎo)致育肥豬腎臟病變。

OTA同時還具有神經(jīng)毒性和免疫毒性。實驗表明OTA可顯著降低小鼠紋狀體纖維細(xì)胞酪氨酸羥化酶免疫反應(yīng)強度[11]。連續(xù)35d對后備母豬飼喂2.5mg/kg OTA，會導(dǎo)致豬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)受到抑制。另外OTA會減少豬的白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量且升高嗜中性粒細(xì)胞總數(shù)，減弱嗜中性粒細(xì)胞吞噬作用[12]。

國際腫瘤組織已將赭曲毒素A定為可能致癌物質(zhì)之一。研究確認(rèn)OTA是神經(jīng)管缺陷（NTD）的致畸因子，用2mg/kg OTA攻毒7.5d，鼠胎中的NTP的發(fā)病率明顯上升。Fischer實驗結(jié)果表明，雄性大鼠的腎癌發(fā)病率與OTA劑量呈正比，高劑量組（0.21mg/kg）腎癌發(fā)病率高達60%，腎小管腺瘤和腎癌合并發(fā)病率分別為39.2%和72.0%[13]。

2.3 禽類

禽類相對于哺乳動物對OTA更加敏感。除了出現(xiàn)類似哺乳動物的腎臟損傷、神經(jīng)毒性、免疫毒性外，還會出現(xiàn)其種屬特有的病變。低劑量的OTA能延長蛋雞的性成熟、降低產(chǎn)蛋量和孵化率。Huff等在肉雞日糧中添加6種不同濃度的OTA，飼喂4周后證實，OTA對肉雞生長性能產(chǎn)生抑制作用，且抑制程度與毒素含量呈正相關(guān)[14]；原維的實驗結(jié)果表明，OTA對肉雛雞肝臟具有毒性，會導(dǎo)致谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、血清堿性磷酸酶（ALP）數(shù)值升高，會加速肝臟的脂質(zhì)過氧化作用，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，使其發(fā)生形態(tài)學(xué)的變化，而導(dǎo)致肝臟的氧化代謝功能障礙[15]。鴨食用OTA會導(dǎo)致肝臟呈脂肪空泡組織增加引起的肝變性、線粒體間質(zhì)發(fā)生變化、肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組織發(fā)生破壞[16]。

3 檢測方法

目前OTA的檢測方法較為成熟，主要包括薄層色譜法、液相色譜法、毛細(xì)管電泳-二極管陣列檢測法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫吸附法和膠體金免疫層析技術(shù)。其中液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是目前應(yīng)用較廣的儀器確證方法，酶聯(lián)免疫吸附法和膠體金免疫層析技術(shù)主要用于大批量樣品的快速篩選。

3.1 薄層色譜法

薄層色譜法（TLC）是較早用于OTA檢測的一種方法，其優(yōu)點是方法簡單，使用的試劑價格便宜，但是操作繁鎖、靈敏度低，一般無法達到痕量檢測的要求。其檢測原理為：使用三氯甲烷-0.1mol/L磷酸或石油醚-甲醇-水將樣品中的OTA提取出來，樣品提取液跑板后，通過在365nm紫外光燈照射產(chǎn)生的黃綠色熒光與標(biāo)準(zhǔn)的熒光進行比較得到測定含量（GB/TB111-2003）。Dragan R等建立了豬腎臟及肝臟中OTA的殘留量TLC檢測方法，檢測限和定量限分別為0.5μg/kg和1.0μg/kg，回收率為83%[17]。

3.2 高效液相色譜法（HPLC）

由于赭曲霉素A擁有良好的熒光特性，因此使用配置FLD檢測器的高效液相色譜法是目前檢測OTA的常用方法。Bascaran等用HPLC-FLD檢測牛奶中OTA，將牛奶濃縮后直接通過免疫親和柱洗脫，上機，該方法操作簡單，準(zhǔn)確性好，靈敏度較高。陳大義等建立的HPLC-FLD檢測植物性產(chǎn)品的方法，準(zhǔn)確性高，靈敏度好。該方法用1%的磷酸提取后經(jīng)PSA固相萃取小柱凈化，濃縮后用40%乙腈復(fù)溶，上機測定。該方法對大米、玉米、小麥、大麥等樣品的回收率均在90%以上，最低檢測限為0.05μg/kg[18]。

3.3 毛細(xì)管電泳-二極管陣列檢測法（CE-DAD）

毛細(xì)管電泳是以高壓電場為驅(qū)動力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離分析的液相分離方法。曾紅燕等人建立了液-超聲波提取、C18柱凈化和膠束電動毛細(xì)管電泳（MEKC）同時測定糧食樣品中的玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A等真菌毒素的方法。該方法回收率為77.9%～103.1%，變異系數(shù)小于2%[19]。

3.4 高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）

近年來，LC-MS檢測方法也被廣泛的運用到OTA的檢測中，主要是因為該方法檢測霉菌毒素時擁有一致的分離和檢測條件[20]。Michael等用LCMS的方法對農(nóng)產(chǎn)品中的OTA進行測定，將樣品進行溶劑提取后，提取液再通過免疫親和柱凈化后進行檢測分析，該方法的檢測限為15μg/kg，加標(biāo)回收率達到90%。史娜等建立了多種食品中OTA的LC-MS方法。該方法用甲醇-2%碳酸氫鈉溶液(60∶40，V/V)或甲醇-水(80∶20，V/V)提取樣品中的OTA，經(jīng)OchraTest親和柱凈化，以甲醇-5mmol/L(含0.1%甲酸)乙酸銨為流動相，采用正離子模式對赭曲霉毒素A進行檢測，結(jié)果回收率在82.3%～98.5%之間，檢出限為0.1μg/kg[21]。Losit等建立了檢測豬肉組織中OTA的高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法，檢測限為0.61μg/ kg[22]。

3.5 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

ELISA法是將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原-抗體結(jié)合專一性進行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法。該方法準(zhǔn)確度好、靈敏度高、操作簡單，適用于大批量樣本的檢測。但檢測結(jié)果的重現(xiàn)性差，而且由于存在交叉反應(yīng)而易造成假陽性，因此需要用其它的方法來驗證。江濤等建立了OTA的ELISA檢測方法，在2～500ng/L線性范圍內(nèi)，回收率達79%～119.7%，檢測限為0.5ng/L[23]。

3.6 膠體金免疫層析技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。該方法精密度好，操作非常簡單，基本上不需要有機試劑和精密設(shè)備，分析時間短，非常適用于大批量樣品的現(xiàn)場快速檢測。賴衛(wèi)華等建立了牛奶中OTA快速檢測膠體金試紙條，檢測限達10ng/ml，整個過程只有加樣一個步驟，10min即可判定結(jié)果[24]。

3.7 其它檢測方法

除了上述檢測方法外，OTA的檢測方法還包括時間分辨熒光免疫分析[25]、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)[26]和噬菌體隨機肽庫技術(shù)[27]等。

4 結(jié)語

赭曲霉毒素A對家禽、哺乳動物均有嚴(yán)重的毒副作用,會對人類健康、食品安全和國際貿(mào)易產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。世界各國紛紛制定了赭曲霉毒素A的檢測標(biāo)準(zhǔn)和在食品、飼料等中的限量標(biāo)準(zhǔn)。我國在赭曲霉毒素A方面的研究相對落后，僅對飼料、谷物、豆類及其制品制訂了國家限量標(biāo)準(zhǔn)、對于動物源性食品中赭曲霉毒素A的限量和檢測標(biāo)準(zhǔn)尚未建立。因此,在今后的研究工作中,有必要建立快速、靈敏、簡便,適合我國具體國情的赭曲霉毒素A檢測方法，并盡快開展研究，制定動物源性食品的赭曲霉毒素A的限量標(biāo)準(zhǔn)。

[1]Kuiper-Goodman.T,P.M.Scott.Risk assessment of the mycotoxin ochratoxin.A[J].Biomed.Environ.Sci.,1989,(2): 179～248.

[2]鄭楠，王加啟，韓榮偉，等.牛奶質(zhì)量安全主要風(fēng)險因子分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2012，3：1～8.

[3]Hult K,Teiling A,Gatenbeck S.Degradation of ochratoxin A by a ruminant[M].Applied and environmental Microbiology, 1976,32:443～444.

[4]Prelusky D B,Veria D M,Trenholm H L,et al.Metabolic fate and elimination in milk,urine and bile of deoxynivalenol following administration to lactating sheep[J].Journal of Environmental Science and Health B,1987,22:125～148.

[5]Galtier P,Alvinerie M.In vitro transformation of ochratoxin A by animal mirobaial floras[M].Ann Rech Vet,1976,7:97～98.

[6]Chu F S.Studies in ochratoxin[M].CRC Crit Rev Toxicol, 1974,2:499.

[7]Pattono D,Gallo P F,Civera T.Detection and quantification of ochratoxin A in milk produced in organic farms[J].Food Chemistry,2011,127:374～377.

[8]李發(fā)生，徐霞，郭樂，等.赭曲霉素A的毒性研究進展[J].山東畜牧獸醫(yī)，2009，30：58～60.

[9]Herbert Zepnika,Wolfgang,et a1.Toxicokinetics of the mycotoxin ochratoxin A in F 344 rats after oral administration[J]. Toxicology and Applied Pharmacology 2003,1:36～44.

[10]Rached E,Hard GC.Effect of ochratoxin A on redox-regulated transcription factors,antioxidant enzymes and glutathione-S-transferase in cultured kidney tubulus cells[J].Food Chem-Toxicol.2008,46(8):65～71.

[11]Sava V,Velasquez A,Song S,et a1.Adult hippocampal neural stem/progenitor cells in vitro are vulnerable to the mycotoxin ochratoxin-A.Toxicology and Applied Pharmacology 2003,192(1):36～44.

[12]Muller G,Kielstein P,Rosner H,et al.Studies of the influence of ochratoxing A on immune and defence reactions in weaners[J].Mycoses,1999,42(7～8):495.

[13]Fischer W,Hillebrand E,Creepy E,et al.Sister chromatid exchange frequency in cultured isolated porcine urinary bladder epithelial cells treated with ochratoxin A and alpha.arch[J]. Toxicol,1995,69:280.

[14]Huff W E,Wystt R Ds,et al.Ochratoxicosis in broiler chicken[J]Poultry Science,1974,(53):1585～1591.

[15]原維.赭曲霉毒素A對肉雛雞肝臟氧化損傷的研究[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009：7.

[16]Hussein S H,Jeffrey M B.Toxicity,metabolism,and impact of mycotoxins on humans and animals[J].Toxicol,200l, 167(2):101～134.

[17]Dragan R Milicevic,Verica B Juric，Srdan M Stefanovic,et al.Analysis of ochratoxin in pig tissues using high pressure liquid chromatography(HPLC)and liquid chromatography tandem mass spectrometry(LC/MS/MS)as confirmative methods[J].Proceeding of the National Science,2009,117:51～61.

[18]陳大義,余蓉.HPLC法快速檢測咖啡及糧食中赭曲霉毒素A[J].衛(wèi)生研究,1999,27(增刊):143～145.

[19]曾紅燕，黎源倩，晉軍，等.毛細(xì)管電泳法測定玉米赤霉烯酮及其代謝物[J].四川大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）,2003,34(2):333～336.

[20]王帥，陳賀，張繼軍，等.牛奶中赭曲霉毒素檢測方法研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī),2013,40:78～80.

[21]史娜，路勇，吳穎，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測食品中的赭曲霉毒素A[J].食品科學(xué)，2011，32：260～263.

[22]Losito I,MonaciI L,Palimisano F,el al.Determination of ochratoxin A in mest products by high-performance liquid chromatography coupled to eleclrospray ionization sequential mass spectrometry[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry,2004,18(17):1965～1971.

[23]江濤，李鳳琴，王玉環(huán)，等.赭曲霉毒素A免疫學(xué)檢測的研究[J].中國公共衛(wèi)生，2004，50(5):556～558.

[24]賴衛(wèi)華，熊勇華，陳高明，等.應(yīng)用膠體金試紙條快速檢測赭曲霉毒素A的研究[J].食品科學(xué)，2005,26(5):204～207.

[25]黃飚，陶文沂，張蓮芬，等.赭曲霉毒素A的高靈敏時間分辨熒光免疫分析[J].生物化學(xué)與生物物理進展，2005，07: 662～666.

[26]王希春.農(nóng)產(chǎn)品中兩種真菌毒素蛋白質(zhì)芯片檢測技術(shù)的研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[27]莊浩瀚.噬菌體展示技術(shù)篩選與褐飛虱中腸刷狀緣膜囊泡結(jié)合短肽[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2010.

1004-2342（2015）02-0004-04

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