何本進(jìn)　梁慶華　胡才友　孫　亮　朱小泉　原惠萍　楊　帆　李星慧　秦嬌琴

賈春媛2　韓　晶2　杜建財(cái)2　張翻弟2　楊　澤2

2.北京醫(yī)院　北京老年醫(yī)學(xué)研究所　100730

國(guó)家科技部十二五支撐計(jì)劃(2012BAI10B01)；北京市科技新星計(jì)劃(Z12133002512058)

生物鐘與衰老退行性變關(guān)系的研究

何本進(jìn)1,2梁慶華1※胡才友1※孫亮2朱小泉2原惠萍2楊帆2李星慧2秦嬌琴1,2

賈春媛2韓晶2杜建財(cái)2張翻弟2楊澤2

2.北京醫(yī)院北京老年醫(yī)學(xué)研究所100730

國(guó)家科技部十二五支撐計(jì)劃(2012BAI10B01)；北京市科技新星計(jì)劃(Z12133002512058)

【摘要】在自然環(huán)境下，生物體內(nèi)的生物鐘接受外界光-暗和溫度等周期信號(hào)，調(diào)整自身的時(shí)相，與外界環(huán)境保持同步。生物鐘控制著晝夜節(jié)律，使其具有內(nèi)源性和自我維持運(yùn)轉(zhuǎn)的特點(diǎn)。通過裸藻野生型和突變株系在生理生化等方面節(jié)律的變化，進(jìn)一步分析起決定性作用的生物鐘成分，從而深入剖析生物鐘與晝夜節(jié)律之間的機(jī)制,及生物鐘與衰老退行性變關(guān)系，本文對(duì)此進(jìn)行了綜述。

【關(guān)鍵詞】生物鐘晝夜節(jié)律細(xì)胞分裂周期纖細(xì)裸藻

幾乎所有生物的許多生理活動(dòng)和生化反應(yīng)都表現(xiàn)出一種內(nèi)源性的近似1小時(shí)的晝夜節(jié)律現(xiàn)象，晝夜節(jié)律是自然界最普遍的一種現(xiàn)象，可使生物體的生理、生化、行為等生命現(xiàn)象發(fā)生周而復(fù)始的節(jié)律性變化。這些晝夜節(jié)律現(xiàn)象受生物鐘調(diào)節(jié)，內(nèi)源性生物鐘是產(chǎn)生晝夜節(jié)律的基礎(chǔ)。裸藻是介于動(dòng)物和植物之間的單細(xì)胞真核生物, 有光條件下葉綠體產(chǎn)生類囊體, 有光合功能產(chǎn)生, 成為自養(yǎng)型代謝；暗條件下葉綠體不能發(fā)育形成類囊體結(jié)構(gòu), 只能進(jìn)行異養(yǎng)型的代謝。本文綜述了在裸藻野生型與突變株系中晝夜節(jié)律對(duì)細(xì)胞分裂節(jié)律的影響以及生物鐘與晝夜節(jié)律振蕩器之間的作用機(jī)制。

1.野生型和突變裸藻的細(xì)胞分裂節(jié)律性

許多藻類、真菌和原生動(dòng)物的細(xì)胞分裂周期顯示出細(xì)胞分裂或“孵化”的持續(xù)晝夜節(jié)律[1]。細(xì)胞分裂只發(fā)生在特定的晝夜循環(huán)相位——經(jīng)常有恒定的黑暗或光照(人工黑夜)，相當(dāng)于同步化晝夜循環(huán)中的黑暗間隔。這種“閥門效應(yīng)器”現(xiàn)象反映一種晝夜振蕩器(CO)和細(xì)胞分裂周期(CDC)之間的相互關(guān)系，在裸藻中已經(jīng)被廣泛研究[2]。因?yàn)槠鋵⒆鳛橐环N基本的機(jī)制分析，通過實(shí)現(xiàn)生物鐘與細(xì)胞周期之間耦合，所以我們要深入探討節(jié)律的種類。

1.1野生型株系晝夜生物鐘的典型特性——通過白天而不是1小時(shí)光照和溫度循環(huán)、持久性、起始反應(yīng)性、可移動(dòng)性、相位奇點(diǎn)和溫度補(bǔ)償來導(dǎo)引——發(fā)現(xiàn)可以用來描述在光合自養(yǎng)生長(zhǎng)、綠色野生型株系中細(xì)胞分裂的節(jié)律[3～5]。其中后兩個(gè)特性更值得一提。

1.2奇異點(diǎn)數(shù)學(xué)研究已經(jīng)預(yù)測(cè)，晝夜振蕩器可能被描述為無節(jié)律的，顯示為無相性、靜止?fàn)顟B(tài)——在晝夜周期特定時(shí)間(把這個(gè)“奇異點(diǎn)”叫S*)給予一定強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的臨界相[6,7]。隨著刺激強(qiáng)度的增加，過渡期從1型(弱脈沖)到0型(強(qiáng)脈沖)，復(fù)位在特定階段的點(diǎn)必需是不連續(xù)的，這個(gè)“斷點(diǎn)”是相當(dāng)于唯一的奇點(diǎn)。這種預(yù)測(cè)已經(jīng)在一些晝夜系統(tǒng)的光和化學(xué)干擾中得到證明，潛在的細(xì)胞分裂節(jié)律的時(shí)鐘也不例外。

奇異點(diǎn)的定位在纖細(xì)裸藻光合自養(yǎng)生長(zhǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞分裂的晝夜振蕩器潛在不同步的節(jié)律行為受一種“臨界的” 3小時(shí)光信號(hào)所干擾。最初三個(gè)同相位、一起分裂的細(xì)胞都被利用，在一種3小時(shí)光照：3小時(shí)黑暗生活規(guī)則中，每一個(gè)細(xì)胞顯示一個(gè)約19小時(shí)穩(wěn)定的τ。在晝夜時(shí)間(CT)0.4里，3小時(shí)的700勒克斯信號(hào)干擾細(xì)胞A而細(xì)胞B僅被3小時(shí)的190勒克斯干擾(在施加的晝夜循環(huán)里，每替換正常光間隔中的一個(gè)，就有7500勒克斯的強(qiáng)度，用陰影箭頭代表)。而前者的信號(hào)引出一個(gè)相位漂移(ΔΦ) +11.2小時(shí)(以1為模式)晝夜時(shí)間(實(shí)時(shí)等于14.0小時(shí))，與之相比較的，見到7500勒克斯光信號(hào)，盡管在群體中細(xì)胞分裂繼續(xù)，但后者更弱的光脈沖(曲線B)誘導(dǎo)無節(jié)律性。如果三分之一細(xì)胞(曲線C)被一個(gè)與190勒克斯相同強(qiáng)度的3小時(shí)信號(hào)所干擾，在一個(gè)輕微不同的晝夜時(shí)間(CT21.5)里卻被加強(qiáng)，盡管相位在某種程度上觀察到7500勒克斯脈沖時(shí)被延遲(ΔΦ=-8.0小時(shí)，CT實(shí)時(shí)等于-10.0小時(shí))，但細(xì)胞分裂節(jié)律繼續(xù)。(摘自Malinowski JR, Laval-Martin DL, Edmunds Jr LN.J Comp Physiol B，1185，155:257-267.? Springer-Verlag.)圖1　相位漂移節(jié)律

這個(gè)“臨界脈沖”的存在和其相對(duì)應(yīng)的S*不僅更加支持裸藻這種晝夜振蕩器調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂周期的假設(shè)，也表明起搏器可能限制循環(huán)動(dòng)力學(xué)。因?yàn)榻Y(jié)果是由細(xì)胞群體獲得，所以在單個(gè)細(xì)胞中我們不能推斷振蕩器的這種狀態(tài)。細(xì)胞的無節(jié)律性也許就是單個(gè)細(xì)胞分裂周期位相分散的結(jié)果(細(xì)胞不連貫)，引起脈沖不同地相位漂移同步化的細(xì)胞?；蛘撸R界脈沖也許已停止由群體組成的每一個(gè)晝夜節(jié)律時(shí)鐘(但不是繼續(xù)進(jìn)行的細(xì)胞分裂周期)。

1.3光誘導(dǎo)定型與光周期的控制裸藻和綠色裸藻更早的研究工作表明細(xì)胞分裂周期由兩個(gè)連貫的過程組成[10～14]：預(yù)定型階段和定型階段。在細(xì)胞分裂周期的G1期，前者的過程將依賴光合作用生長(zhǎng)。A點(diǎn)表示G1期細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)程是依賴光的時(shí)間，而T點(diǎn)代表細(xì)胞甚至在晚上都能完成細(xì)胞分裂周期的時(shí)間。如果預(yù)定型階段的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到連續(xù)黑暗，細(xì)胞分裂會(huì)被立即阻止在A點(diǎn)與T點(diǎn)間某處，而當(dāng)定型階段的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到連續(xù)黑暗，細(xì)胞分裂周期的剩余時(shí)間繼續(xù)進(jìn)行，直到接下來的周期停止在A點(diǎn)[10]。裸藻細(xì)胞分裂周期進(jìn)程中的光合作作用規(guī)則就類似于異養(yǎng)型生物的營(yíng)養(yǎng)控制。釀酒酵母或粟酒裂解酵母的營(yíng)養(yǎng)匱乏，使細(xì)胞分裂周期停留在G1期或者G2期[15～17]，而前進(jìn)已經(jīng)超出了“開始”(在G1/S邊界)或者控制大小檢測(cè)點(diǎn)的酵母細(xì)胞致力于完成細(xì)胞分裂周期，即使它們正在經(jīng)受饑餓[18]。

一項(xiàng)裸藻在對(duì)數(shù)線期能進(jìn)行光合自養(yǎng)生長(zhǎng)的細(xì)胞分裂周期進(jìn)程中晝夜效應(yīng)的研究，Hagiwara等[19]證明黑暗誘導(dǎo)細(xì)胞分裂周期停滯和光誘導(dǎo)定型向細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變。不僅在G1期，也在后G1期發(fā)現(xiàn)光依賴的限制點(diǎn)。因此，如果營(yíng)養(yǎng)從連續(xù)光照轉(zhuǎn)移到連續(xù)黑暗，在G1, S 或者G2期的一些(定型的)細(xì)胞甚至在連續(xù)黑暗時(shí)就能經(jīng)歷一個(gè)或兩個(gè)細(xì)胞分裂周期過渡，最終停滯在S期、G2期或有絲分裂G1后期。其他(未定型的)細(xì)胞在細(xì)胞分裂周期是不能繼續(xù)前進(jìn)的。接受更高強(qiáng)度光照的定型細(xì)胞，更可能在連續(xù)黑暗時(shí)經(jīng)歷細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變，以及在每個(gè)細(xì)胞分裂周期中更早地定型。在細(xì)胞分裂周期的G1, S 或 G2期的固定相點(diǎn)不能完成定型。

因此，裸藻細(xì)胞分裂周期轉(zhuǎn)變的定型，由光強(qiáng)度組成細(xì)胞周期相位的成熟度控制。另外，Hagiwara等[20]已經(jīng)證明，晝夜振蕩器可以調(diào)節(jié)這些細(xì)胞分裂周期相位轉(zhuǎn)變定型的光響應(yīng)。當(dāng)裸藻細(xì)胞被14小時(shí)光照：10小時(shí)黑暗調(diào)節(jié)，然后被轉(zhuǎn)移到連續(xù)黑暗時(shí)，在最后晝夜光周期的第8個(gè)小時(shí)，細(xì)胞就停滯在G1、S或G2期。隨后這些在不同晝夜時(shí)間暴露6小時(shí)光脈沖的暗停滯細(xì)胞，在細(xì)胞分裂周期以依賴脈沖的晝夜時(shí)間方式允許它們進(jìn)一步推進(jìn)(圖2)。光誘導(dǎo)的最大值發(fā)生在微暗的環(huán)境(晝夜時(shí)間CT12)。這些結(jié)果證明有一種細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變定型的光誘導(dǎo)的晝夜閥門效應(yīng)器，不只是細(xì)胞分裂，也更早涉及這些部分——細(xì)胞繁殖的光周期調(diào)節(jié)。應(yīng)用除草劑敵草隆(DCMU)、DBMIB、甲基紫精(TMPD)和CCCP作抑制試驗(yàn)的結(jié)果顯示：細(xì)胞分裂G2期細(xì)胞的光誘導(dǎo)定型，在非周期性光合作用的電子傳遞中，需要源自上游信號(hào)的光，特別是細(xì)胞色素b6-f，但不需要進(jìn)程中所要求的能量代謝[20]。

纖細(xì)裸藻Z細(xì)胞分裂光誘導(dǎo)定型的晝夜閥門效應(yīng)器和光周期的控制。細(xì)胞被調(diào)節(jié)到14小時(shí)光照：10小時(shí)黑暗，然后給予最后一個(gè)在釋放到連續(xù)黑暗之前縮短到8小時(shí)的光周期。隨后，細(xì)胞在不同的晝夜時(shí)間(所謂“暗期干擾”試驗(yàn))給予一個(gè)6小時(shí)的光照間隔。上圖：在細(xì)胞群生長(zhǎng)中因子增加(ss) 是由光脈沖誘導(dǎo)。下圖：每行代表在延伸夜晚的連續(xù)黑暗之間，6小時(shí)光照間隔的時(shí)間設(shè)置[T范圍，“人工的”晝夜循環(huán)開始后數(shù)小時(shí)，在面板之間由白色和陰影線條顯示，表示前面的14小時(shí)光照：10小時(shí)黑暗循環(huán)仍在繼續(xù)。在黑暗間隔中間繪制數(shù)據(jù)(封閉空間)]，通過這些數(shù)據(jù)，橫線顯示它們的持續(xù)時(shí)間(6小時(shí))。每一數(shù)據(jù)點(diǎn)下的數(shù)字表示試驗(yàn)重復(fù)次數(shù)； SEM 很小以致誤差線都被隱藏在數(shù)據(jù)點(diǎn)內(nèi)。(摘自 Hagiwara S, Bolige A, Zhang Y et al.Photochem Photobiol，2002，27:31-39.? American Society for Photobiology.)圖2　細(xì)胞分裂周期的光誘導(dǎo)定型與光周期

1.4突變株系為了消除生物鐘可能存在的細(xì)胞間區(qū)和排除之前常引起節(jié)律性及提供生長(zhǎng)能量的可能信號(hào)影響，我們已經(jīng)選了無葉綠素的裸藻ZC突變株——一種必需的有機(jī)異養(yǎng)型生物——一系列用來平行于那些在野生型株系中開展的研究[16]。細(xì)胞分裂節(jié)律可能被12小時(shí)光照:12小時(shí)黑暗調(diào)節(jié)，或甚至由單脈沖架構(gòu)的光周期調(diào)節(jié)(1小時(shí)光照:23小時(shí)黑暗)，節(jié)律跟隨著連續(xù)黑暗自由振蕩至少8天(τ=25.5小時(shí))，提供總的增長(zhǎng)速率或世代時(shí)間(g)>1小時(shí)(圖5)。類似地，從其他裸藻光合作用的突變株中很少獲得這樣的結(jié)果，比如白色、熱褪色、無葉綠素的W6ZHL株系和紫外光誘發(fā)P4ZUL突變株[1,13,15]。ZC突變株光信號(hào)的0型相位反應(yīng)期曲線是從15個(gè)相位漂移試驗(yàn)中生成[16](圖3)；這條相位反應(yīng)曲線(圖4)類似于先前用野生型株系獲得的結(jié)果[9]。這些研究為細(xì)胞分裂周期控制中晝夜振蕩器的作用，提供了更加確鑿的證據(jù)，有效避免了施加晝夜循環(huán)雙用途的問題：作為生長(zhǎng)的能源或者“基質(zhì)”和作為潛在生物鐘的時(shí)間暗示(授時(shí)因子)。

先前被12小時(shí)光照:12小時(shí)黑暗調(diào)節(jié)，纖細(xì)裸藻(Z株系)無葉綠素的ZC突變株，在連續(xù)黑暗里，不同晝夜時(shí)間給予1小時(shí)光信號(hào)(1900勒克斯)調(diào)節(jié)，在添加乙醇的礦質(zhì)培養(yǎng)基中16.5℃批量培養(yǎng)(0.1%)，在連續(xù)黑暗中同時(shí)區(qū)分的兩種細(xì)胞A、B被光脈沖干擾，其中間發(fā)生在1.5小時(shí)或者7.0小時(shí)(分別對(duì)應(yīng)于晝夜時(shí)間11.0或晝夜時(shí)間18.6)，接著發(fā)生細(xì)胞分裂(在晝夜時(shí)間12下降)。瞬態(tài)減弱后，振蕩器的τ值約為25.5小時(shí)。這種在相位節(jié)律(垂直虛線)和被預(yù)測(cè)(實(shí)線標(biāo)記)節(jié)律之間的相位(ΔΦ)有區(qū)別，在它被干擾之前能夠被測(cè)量到，認(rèn)為代表由光信號(hào)產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)ΔΦ。τ (25.5小時(shí))值以前用于計(jì)算未干擾節(jié)律的相位，是由全部試驗(yàn)獲得的合并均值。在相應(yīng)梯級(jí)左邊給予的步長(zhǎng)(ss，通常少于2個(gè)，表示不是每個(gè)細(xì)胞分裂都會(huì)被分開)，每個(gè)振蕩器的估計(jì)時(shí)間(τ，細(xì)胞分裂的連續(xù)發(fā)生間隔)表示1個(gè)周期。(摘自 Carré I, Oster AS, Laval-Martin DL et al.Curr Microbiol，1189，19:223-221.? Springer-Verlag.)圖3　細(xì)胞分裂的相位漂移不同步節(jié)律

在纖細(xì)裸藻無葉綠素ZC突變株的細(xì)胞分裂的不同步節(jié)律上，對(duì)于光信號(hào)(1900勒克斯)的重置操作，相位反應(yīng)曲線(A)維持在連續(xù)黑暗中。穩(wěn)態(tài)相位漂移(±Δ)由1-h (·)產(chǎn)生和3-h(H)脈沖由如(圖3)描述所決定，向1小時(shí)規(guī)范化。結(jié)果是雙繪制的(開符號(hào))，作為晝夜時(shí)間(以1小時(shí)為模)的功能 ，其中信號(hào)的中點(diǎn)是已經(jīng)給予。不連續(xù)性(“斷點(diǎn)”或“時(shí)相陡變”由虛線表示)是這種繪圖所固有的。在曲線B中，新合成的晝夜時(shí)間(’=±Δ)隨著干擾，由晝夜時(shí)間()的功能繪制，其中信號(hào)已經(jīng)給予，結(jié)果是平滑的正弦曲線。(摘自 Carré I, Oster AS, Laval-Martin DL, et al.Curr Microbiol，1189，19:223-221.? Springer-Verlag.)圖4　光合作用的晝夜節(jié)律

因此晝夜振蕩器在裸藻的細(xì)胞分裂周期控制中起到很重要的作用，作為其他真核細(xì)胞的代表。有絲分裂不是一個(gè)振蕩器重要的組成部分，但卻位于其下游。細(xì)胞分裂的阻斷不應(yīng)讓這個(gè)系統(tǒng)停止振蕩[21,22]。因此細(xì)胞分裂會(huì)是潛在生物鐘的一只“手”。我們已經(jīng)用兩種方法在野生型中檢驗(yàn)了這個(gè)假說：①如果不同步的分裂節(jié)律由于Vit B12原始水平低下而停止，而如果這種抑制隨后通過B12重新向媒介釋放，節(jié)律又能在未被干擾的控制中重新開始。②若給不同步的細(xì)胞以乳酸的脈沖，暫時(shí)加速細(xì)胞分裂周期和覆蓋晝夜振蕩器[13]，當(dāng)補(bǔ)充的基質(zhì)被耗盡后，節(jié)律期最終恢復(fù)，節(jié)律期又處在平靜控制的階段。這些結(jié)果與之前發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相符，因?yàn)橥ㄟ^向媒介加入含硫化合物，在連續(xù)光照里， P4ZUL突變體不同步的節(jié)律性同步恢復(fù)[15]。

在細(xì)胞媒介里自由氧濃度的規(guī)范數(shù)據(jù)，由12小時(shí)光照:12小時(shí)黑暗導(dǎo)引，然后釋放到連續(xù)光照里。(摘自Wolff D, Künne A.J Plant Physiol，2000，156:52-59.? Urban & Fischer Verlag.)圖5　裸藻無色突變株呼吸活動(dòng)的晝夜節(jié)律

1.5無色裸藻突變株的呼吸活動(dòng)光合作用的晝夜節(jié)律在纖細(xì)裸藻野生型Z培養(yǎng)物中已被報(bào)道[23]，其中媒介里的自由O2濃度用克拉克電極連續(xù)測(cè)量。中午產(chǎn)氧達(dá)峰值，節(jié)律在連續(xù)光照里持續(xù)至少8個(gè)周期，從而更早證實(shí)發(fā)現(xiàn)的結(jié)果[24,26]。這些數(shù)據(jù)被延伸到缺乏功能葉綠體的無色突變株[23]，但就這個(gè)株系，節(jié)律相位在野生型菌株中卻是相反的，在(人工的)黑夜，媒介中出現(xiàn)氧氣濃度的最高值(圖5)。突變株細(xì)胞的節(jié)律直接對(duì)更復(fù)雜的晝夜循環(huán)起反應(yīng)，紅光(>518nm)和藍(lán)光(<550nm)在調(diào)節(jié)呼吸活動(dòng)與給定的白光相比，如8小時(shí)光照:8小時(shí)黑暗(同步化這些細(xì)胞)同樣有效。因此，能量的需求要么由光合作用，要么由呼吸作用提供，取決于細(xì)胞的類型，這都是受光和晝夜節(jié)律生物鐘兩者的控制。光合作用節(jié)律的起源，可能位于與這兩個(gè)光合系統(tǒng)相關(guān)的光捕獲蛋白(LHCPs)的光誘導(dǎo)綜合體內(nèi)，這個(gè)綜合體受生物鐘控制，人工白天顯示增加高達(dá)20倍(見下面部分)[27]。

2.晝夜節(jié)律振蕩器與細(xì)胞周期生物鐘之間的耦合

我們已經(jīng)回顧了裸藻細(xì)胞分裂周期的生物鐘控制的證據(jù)(與其他微生物一樣)。這種“閥門效應(yīng)器”現(xiàn)象反映的是晝夜振蕩器和細(xì)胞分裂周期之間的相互關(guān)系。如果不是作為振蕩器自身的一個(gè)要素，而是作為輸入輸出信號(hào)通路的連接環(huán)，這種耦合可受cAMP影響，在細(xì)胞分裂周期的調(diào)節(jié)和生物鐘功能中已經(jīng)涉及[18]。

真核細(xì)胞的細(xì)胞分裂周期是一個(gè)復(fù)雜的級(jí)聯(lián)事件，以細(xì)胞復(fù)制為頂點(diǎn)[28]。從一種調(diào)節(jié)狀態(tài)到另一種開始的這些轉(zhuǎn)變，是它們自身的反饋控制，決定細(xì)胞物理狀態(tài)的底物修飾。由遺傳和生化分析闡述的基本機(jī)制，已經(jīng)在以下生物體中保守，如酵母菌、非洲爪蟾蜍、蛤蚌、海星受精卵、培養(yǎng)的人類細(xì)胞和高等植物[29]。

兩個(gè)重要轉(zhuǎn)變控制點(diǎn)存在細(xì)胞分裂周期G1/S 和 G2/M邊界。M期被描述為激酶的激活(MPF，成熟促進(jìn)因子，當(dāng)注入爪蟾卵細(xì)胞時(shí)，以誘導(dǎo)細(xì)胞分裂的能力命名)，其中包含兩個(gè)組件子單元。一個(gè)是p34cdc2蛋白(S.非洲粟酒基因cdc2或同族體的產(chǎn)物，S.啤酒的CDC28)，其能使體內(nèi)的酪蛋白及組蛋白H1磷酸化和在有絲分裂有最大的激酶活性。另一個(gè)是細(xì)胞周期蛋白，其濃度在細(xì)胞分裂周期之間波動(dòng)。它在細(xì)胞間期逐步地累積，形成p34cdc2復(fù)合體和激活蛋白激酶；在有絲分裂中降解，滅活激酶和MPF的活性。 因此，細(xì)胞周期蛋白-cdc2/CDC28 (MPF) 系統(tǒng)就像一個(gè)振蕩器或者“生物鐘”，在有絲分裂時(shí)重設(shè)到細(xì)胞間期和其似乎組成一個(gè)通用的細(xì)胞分裂循環(huán)的“引擎”[29]?，F(xiàn)在我們知道細(xì)胞周期蛋白的整個(gè)家族，p34cdc2周期性地把調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂周期進(jìn)程的蛋白激酶活性聯(lián)系起來造成連續(xù)波動(dòng)，在植物和動(dòng)物的細(xì)胞分裂周期中， cdc2關(guān)聯(lián)基因的確切種類得到不同表達(dá)。

2.1環(huán)腺苷酸(cAMP)的作用眾所周知，cAMP在細(xì)胞的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[30]，可影響晝夜振蕩器和p34cdc2——細(xì)胞周期蛋白通路之間的耦合，(可能和其他參與者一致)參與細(xì)胞分裂周期活動(dòng)的閥門效應(yīng)器到晝夜周期的特定相位。

甚至，cAMP 似乎有能力控制細(xì)胞分裂周期進(jìn)程中某些限速步驟，刺激一些細(xì)胞的增值，但在其他細(xì)胞，卻有相反的效果，或一點(diǎn)效果都沒有[31,32]。在很多細(xì)胞類型中， cAMP的短暫增加與G1/S 和 G2/M邊界的細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變有關(guān)。酵母菌的遺傳試驗(yàn)和哺乳動(dòng)物的藥學(xué)研究[30,33]已經(jīng)顯示，cAMP水平的一過性升高和接著下降，對(duì)于DNA的合成和MPF的誘導(dǎo)酪氨酸-脫磷酸作用激活的啟動(dòng)是有必要的[34]，第二次cAMP劇增與完成相關(guān)，從有絲分裂中退出[35]。細(xì)胞分裂周期不同相位中，cAMP 濃度的相似變化已在裸藻中出現(xiàn)[36]。這些信號(hào)分別與p34cdc2-p60 (G1細(xì)胞周期蛋白)蛋白激酶復(fù)合物和p34cdc2-細(xì)胞周期蛋白B (有絲分裂細(xì)胞周期蛋白) 蛋白激酶復(fù)合物功能相一致。

因此，在動(dòng)物和酵母菌中， cAMP 濃度波動(dòng)代表細(xì)胞分裂周期進(jìn)程，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要環(huán)節(jié)。在真核細(xì)胞里，AC信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下刺激受cAMP-響應(yīng)核因子家族調(diào)整。這些因子包含基本的結(jié)構(gòu)域/亮氨酸拉鏈模序和cAMP-反應(yīng)元件(CRE)二聚體。CRE-結(jié)合蛋白(CREB)的功能由cAMP依賴性蛋白激酶的磷酸化作用調(diào)整。

2.2環(huán)腺苷酸(cAMP)對(duì)細(xì)胞分裂節(jié)律的干擾如果周期性的信號(hào)在裸藻細(xì)胞分裂節(jié)律的產(chǎn)生中起作用，通過晝夜振蕩器，干擾或覆蓋cAMP水平的控制這一條件應(yīng)該在下游活動(dòng)中引起擾亂[18]。用了這種藥(圖6A)，依靠細(xì)胞分裂周期的相位，引起細(xì)胞分裂周期的縮短或加長(zhǎng)，通過外源性cAMP，其振蕩的干擾導(dǎo)致了來自晝夜定時(shí)器細(xì)胞分裂周期的暫時(shí)解耦合。當(dāng)在CT16 和 CT22之間給予cAMP時(shí)，能觀察到前進(jìn)；當(dāng)在CT03和 CT09之間給予cAMP時(shí)，能獲得下一個(gè)同步分裂步驟(相當(dāng)于9小時(shí))的延遲。在CT06-08和 CT18-20時(shí)獲得最大效應(yīng)，相當(dāng)于內(nèi)源性cAMP 水平是最低的時(shí)間。在晝夜時(shí)間已經(jīng)獲得細(xì)胞分裂周期的最大+ΔΦs 或者 -ΔΦs，也可得到計(jì)量反應(yīng)曲線。僅僅1 nM cAMP足以干擾細(xì)胞分裂周期運(yùn)輸。與細(xì)胞分裂周期的細(xì)胞周期蛋白生物鐘相比，不像可興奮組織，其cAMP的確能相位漂移信號(hào)輸出節(jié)律[37,38]，晝夜振蕩器不用通過添加cAMP來重置：分裂節(jié)律回到原始位相(圖6B)。

曲線來自17個(gè)單獨(dú)試驗(yàn)。(A) 隨著cAMP 注入培養(yǎng)基，第一個(gè)細(xì)胞分裂步驟的前進(jìn)或延遲。(B)干擾后， 穩(wěn)態(tài)ΔΦs 測(cè)量(有可能時(shí))3～4天。開符號(hào)：cAMP 暴露1小時(shí)后，用新鮮的媒介稀釋細(xì)胞懸液50倍。實(shí)心符號(hào)：細(xì)胞沒有被稀釋。三角形, 500μM cAMP;圓圈, 250μM cAMP;正方形, 100μM cAMP.。(摘自:Carré I, Edmunds Jr LN.J Cell Sci，1913，30:403-1173.? 1913 The Company of Biologists, Ltd.)圖6　在裸藻無葉綠素ZC突變株中，通過cAMP，細(xì)胞分裂不同步節(jié)律干擾的相位反應(yīng)曲線

隨著cAMP的注入，在生長(zhǎng)曲線中觀察到的細(xì)胞分裂步驟ΔΦ ，反映細(xì)胞分裂周期進(jìn)程速率的真實(shí)變化。通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量細(xì)胞DNA含量提示[18]，在CT06-08注入cAMP 延遲穿過S期，可能穿過M期(圖7A)。若在CT18-20增加，cAMP 加速G2/M 過渡(圖7B)。細(xì)胞分裂節(jié)律的這些效應(yīng)只是短暫的：48h后，和未干擾的控制一樣，分裂出現(xiàn)在相同的相位(圖6B)。

在連續(xù)黑暗同步分開的裸藻ZC突變株的細(xì)胞被分為兩個(gè)等份，其中一個(gè)接受cAMP (白色直方圖)，而另一個(gè)被用作質(zhì)控(黑色直方圖)。隨著波動(dòng)，每4h收獲細(xì)胞，在70% 酒精中固定，RNAse A 處理，然后用碘化丙啶染色，立即先用熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)分析。(A)在CT06， cAMP的添加延遲細(xì)胞穿過S期的進(jìn)程。 (B)在 CT20，cAMP 的添加刺激有絲分裂(注意在t=12h G2期峰值的減低)。自從向細(xì)胞媒介中加入cAMP，時(shí)間的消逝標(biāo)示在相應(yīng)直方圖的右側(cè)，而CT標(biāo)示在左側(cè)。(摘自: Carré I, Edmunds Jr LN.J Cell Sci，1913，30:403-1173.? 1913 The Company of Biologists, Ltd.)圖7　細(xì)胞周期進(jìn)程中cAMP的效應(yīng)

通過檢測(cè)減小cAMP振蕩振幅的藥物效應(yīng)，或者保持cAMP在某一水平，這樣所有cAMP的受體就能永久飽和，證明在細(xì)胞分裂周期進(jìn)程中cAMP水平的內(nèi)源性晝夜節(jié)律變化有足夠的振幅產(chǎn)生類似的效應(yīng)：我們希望這種藥用來阻止分裂節(jié)律性的表達(dá)。甚至AC的激活劑，cAMP類似物毛喉素使cAMP維持在異常的高水平[21]，連續(xù)黑暗里，增加不同步ZC突變株細(xì)胞，出現(xiàn)細(xì)胞群的快速失調(diào)和最終失去分裂節(jié)律性[18]。

這些發(fā)現(xiàn)指出，盡管裸藻中cAMP信號(hào)不重置晝夜振蕩器(因此cAMP不大可能代表生物鐘的“齒輪”)，但它們的確調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂周期進(jìn)程，從振蕩器作用下游——正如Zatz[39]所提出的小雞松果體細(xì)胞，可能存在并行通路。

2.3下游通路：環(huán)腺苷酸(cAMP)依賴性蛋白激酶在振蕩的cAMP系統(tǒng)和細(xì)胞分裂周期之間，什么是連接環(huán)？根據(jù)應(yīng)用時(shí)CT的通路，無論什么是細(xì)胞周期受到影響的調(diào)節(jié)通路，它必須能解釋相同信號(hào)是如何干擾不同的通路。一種可能性，是cAMP通過不同的“受體”表現(xiàn)為有選擇性地調(diào)整兩個(gè)調(diào)節(jié)通路中的一個(gè)或另一個(gè)。

我們已經(jīng)證明，裸藻ZC突變株包含cAMP依賴性蛋白激酶(cPKA和cPKB)兩個(gè)類型，對(duì)于cAMP和幾個(gè)cAMP類似物來說，它們有不同的密切關(guān)系[40]。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞提取物包含兩個(gè)cAMP-結(jié)合蛋白，一個(gè)與cAMP有很高的親和力((Kd值為10nM和19nM)，一個(gè)能通過DEAE-纖維素色譜分析法分離。用肯普肽(激酶底物肽)作為底物(從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，由cAMP依賴性激酶特異性磷酸化)分析蛋白激酶。用DEAE-纖維素色譜分析法部分提純cAMP后可觀察到激酶活性的刺激。分辨兩個(gè)活性的峰值相當(dāng)于兩個(gè)不同的cAMP類似物特異性酶。因此， cAMP依賴性激酶類似于動(dòng)物細(xì)胞，通過靶蛋白的磷酸化，植物細(xì)胞中的cAMP信息傳遞可繼續(xù)進(jìn)行。

在細(xì)胞分裂周期進(jìn)程的控制中，通過cAMP類似物提供工具給它們各自作用的研究，抽出裸藻中識(shí)別的兩個(gè)激酶的差異激活。我們斷定，cAMP 或 cAMP類似物的最小劑量可引起在人工白天或黑夜中分裂節(jié)律的ΔΦs[18]。在CT06-08和 CT18-20獲得的不同結(jié)果提示，由兩個(gè)不同的cAMP激酶來介導(dǎo)不同CTs 時(shí)cAMP 的效應(yīng)。因此，選擇性激活cPKA 的8-芐氨基嘌呤- cAMP(8-BZA-cAMP)在CT06-08增加時(shí),誘導(dǎo)-ΔΦs，但在CT18-20時(shí)沒有效應(yīng)。相反地，特異激活cPKB的8-(4-硫代氯苯基)-cAMP(8-CPT-cAMP)在CT18-20增加時(shí)，誘導(dǎo)+ΔΦs和分裂節(jié)律性的減少，但在CT06-08增加時(shí)，不干擾分裂節(jié)律。

cAMP, 8-BZA-cAMP, 8-CPT cAMP與6-MBT-cAMP的劑量之間也有關(guān)聯(lián)，引起在CT06-08時(shí)細(xì)胞分裂周期和cPKA類似物 Ka值的干擾，結(jié)果提示cPKA在這些CTs時(shí)，介導(dǎo)cAMP的延遲效應(yīng)。同樣地，相同核苷酸的劑量之間也有關(guān)聯(lián)，引起在CT18-20時(shí)細(xì)胞分裂周期和cPKB類似物Ka值的干擾，結(jié)果表明在CT18-20時(shí)cPKB介導(dǎo)cAMP的加速效應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)簡(jiǎn)單的解釋是這些激酶是在細(xì)胞分裂周期不同階段表達(dá)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，被描述為Ⅰ型和Ⅱ型cAMP依賴性激酶。

3.小結(jié)

藻類比如纖細(xì)裸藻已經(jīng)作為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，被用來了解晝夜?jié)律記時(shí)的作用機(jī)制，已經(jīng)超過了半個(gè)世紀(jì)，是因?yàn)樗鼈兎奖憷?，易于測(cè)量其生理特征以反映晝夜節(jié)律的輸出信號(hào)。 另外，藻類的代謝輪廓分析日益重要，因?yàn)樗鼈兡芴峁┴S富多樣的化合物，對(duì)于食品、醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)、生物燃料和公共衛(wèi)生等方面具有很大潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[41]。 生物鐘使裸藻能維持近似1小時(shí)的晝夜節(jié)律，其主要通過接受光信號(hào)，經(jīng)過一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在晝夜振蕩器中不斷地產(chǎn)生振蕩，最后通過輸出途徑控制基因的節(jié)律性表達(dá)等；但仍存在局限性：高通量組學(xué)篩查經(jīng)常遇到的問題是只能鑒別基因和蛋白，而不能知道其功能。很多的功能分析會(huì)降低相關(guān)信息量，比如在晝夜時(shí)間的系列研究中，由于不完善的注釋而很少使用。通過對(duì)裸藻晝夜節(jié)律深入的研究，對(duì)揭示生物鐘的本質(zhì)、生物進(jìn)化的分子機(jī)制等具有重要意義，可為各種動(dòng)植物包括人類的生產(chǎn)實(shí)踐與醫(yī)療保健等方面提供可靠的理論依據(jù)。

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作者單位：1.廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院檢驗(yàn)科530021

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(8321120527，81370265，8147108, 81400710)；衛(wèi)生部公益性研究基金(201192008)；

doi:10.3969/j.issn.1672-4860.2015.04.002

收稿日期：2015-6-20

The survey of relation with aging degenerative changes and biont in circadian clock pattern(HEBenjin1,2,LIANGQinghua1,HUCaiyou1,SUNLiang2,ZHUXiaoquan2,YUANHuiping2,YANGFan2,LIXinghui2,QINJiaoqin1,2,JIAChunyuan2,HANJing2,DUJiancai2,ZHANGFandi2,YANGZe2.1.Departmentofclinicallaboratory,Jiangbinhospital,Nanning,Guangxi519021,China.2.InstituteofGeriatrics,MinistryofHealth,BeijingHospital,Beijing100719,China)*Correspondingauthor:LIANGqinghua,HUcaiyou.

【Abstract】In the natural environment,circadian clock in organism receives the periodic signal of light and darkness outside, adjust the phase itself, and synchronize ambient.Circadian clock controls circadian rhythms,which has the characteristics of endogenous and self sustaining running.We review that the decisive element of circadian clock, the mechanism of circadian clock and circadian rhythm are futher analyzed by the change of physiological and biochemical levels in wild-type strain and mutant of Euglena gracilis,as well as the relation with aging degenerative changes and biont in circadian clock pattern.

【Key words】circadian clock, circadian rhythm,cell division cycle, Euglena gracilis Klebs

※為通訊作者