王麗娟 肖中元 周 玲 楊紅濤 陳真文 程永剛（西南藥業(yè)股份有限公司，中國(guó) 重慶400038）

輔酶Q10注射液廣泛應(yīng)用于充血性心力衰竭、冠心病、高血壓、心律失常、原發(fā)性繼發(fā)性醛固酮增多癥、頸部外傷后遺癥、腦血管障礙、失血性休克及肝炎等疾病的輔助治療，但是，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局明文規(guī)定，其成品進(jìn)入市場(chǎng)前必須按照《中國(guó)藥典》2010版二部的相關(guān)規(guī)定檢查熱原。目前，輔酶Q10注射液熱原測(cè)定主要采用家兔法，該方法雖然準(zhǔn)確度較高，然而存在操作不變且難以到達(dá)快速檢測(cè)的目的等缺陷。研究表明，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法又稱鱟試驗(yàn)法(bacterial endatoxin text，BET)檢測(cè)藥品中內(nèi)毒素含量具有快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，并在國(guó)內(nèi)外得到了日益廣泛的應(yīng)用?；诖?，本文旨在研究細(xì)菌內(nèi)毒素法檢測(cè)輔酶Q10注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的可行性，以期建立輔酶Q10注射液熱原檢測(cè)的替代質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 試驗(yàn)材料及儀器

1.1 輔酶Q10注射液

規(guī)格：2ml：輔酶Q10 5mg，

批號(hào)：140808，141101，141102,141103,141104,141105,141106。

來(lái)源：西南藥業(yè)股份有限公司。

1.2 細(xì)菌內(nèi)毒素材料

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品：10EU/支，批號(hào)1309010，購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司。

鱟試劑：①λ為0.25Eu/ml，批號(hào)：1301120，購(gòu)自湛江博康海洋生物制品廠。

②λ為0.25Eu/ml，批號(hào)：1302071，購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司。BET水：5ml/支，批號(hào)：1209050，購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司。

1.3 儀器

電熱恒溫干燥箱GZX-DH-50×55（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；凈化工作臺(tái)（重慶利通空調(diào)凈化設(shè)備公司）；電熱恒溫水浴鍋H.S.G 20-4（臨海市東方儀器儀表廠）；實(shí)驗(yàn)所用玻璃器皿均進(jìn)行250℃干燥2h處理。

2 試驗(yàn)方法

2.1 輔酶Q10注射液細(xì)菌內(nèi)毒素限值

根據(jù)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄XI E）的規(guī)定，按以下公式計(jì)算內(nèi)毒素限值：L=K/M。式中內(nèi)毒素限值L是以EU/ml、EU/mg或EU/u表示；K為按規(guī)定給藥途徑時(shí)人體每公斤體重每小時(shí)最大可耐受的內(nèi)毒素劑量，以EU/（kg·h）表示，注射劑規(guī)定為：K=5 EU/（kg·h）。一般我國(guó)人群平均體重按60kg計(jì)算，人體對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的最大耐受量為300EU/h；另我國(guó)人體的平均體表面積按1.55m2計(jì)算，人體每平方米的最大耐受劑量為(300EU/h)/1.55m2=（193EU/h）/m2。M為人體每公斤體重每小時(shí)接受的最大給藥劑量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或u/（kg·h）表示。

從輔酶Q10注射液的使用說(shuō)明書可知，本品用于靜脈滴注，每天用藥量5-10mg輔酶Q10，與100-250ml的氯化鈉注射液配伍需在2h內(nèi)滴完。根據(jù)聯(lián)合用藥可知，K總=k1+k2,(k1為氯化鈉注射液的耐受劑量，K2為Q10的耐受劑量。根據(jù)2010版中國(guó)藥典可知，k1=250*0.5/(60*2)=125/120 EU/（kg·h）,K2=5-125/120=475/120 EU/（kg·h）,輔 酶Q10注射液的L值為K2/M=475/120/10/120=47.5EU/mg。

2.2 樣品最大有效稀釋倍數(shù)

最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）是指在實(shí)驗(yàn)中供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過(guò)此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢測(cè)。計(jì)算樣品最大有效稀釋倍數(shù)，按以下公式計(jì)算：MVD=CL/λ，式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值；C為供試品溶液的濃度，當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，則C等于1.0ml/ml，當(dāng)L以EU/mg或EU/U表示時(shí)，C的單位需為mg/ml或U/ml；λ為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度（EU/ml）。

由L值可求得最大有效稀釋倍數(shù)。本品的MVD=CL/λ=2.5×47.5/0.25=475.

2.3 鱟試劑靈敏度復(fù)核

根據(jù)中國(guó)藥典2010年版二部附錄XI E項(xiàng)下“鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)”方法用湛江海洋生物制品廠和湛江安度斯生物有限公司內(nèi)毒素樣品用于試驗(yàn)，結(jié)果如表1和表2所示。靈敏度復(fù)核的測(cè)定值λC1（湛江海洋生物制品）為0.25 Eu/ml，λC2（湛江安度斯生物有限公司）為0.2Eu/ml，其結(jié)果均約0.5λ～2.0λ之間，可用于試驗(yàn)。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果（湛江海洋生物制品廠）

表2 鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果（湛江安度斯生物有限公司）

2.4 干擾試驗(yàn)

取141101批樣品，分別稀釋50倍、100倍、200倍、400倍、450倍、475倍后，分別用λ為0.25Eu/ml的鱟試劑（購(gòu)自湛江海洋生物制品廠）和λ為0.25Eu/ml的鱟試劑（購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司）進(jìn)行干擾試驗(yàn)。結(jié)果如表3和表4。

表3 湛江海洋生物制品廠鱟試劑干擾試驗(yàn)

表4 湛江安度斯生物有限公司鱟試劑干擾試驗(yàn)

從表3和表4可見(jiàn)：用靈敏度為0.25 EU/mL的TAL進(jìn)行試驗(yàn)，50倍稀釋液有干擾，100倍稀釋液無(wú)干擾。表明本品最小不干擾稀釋倍數(shù)為100倍。

2.5 樣品測(cè)定

將家兔法檢查合格的141101批樣品分別稀釋100倍、200倍、400倍、475倍后，按《中國(guó)藥典》2010版二部附錄測(cè)定，結(jié)果如表5。將家兔法檢查不合格的140808批樣品分別稀釋100倍、250倍、500倍、800倍和1000倍后，按《中國(guó)藥典》2010版二部附錄測(cè)定，結(jié)果如表6。

表5 141101批樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

表6 140808批樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法測(cè)定結(jié)果

2.6 質(zhì)量指標(biāo)的建立

如上所述，通過(guò)鱟試劑靈敏度試驗(yàn)、干擾試驗(yàn)及樣品測(cè)定，說(shuō)明細(xì)菌內(nèi)毒素法能夠應(yīng)用于輔酶Q10注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定，其檢測(cè)結(jié)果與家兔法一致，表明該法可以替代熱原法對(duì)輔酶Q10注射液的質(zhì)量控制。

為了保證輔酶Q10注射液產(chǎn)品的安全性，根據(jù)細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定的原理，將質(zhì)量?jī)?nèi)控指標(biāo)定為：樣品稀釋400倍后，按《中國(guó)藥典》2010版二部細(xì)菌內(nèi)毒素法測(cè)定，應(yīng)符合規(guī)定。

2.7 質(zhì)量監(jiān)控

對(duì)6個(gè)批次輔酶Q10注射液生產(chǎn)灌封前樣品采用細(xì)菌內(nèi)毒素法檢測(cè)，成品采用家兔法檢測(cè)，結(jié)果如表7。細(xì)菌內(nèi)毒素法與家兔法的檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明細(xì)菌內(nèi)毒素法完全適用于對(duì)本品的質(zhì)量控制，且能保證成品質(zhì)量。

表7 生產(chǎn)樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是一種體外熱原試驗(yàn)法，它是通過(guò)考察藥品中存在的微量細(xì)菌內(nèi)毒素而建立起來(lái)的，具備操作簡(jiǎn)單.實(shí)驗(yàn)費(fèi)用少.結(jié)果迅速可得等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已經(jīng)被各國(guó)藥典正式收載。近年來(lái)，作為一項(xiàng)新技術(shù)、新方法，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法雖然廣泛應(yīng)用于藥品的熱原檢查，但其是否能夠滿足輔酶Q10注射液生產(chǎn)中成品的質(zhì)量控制，目前鮮見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法能夠用于輔酶Q10注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的測(cè)定，其檢測(cè)結(jié)果與家兔法一致，這表明該方法可以替代熱原法對(duì)輔酶Q10注射液的質(zhì)量控制，并由此建立了用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法測(cè)定本品的內(nèi)控指標(biāo)，即將樣品稀釋400倍后，按《中國(guó)藥典》2010版二部細(xì)菌內(nèi)毒素法測(cè)定，應(yīng)符合規(guī)定。如將此標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于生產(chǎn)，完全能夠滿足輔酶Q10注射液質(zhì)量控制的要求。

［1］輔酶Q10注射液說(shuō)明書[Z].西南藥業(yè)股份有限公司.

［2］中華人民共和國(guó)藥典2010版二部[Z].

［3］吳楊,趙云燕.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的應(yīng)用進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥,2004,8(3):226-227.