膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1在膠質(zhì)瘤及瘤旁組織中的表達及臨床意義

付勝偉岳樹源

(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)外科，天津300480)

摘要〔〕目的探討膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1(MT1-MMP)在膠質(zhì)瘤及瘤旁組織中的表達及臨床意義。方法選擇54例膠質(zhì)瘤標(biāo)本及瘤旁相對正常腦組織，應(yīng)用Western印跡實驗及RT-PCR檢測MT1-MMP的表達情況，并與臨床相關(guān)特征進行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果Western印跡結(jié)果顯示MT1-MMP在不同級別膠質(zhì)瘤中表達具有差異性，膠質(zhì)瘤級別越高其條帶灰度值越高，膠質(zhì)瘤級別越低表達越弱。RT-PCR結(jié)果顯示MT1-MMP mRNA的表達呈現(xiàn)出與Western印跡結(jié)果一致的趨勢，正常腦組織、Ⅰ、Ⅱ級膠質(zhì)瘤與Ⅲ、Ⅳ級膠質(zhì)瘤之間表達具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，而Ⅲ級與Ⅳ級膠質(zhì)瘤之間無明顯差異性，并且MT1-MMP表達與患者生存期呈明顯的負相關(guān)性。結(jié)論MT1-MMP的表達與膠質(zhì)瘤級別相關(guān)，有可能是一個潛在的膠質(zhì)瘤基因靶向治療的位點。

關(guān)鍵詞〔〕膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1；膠質(zhì)瘤；癌旁組織

中圖分類號〔〕R73〔文獻標(biāo)識碼〕A〔

通訊作者：岳樹源(1962-)，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腦腫瘤、腦血管病的手術(shù)治療研究。

第一作者：付勝偉(1978-)，男，主治醫(yī)師，在讀碩士，主要從事腦外傷、腦出血的診斷和治療研究。

膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤，預(yù)后差，致殘率及致死率均很高〔1〕。膠質(zhì)瘤發(fā)病原因尚不明確，目前認為可能與先天遺傳易感性、后天環(huán)境因素以及電離輻射相關(guān)。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)被認為與多種惡性腫瘤的發(fā)生和浸潤有關(guān)〔2〕， 膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1(MT1-MMP)是MMPs家族中最重要的成員之一，被認為與腫瘤的增殖、凋亡、浸潤、轉(zhuǎn)移以及血管形成等密切相關(guān)〔3〕。本研究對原發(fā)膠質(zhì)瘤以及瘤旁相對正常腦組織MT1-MMP水平進行檢測，分析其與臨床相關(guān)特征的關(guān)聯(lián)。

1資料與方法

1.1一般資料收集天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院2009年1月至2010年12月行膠質(zhì)瘤手術(shù)切除的病例54例，對其病歷資料進行整理，并且在手術(shù)室收集部分膠質(zhì)瘤標(biāo)本及瘤旁2 cm外相對正常腦組織標(biāo)本。術(shù)后經(jīng)病理證實為原發(fā)性膠質(zhì)瘤，其中Ⅰ級4例，Ⅱ級10例，Ⅲ級17例，Ⅳ級23例；男31例，女23例，年齡56～71〔平均(68.9±12.4)〕歲。手術(shù)標(biāo)本均為新鮮標(biāo)本，在手術(shù)過程中由術(shù)者在顯微鏡下確認為膠質(zhì)瘤或腦組織標(biāo)本后取下，迅速置于液氮中保存。納入及排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者為首次行膠質(zhì)瘤切除術(shù)；②術(shù)后均堅持完成放療、化療等系統(tǒng)性治療，放療為全腦照射+術(shù)區(qū)照射相結(jié)合，化療藥物為泰道(替莫唑胺)；③無身體其他部位腫瘤，無其他嚴(yán)重慢性疾病；④無血液系統(tǒng)的疾病及其他免疫性疾病。

1.2Western印跡蛋白提?。簩龃嬗谝旱慕M織標(biāo)本取出后，迅速研磨成粉末，并加入蛋白酶抑制劑及蛋白裂解液，冰上放置5 min后，12 000 r/min離心15 min，棄去下層沉淀，上清中加入5倍緩沖液煮沸5 min，行蛋白定量。一抗：單克隆抗膜型基質(zhì)金屬蛋白酶抗體(美國ebioscience公司)，二抗：山羊抗小鼠(中杉金橋生物科技公司)。配制10%的下層膠，5%上層膠，注入樣品后，以80 V恒定電壓進行樣品壓縮，待樣品進入分離膠后，加電壓120 V，至跑出所需要的條帶止，進行轉(zhuǎn)膜，350 mA恒定電流，約120 min。BSA封閉2 h，加入一抗過夜，次日加入二抗，洗脫，顯色。

1.3RT-PCRRNA提?。耗z質(zhì)瘤及癌旁正常腦組織50～100 mg研成粉末，應(yīng)用Trizol 抽打勻漿，加入0.2 ml氯仿劇烈震蕩后，靜置離心15 min取上層水相，進一步加入異丙醇沉淀水相中的RNA，DEPC處理水溶解RNA保存在液氮或低溫冰箱。分光光度計檢測260/280吸光度比值，計算RNA濃度。

逆轉(zhuǎn)錄：在20 μl體系中，加入1 μg總RNA,1 μl oligo dT12～18(500 μg/ml)。RNase-Free水，70℃溫育10 min后立即冰浴冷卻，繼續(xù)加入4 μl 5倍緩沖液,2 μl 0.1 mol/L DTT,1 μl 10 mol/L dNTPs (10 mol/L/種)，混勻后于42℃保溫2 min，加入1 μl(200 U)的反轉(zhuǎn)錄酶，42℃繼續(xù)溫育50 min。70℃15 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后-20℃儲存。PCR：建立PCR反應(yīng)體系，由上海康城生物技術(shù)公司提供PCR引物合成，引物序列：3′-5′:CATCCATGAGAACTATGGTATC,5′-3′:CCCCAAAAAGTTCCTGGATG。反應(yīng)條件為94℃ 2 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min 為第一步1個循環(huán)； 94℃ 45 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min 為第二步30個循環(huán)；72℃ 10 min延伸。應(yīng)用RT-PCR儀自帶分析軟件，產(chǎn)生PCR擴增曲線。

2結(jié)果

2.1Western印跡結(jié)果MT1-MMP在不同級別膠質(zhì)瘤中表達具有一定的差異性，膠質(zhì)瘤級別越高其條帶灰度值越高，膠質(zhì)瘤級別越低表達越弱，而在相對正常腦組織中表達最低(圖1)。

圖1　各組MT1-MMP表達的Western印跡結(jié)果

2.2RT-PCRMT1-MMP mRNA的表達呈現(xiàn)出與Western印跡結(jié)果一致的趨勢，腦組織(0.681±0.203)、Ⅰ級(1.158±0.539)、Ⅱ級(1.130±0.555)膠質(zhì)瘤與Ⅲ級(1.710±0.793)、Ⅳ級(1.849±0.690)膠質(zhì)瘤之間mT1-MMP表達具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，而Ⅲ級與Ⅳ級膠質(zhì)瘤之間無明顯差異性。

2.3MT1-MMP表達水平與膠質(zhì)瘤臨床特征的關(guān)系對所有患者進行跟蹤隨訪直至死亡，未死亡的病例隨訪至2年。對患者性別、年齡、腫瘤復(fù)發(fā)情況、生存期等臨床特點與MT1-MMP表達情況進行相關(guān)性分析，結(jié)果性別、年齡等與患者MT1-MMP表達情況無相關(guān)性，而腫瘤級別與MM1-MMP表達呈正相關(guān)，生存期與MT1-MMP表達呈負相關(guān)性。見表1。

表1MT1-MMP表達情況與臨床特征的相關(guān)性〔n(%)〕

指標(biāo)nMT1-MMP高表達P值性別 男3121(66.6)0.9021 女2317(68.2)年齡(歲) ≤603625(70.27)0.7015 >601813(66.66)腫瘤級別 Ⅰ40(0)0.0201 Ⅱ103(30.00) Ⅲ178(47.05) Ⅳ2317(73.91)生存期(個月) ≤62815(61.80)0.0391 >62623(90.47)

3討論

膠質(zhì)瘤多呈浸潤性生長、邊界不清，往往伴有壞死、出血等病理形態(tài)，是致死率最高的惡性腫瘤之一。目前臨床上針對膠質(zhì)瘤的治療主要是“手術(shù)+放療+化療”的系統(tǒng)治療方案，但由于膠質(zhì)瘤邊界不清，多生長在重要的腦功能區(qū)，所以手術(shù)常很難完全切除，而其對放療敏感性較差，同時由于血腦屏障的限制，化療藥物作用有限，因此膠質(zhì)瘤預(yù)后較差，特別是膠質(zhì)母細胞瘤，多數(shù)患者生存期僅數(shù)月到1年。膠質(zhì)瘤的基因靶向治療是近年來興起的治療方式，楊學(xué)軍等〔4〕對膠質(zhì)瘤基因治療做了大量的研究，在體外實驗中取得了一定的成果。

MT1-MMP是膜型MMPs家族中的成員之一，主要參與細胞外基質(zhì)的降解和激活MMPs家族另外的多種金屬基質(zhì)蛋白酶，對腫瘤的侵襲、擴散、細胞增殖及腫瘤新生血管的形成都具有直接的誘導(dǎo)和促進作用。MT1-MMP可降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原，破壞腫瘤擴散轉(zhuǎn)移的重要生理屏障。文獻〔5〕報道MT1-MMP可以通過與不同的細胞因子相互作用而加快腫瘤細胞的遷移，而Udayakumar等〔6〕報道MT1-MMP可以通過上調(diào)血管內(nèi)皮細胞生長因子，誘導(dǎo)堿性成纖維細胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、肝細胞生長因子等表達，從而促進腫瘤血管的生成。而事實上MT1-MMP的表達同樣受到多種因素的調(diào)節(jié)，Lee等〔7〕報道金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)是MT1-MMP的天然內(nèi)源性抑制因子，通過調(diào)低TIMP后腫瘤細胞系的生長受到明顯抑制。

徐濤等〔8〕檢測123例肝癌組織，依據(jù)腫瘤進展程度將其分為浸潤組和非浸潤組，結(jié)果顯示MT1-MMP在浸潤組的表達明顯高于對照組，并且浸潤組中伴有血清VEGF 的升高和腫瘤血管的增加。苗杰〔9〕則探討了胃癌組織中CD147、MT1-MMP表達情況，結(jié)果顯示胃癌組織中MT1-MMP、CD147表達明顯高于正常胃黏膜組織，且與分化程度、轉(zhuǎn)移程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)；CD147蛋白表達與MT1-MMP呈正相關(guān)(r=0.467，P<0.01)。MT1-MMP在膠質(zhì)瘤中的表達也有相關(guān)報道〔10〕，其結(jié)果與本文基本相似，但未作出臨床特征關(guān)聯(lián)。姚廣裕等〔11〕發(fā)現(xiàn)MT1-MMP可以通過激活MMP-2影響乳腺癌細胞株的浸潤能力。

總之，筆者認為MT1-MMP對膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展具有一定的影響和促進作用，但是膠質(zhì)瘤的各種生物學(xué)行為受到多種基因的調(diào)控，MT1-MMP在膠質(zhì)瘤生長中的具體作用目前尚不得而知，需要通過深入的基礎(chǔ)研究進行探討。但在本研究中MT1-MMP在高級別膠質(zhì)瘤中表達明顯增強，并且與生存期呈負相關(guān)，至少提示有可能將MT1-MMP作為一個潛在靶向基因治療的位點，為膠質(zhì)瘤的治療提供一個新的方向。

4參考文獻

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〔2013-07-11修回〕

(編輯徐杰)