張 萌 王寶周 陳 俊 翁武銀

（集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021）

近年來，中國淡水漁業(yè)快速發(fā)展，2013年淡水魚年產量已經超過2 600萬t［1］，隨著魚類深加工制品的市場需求和消費比例的上升，加工過程產生了大量的魚皮、魚鱗和魚骨等下腳料。魚皮中膠原含量占干重的50%左右［2］，可以制備成具有抗氧化、降血壓、抗腫瘤和抗衰老等生物活性的膠原肽［3－5］。現代營養(yǎng)學研究［6－9］發(fā)現，寡肽與氨基酸一樣可以被人體直接吸收，而且人體對寡肽的利用效果甚至高于游離氨基酸。然而，隨著寡肽含量的增加膠原肽顏色逐漸變黃［10，11］，導致魚皮膠原肽產品的應用受到限制。

目前，蛋白肽脫色大多采用雙氧水氧化法、活性炭和大孔樹脂吸附法［12－15］。利用雙氧水對蛋白肽進行脫色處理，雖然可得到較好的脫色效果［12］，但由于雙氧水具有強致癌性，殘留物將會給具有保健功能的蛋白肽帶來負面影響。而活性炭和大孔吸附樹脂作為脫色吸附劑具有脫色率高、脫色用時短、安全可靠等特點，已在多肽制備領域得到廣泛應用。然而，有關活性炭、大孔吸附樹脂對膠原肽脫色的系統(tǒng)比較卻未見報道。

本研究擬以羅非魚皮膠原為原料制備膠原肽，利用活性炭、大孔吸附樹脂建立膠原肽脫色工藝，考察脫色前后的膠原肽的分子量分布和氨基酸組成，為優(yōu)化膠原肽的脫色工藝提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

魚皮膠原：由集美大學水產品加工研究室提供；

復合蛋白酶：20萬U/g，龍巖市潤寶生物科技有限公司；

粉末活性炭（粒徑200目）、LH－301型大孔吸附樹脂：龍巖市潤寶生物科技有限公司；

DC蛋白測定試劑盒：美國Bio－Rad公司；

羥脯氨酸試劑盒：南京建成生物工程研究所；

乙腈、甲醇：色譜純，美國INC公司；

三氟乙酸：色譜純，美國Amresco公司；

鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇：分析純，西隴化工股份有限公司；

試驗用水：本實驗室用Millipore Milli Q RG超純水系統(tǒng)制備。

1.1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機：Avanti J－25型，美國Beckman公司；

pH 計：FE 20型，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；

紫外分光光度計：UV－2600A型，上海元析儀器有限公司；

高效液相色譜儀：Aglient 1200型，美國Agilent公司；

高速全自動氨基酸分析儀：日立L－8900型，日本日立制造所；

凝膠色譜柱：TSKgel G2000SWXL型，日本Tosho株式會社。

1.2 試驗方法

1.2.1 魚皮膠原肽的制備 將魚皮膠原溶解后調整至一定濃度，加入相對蛋白質量1%的復合蛋白酶，在pH 7.5，50℃水浴下酶解6h后，利用沸水浴滅酶5min，冰浴冷卻、離心（10 000×g，4℃，30min）后，獲得的上清液通過冷凍干燥制備成膠原肽粉末。

1.2.2 脫色率和肽損失率的測定 將膠原肽用蒸餾水溶解后，加入活性炭或大孔吸附樹脂進行脫色，通過測定脫色前后膠原肽溶液在波長為400nm處的吸光值，按式（1）計算膠原肽脫色率［16］。通過測定膠原肽溶液在脫色前后蛋白含量的變化，按式（2）計算肽損失率。

式中：

A——脫色率，%；

A1——脫色前酶解液在400nm處的吸光值；

A2——脫色后上清液在400nm處的吸光值。

W——肽損失率，%；

W1——脫色前酶解液中蛋白含量，mg/mL；

W2——脫色后上清液中蛋白含量，mg/mL。

1.2.3 活性炭脫色工藝優(yōu)化 在預試驗中，研究了溫度（35，40，45，50℃）對膠原肽脫色的影響，發(fā)現溫度對活性炭脫色沒有顯著的影響，因此選擇在室溫條件下，考察pH值、活性炭添加量、脫色時間以及蛋白濃度等4個因素對膠原肽脫色率和肽損失率的影響。

（1）pH值的影響：在蛋白濃度50mg/mL，活性炭添加量1.00%，脫色時間30min的條件下，考察pH對羅非魚皮膠原肽脫色率和肽損失率的影響。

（2）活性炭添加量的影響：在蛋白濃度50mg/mL，pH 5.0，脫色時間30min的條件下，考察活性炭添加量對羅非魚皮膠原肽脫色率和肽損失率的影響。

（3）脫色時間的影響：在pH 5.0，蛋白濃度50mg/mL，活性炭添加量1.00%的條件下，考察脫色時間對羅非魚皮膠原肽脫色率和肽損失率的影響。

（4）蛋白濃度的影響：在pH 5.0，活性炭添加量1.00%，脫色時間30min的條件下，考察蛋白濃度對羅非魚皮膠原肽脫色率和肽損失率的影響。

（5）正交試驗：在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，通過脫色率和肽損失率兩個指標來綜合評定脫色效果［17］，按式（3）計算脫色效果的綜合評分。

式中：

T——綜合評分，%；

A——脫色率，%；

W——肽損失率，%。

1.2.4 大孔吸附樹脂脫色工藝的優(yōu)化 在預試驗中，研究了溫度（35，40，45，50℃）對膠原肽脫色的影響，發(fā)現溫度對大孔吸附樹脂脫色沒有顯著的影響，因此選擇在室溫條件下，考察pH值、大孔吸附樹脂添加量、脫色時間以及蛋白濃度等4個因素對膠原肽脫色率和肽損失率的影響。

（1）pH值的影響：在蛋白濃度50mg/mL，大孔吸附樹脂添加量1.00%，脫色時間30min的條件下，考察pH對羅非魚皮膠原肽脫色率和肽損失率的影響。

（2）大孔吸附樹脂添加量的影響：在pH 5.0，蛋白濃度50mg/mL，脫色時間30min的條件下，考察大孔吸附樹脂添加量對羅非魚皮膠原肽脫色率和肽損失率的影響。

（3）脫色時間的影響：在pH 5.0，蛋白濃度50mg/mL，大孔吸附樹脂添加量0.75%的條件下，考察脫色時間對羅非魚皮膠原肽脫色率和肽損失率的影響。

（4）蛋白濃度的影響：在pH 5.0，大孔吸附樹脂添加量0.75%，脫色時間45min的條件下，考察蛋白濃度對羅非魚皮膠原肽脫色率和肽損失率的影響。

（5）正交試驗：在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，通過脫色率和肽損失率兩個指標來綜合評定脫色效果［17］，按式（3）計算脫色效果的綜合評分。

1.2.5 膠原肽分子量分布的測定 利用高效液相色譜儀［18］測定膠原肽分子量，并用GPC軟件對其分子量分布進行分 析。色 譜 柱 為 TSKgel G2000SWXL （300mm×7.8mm），流動相為乙腈/水/三氟乙酸（45∶55∶0.1，V/V/V），在柱溫30℃、流速0.5mL/min條件下，以檢測波長214nm對樣品進行測定。其中標準品為：細胞色素C（12 327Da）、抑肽酶（6 533Da）、氧化型谷胱甘肽（613Da）、Gly－Gly－Gly（189Da）、Gly（75Da）。

1.2.6 氨基酸組成分析 膠原肽粉末利用可密封的消化管，在抽真空、充氮氣、110℃下用6mol/L HCl水解22h后，通過蒸餾除去鹽酸，稀釋至一定濃度后過0.22"m水系濾膜，利用全自動氨基酸分析儀進行分析。其中羥脯氨酸的含量利用試劑盒進行測定。

1.2.7 數據分析 采用SPSS 17.0軟件（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）對所得數據進行方差分析（ANOVA），顯著性檢驗方法為Duncan多重檢驗，顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 活性炭脫色工藝的優(yōu)化

2.1.1 pH值的影響 由圖1可知，伴隨pH的升高，膠原肽的脫色率與肽損失率都出現下降趨勢。這與明膠酶解液、大豆多肽的活性炭脫色效果類似［16，19］，在弱酸性條件下脫色率高，但多肽容易被吸附。由于在pH 5.0下脫色率已經達到82.57%，因此為了避免pH過低導致膠原肽的損失，選擇pH 為5.0。

圖1 pH對膠原肽脫色率和肽損失率的影響Figure 1 Effect of pH on the decolorizing rate and peptide loss of collagen peptides

2.1.2 活性炭添加量的影響 由圖2可知，當活性炭添加量由0.25%增加到2.00%時，膠原肽的脫色率由61.47%提高到87.46%，然而肽損失率也由2.20%上升至11.07%，這個趨勢類似于Ma等［20］的報道。為了盡量減少多肽損失，選擇活性炭添加量為1.00%。

圖2 活性炭添加量對膠原肽脫色率和肽損失率的影響Figure 2 Effect of activated carbon dosage on the decolorizing rate and peptide loss of collagen peptides

2.1.3 脫色時間的影響 由圖3可知，伴隨著脫色時間的延長，膠原肽脫色率與肽損失率都出現逐漸上升并趨向穩(wěn)定的趨勢，其中脫色率在30min時趨于穩(wěn)定，而肽損失率卻在60min后才開始達到平穩(wěn)。因此，選用脫色時間為30min考察蛋白濃度對脫色效果的影響。

圖3 脫色時間對膠原肽脫色率和肽損失率的影響Figure 3 Effect of decolorizing time on the decolorizing rate and peptide loss of collagen peptides

2.1.4 蛋白濃度的影響 由圖4可知，蛋白濃度對脫色率具有顯著的影響，濃度從50mg/mL時提高到300mg/mL時，膠原肽的脫色率由80.82%降至43.40%。然而蛋白濃度對肽損失率的影響并不明顯，基本穩(wěn)定在4.5%左右。綜合考慮，選擇蛋白濃度為50mg/mL。

圖4 蛋白濃度對膠原肽脫色率和肽損失率的影響Figure 4 Effect of protein concentration on the decolorizing rate and peptide loss of collagen peptides

2.1.5 正交試驗結果與分析 根據單因素試驗結果，設計了活性炭脫色的正交試驗的各因素水平見表1，正交試驗結果見表2。

由表2可知：各因素對活性炭脫色率影響大小為：蛋白濃度＞活性炭添加量＞pH＞時間，優(yōu)化結果為：pH 4.5、活性炭添加量2.00%、脫色時間60min、蛋白濃度50mg/mL。肽損失率影響大小為：活性炭添加量＞蛋白濃度＞時間＞pH，優(yōu)化結果為：pH 5.0、活性炭添加量0.50%、脫色時間60min、蛋白濃度100mg/mL。

表1 活性炭脫色試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of decolorizing experiment with activated carbon

表2 活性炭脫色正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for decolorizing conditions of activated carbon

為進一步確定最佳試驗方案，根據正交試驗結果，以綜合加權評分的方法對脫色率和肽損失率兩項指標進行綜合評分，得到各因素對活性炭總體脫色效果的影響與脫色率一致。驗證實驗（n＝5）表明，活性炭脫色效果最佳時，膠原肽的脫色率可以達到（92.66±1.99）%，肽損失率為（11.23±0.18）%，綜合評分為（90.72±1.40）%。

2.2 大孔吸附樹脂脫色工藝的優(yōu)化

2.2.1 pH值的影響 由圖5可知，伴隨pH的升高，膠原肽的脫色率與肽損失率都出現下降趨勢，與活性炭類似。當pH為5.0時，膠原肽的脫色率為42.74%，脫色效果不及活性炭。為了避免pH過低導致膠原肽的損失，選擇pH為5.0。

2.2.2 大孔吸附樹脂添加量的影響 由圖6可知，在pH 5.0下增加大孔吸附樹脂添加量，膠原肽的脫色率與肽損失率都出現上升趨勢，這與大孔樹脂對海地瓜膠原多肽的脫色效果類似［13］。以脫色率最高和肽損失率最小為目標，選擇大孔吸附樹脂添加量為0.75%。

2.2.3 脫色時間的影響 由圖7可知，隨著脫色時間的延長，膠原肽脫色率與肽損失率都逐漸上升并趨向穩(wěn)定，二者均在45min時趨于穩(wěn)定。因此，選用脫色時間為45min考察蛋白濃度對膠原肽脫色效果的影響。

圖5 pH對膠原肽脫色率和肽損失率的影響Figure 5 Effect of pH on the decolorizing rate and peptide loss of collagen peptides

圖6 大孔吸附樹脂添加量對膠原肽脫色率和肽損失率的影響Figure 6 Effect of macroporous adsorption resin dosage on the decolorizing rate and peptide loss of collagen peptides

圖7 脫色時間對膠原肽脫色率和肽損失率的影響Figure 7 Effect of decolorizing time on the decolorizing rate and peptide loss of collagen peptides

2.2.4 蛋白濃度的影響 由圖8可知，當蛋白濃度從50mg/mL提 高 到300mg/mL 時，膠 原 肽 的 脫 色 率 從77.04%下降至41.51%，然而蛋白濃度對肽損失率的影響并不明顯，這與活性炭脫色效果（圖4）類似。因此，根據脫色效果，選擇蛋白濃度為50mg/mL。

2.2.5 正交試驗結果與分析 根據單因素試驗結果，設計了大孔吸附樹脂的正交試驗的各因素水平見表3，正交試驗結果見表4。

圖8 蛋白濃度對膠原肽脫色率和肽損失率的影響Figure 8 Effect of protein concentration on the decolorizing rate and peptide loss of collagen peptides

表3 大孔吸附樹脂脫色正交試驗因素與水平Table 3 Factors and levels of decolorizing experiment with macroporous adsorption resin

由表4可知，各因素對大孔吸附樹脂脫色率的影響大小為：蛋白濃度＞大孔吸附樹脂添加量＞時間＞pH，優(yōu)化結果為pH 4.5、大孔吸附樹脂添加量1.00%、脫色時間45min、蛋白濃度50mg/mL。各因素對肽損失率影響大小為：大孔吸附樹脂添加量＞蛋白濃度＞時間＞pH，優(yōu)化結果為pH 5.5、大孔吸附樹脂添加量0.50%、脫色時間45min、蛋白濃度為200mg/mL。

綜合評分優(yōu)化大孔吸附樹脂最佳脫色條件，驗證實驗（n＝5）表明，大孔吸附樹脂脫色率為（83.02±1.04）%，肽損失率為（30.77±0.41）%，綜合評分為（76.13±0.41）%，結果表明大孔吸附樹脂對膠原肽的脫色效果低于活性炭。

綜上所述，不管是活性炭還是大孔吸附樹脂，影響脫色率的主要因素都是蛋白濃度，而影響肽損失率的主要因素都是吸附材料的添加量。雖然膠原肽溶液中蛋白濃度越低，脫色效果越好，然而考慮到實際應用的生產成本，本試驗將溶液中蛋白濃度的最低值設定為50mg/mL。

2.3 脫色工藝對膠原肽分子量分布的影響

利用HPLC對活性炭或大孔吸附樹脂脫色前后羅非魚皮膠原肽的分子量進行測定，并利用GPC軟件對膠原肽分子量進行分段分析，結果見圖9和表5。由圖9和表5可知，本研究制備的膠原肽其分子量分布在150～2 000Da，而且主要集中于350Da和1 400Da附近。其中，分子量小于1 000Da的寡肽含量占總膠原肽的比例為66.3%，高于Julio等［21］利用鯊魚皮制備的膠原肽。雖然 Wasswa等［22］制備的鱸魚、草魚和羅非魚皮多肽中小于1 000Da的組分占比達到78%左右，但其中含有大量游離氨基酸，分子量分布比較分散。相對氨基酸及大分子多肽，寡肽不僅易于人體吸收代謝，而且具有更高的生物活性［6－9］。因此，本研究制備的膠原肽具有良好的應用價值。

表4 大孔吸附樹脂脫色正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal tests for decolorizing conditions of macroporous adsorption resin

利用活性炭對魚皮膠原肽進行脫色后，在HPLC圖譜中1 400Da的波峰沒有發(fā)現明顯的變化，但350Da的波峰卻轉變成310Da。通過分析分子量分布的變化，發(fā)現經過活性炭脫色后，500～1 000Da的膠原肽組分含量的占比明顯減少的同時，1 500Da以上的膠原肽組分含量也出現一定程度地減少，表明這些組分容易被活性炭吸附脫除。另一方面，利用大孔吸附樹脂對魚皮膠原肽進行脫色時，500～1 000Da的膠原肽組分含量的減少比例明顯低于活性炭脫色的樣品。這個結果與脫色效果（表2和表4）趨勢一致。據報道，活性炭在脫色過程會吸附一定量的氨基酸［23］，而大孔吸附樹脂除了吸附游離氨基酸外，對肽分子也有較強的吸附作用［24］。而且，Wasswa等［10］研究發(fā)現當草魚魚皮酶解液中分子量為500～1 000Da組分所占比例升高時，酶解液的顏色會加深。因此，可推測分子量在500～1 000Da的組分可能是影響膠原肽顏色的主要因素。

圖9 膠原肽高效液相凝膠色譜圖Figure 9 SE—HPLC of collagen peptides

表5 脫色工藝對膠原肽分子量分布的影響Table 5 Effect of decolorizing on the molecular weight distribution of collagen peptides %

2.4 脫色工藝對膠原肽氨基酸組成的影響

脫色工藝對膠原肽氨基酸含量的影響見表6。由表6可知，吸附前酶解液中氨基酸含量為568.7mmol/L。經活性炭脫色后，氨基酸含量減少21.48%，而經大孔吸附樹脂脫色后，氨基酸含量減少29.96%，表明大孔樹脂對極性氨基酸吸附量略高于活性炭。研究發(fā)現，活性炭對芳香族氨基酸具有較強的吸附作用［25］；而大孔吸附樹脂通過疏水相互作用對色素及蛋白質進行吸附的同時，其本身的多孔性結構還會保留部分多肽［24，26］。因此，利用大孔吸附樹脂脫色容易吸附極性氨基酸，導致膠原肽氨基酸損失率高于活性炭。

表6 脫色工藝對膠原肽氨基酸含量的影響Table 6 Effect of decolorizing on the amino acid content of collagen peptides

表6 脫色工藝對膠原肽氨基酸含量的影響Table 6 Effect of decolorizing on the amino acid content of collagen peptides

Δ表示活性炭和大孔吸附樹脂脫色前后膠原肽氨基酸損失的摩爾數百分比［24］。

氨基酸含量/（mmol·L－1）氨基酸 吸附前 活性炭脫色后 Δ/% 大孔吸附樹脂脫色后 Δ/%天冬氨酸（Asp） 24.8 22.0 11.34 18.8 24.31蘇氨酸（Thr） 11.8 10.8 8.99 8.8 25.93絲氨酸（Ser） 17.1 15.5 8.97 13.1 23.44谷氨酸（Glu） 39.8 35.1 11.71 29.8 24.92甘氨酸（Gly） 189.5 161.2 14.97 139.7 26.28丙氨酸（Ala） 65.2 47.3 27.46 41.8 35.89纈氨酸（Val） 11.1 7.5 32.30 6.6 41.01蛋氨酸（Met） 5.4 4.9 9.36 4.3 21.39異亮氨酸（Ile） 5.1 3.7 26.99 3.3 34.36亮氨酸（Leu） 11.1 9.2 16.84 10.2 8.19酪氨酸（Tyr） 2.4 0.6 74.36 0.5 80.77苯丙氨酸（Phe） 9.1 4.1 54.48 5.4 40.69賴氨酸（Lys） 13.4 11.5 13.79 9.2 31.54組氨酸（His） 25.4 1.2 95.28 1.7 93.24精氨酸（Arg） 30.2 26.3 12.75 21.0 30.36脯氨酸（Pro） 80.5 63.9 20.57 60.8 24.53羥脯氨酸（Hyp） 26.8 21.6 19.55 23.5 12.29半胱氨酸（Cys） 0 0 0 0 0合計 568.7 446.5 — 398.3—

3 結論

在單因素試驗基礎上，通過正交試驗分別獲得羅非魚皮膠原肽的活性炭和大孔吸附樹脂脫色的最優(yōu)條件，活性炭的脫色效果明顯優(yōu)于大孔吸附樹脂。通過比較脫色前后膠原肽的分子量分布發(fā)現，500～1 000Da組分可能是影響膠原肽顏色的主要因素。經活性炭或大孔吸附樹脂脫色后，膠原肽中氨基酸含量均減少，但利用大孔吸附樹脂脫色會使膠原肽氨基酸損失率更高。本研究結果將為膠原肽的脫色工藝優(yōu)化提供理論基礎，有助于提高魚膠原肽產品品質和擴大其應用范圍。

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