唐鑫媛 夏延斌 文新昱 王亮亮

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128)

辣椒是中國(guó)一種重要的藥食同源的蔬菜，同時(shí)也是主要的辛辣調(diào)味品［1］。辣椒富含辣椒堿、辣椒紅素、β-胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、VC等。其中辣椒紅素已被美國(guó)FAO、WHO和中國(guó)國(guó)標(biāo)等組織審定為無(wú)限制性使用的天然食品添加劑［2］。目前，美國(guó)一年所需辣椒紅色素越1 000 t;日本每年約需辣椒紅色素500 t;加拿大、澳大利亞、西歐等市場(chǎng)的需求量也很大。中國(guó)盛產(chǎn)辣椒，是世界上最大的辣椒紅色素出口國(guó)［3］。然而，紅辣椒在提取辣椒紅素后會(huì)產(chǎn)生大量的廢料，如辣椒渣，其產(chǎn)率可達(dá)到所投原料干辣椒的80%［4］。辣椒渣，又稱辣椒粕，含有蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、VB1、尼克酸及多種礦物質(zhì)等;蛋白質(zhì)含量較高約14%～19%，并含有大量人體必需氨基酸［4］。

常用的蛋白質(zhì)提取方法有水溶液提取法、有機(jī)溶液提取法、酶法、超聲波輔助提取法等［5］。目前已有針對(duì)辣椒渣中黃酮、總酚、抗氧化物質(zhì)等物質(zhì)提取的研究［6，7］，但對(duì)辣椒渣中蛋白質(zhì)提取的研究迄今尚未見諸于報(bào)道。本研究擬以辣椒渣為原料，采用堿法和超聲波結(jié)合的方法，以提取時(shí)間、提取溫度、料液比、堿液濃度為主要因素，以辣椒渣蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，探討最佳辣椒蛋白的提取工藝，為辣椒渣的高值化利用打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品

辣椒渣:山東中椒英潮辣業(yè)發(fā)展有限公司。凱氏定氮法測(cè)定其蛋白質(zhì)含量為15.67%;經(jīng)氨基酸自動(dòng)分析儀分析辣椒渣中蛋白質(zhì)氨基酸組成，測(cè)得辣椒蛋白質(zhì)為酸性蛋白質(zhì)，進(jìn)一步確定了采用堿液提取的可靠性［8］。

1.1.2 主要試劑

NaOH:分析純，天津市船化學(xué)試劑科技有限公司;

硫酸、鹽酸:分析純，衡陽(yáng)市凱信化工試劑有限公司;

CuSO4、K2SO4、硼酸:分析純，西隴化工股份有限公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

中藥粉碎機(jī):FW177型，天津市泰斯特儀器有限公司;

數(shù)控超聲波清洗儀:KQ-250DE型，昆山市超聲儀器有限公司;

低速離心機(jī):LD5-2A型，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司;

pH計(jì):PHS-3C型，上海精密科學(xué)儀器有限公司;

冷凍干燥機(jī):FD-1B型，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;

全自動(dòng)凱氏定氮儀:VAP50S型，德國(guó)Gerhardt公司。

1.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用凱氏定氮法［9］。按式(1)計(jì)算蛋白提取率:

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

辣椒渣→粉碎→過(guò)篩→堿法提取/超聲輔助堿法提取→離心→上清液→酸沉→離心→沉淀→透析脫鹽→冷凍干燥→辣椒粗蛋白［10］

1.3.2 最適原料粒度的確定 對(duì)原料進(jìn)行粉碎，分別過(guò)20，40，60，80，100，120 目篩，稱取各粒度辣椒渣 20 g，在堿液濃度0.1 mol/L，料液比為1∶25(m∶V)，提取溫度40℃的條件下提取1 h，測(cè)定蛋白質(zhì)提取率，選取最優(yōu)原料粒度［10］。

1.3.3 辣椒渣蛋白質(zhì)單一堿法提取工藝

(1)提取時(shí)間對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響:稱取過(guò)篩100目的辣椒渣20 g，在堿液濃度0.3 mol/L，料液比1∶25(m∶V)，提取溫度50℃的條件下，分別考察不同處理時(shí)間(30，60，90，120，150，180，210，240 min)對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響。

(2)提取溫度對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響:稱取過(guò)篩100目的辣椒渣20 g，在堿液濃度0.3 mol/L，料液比1∶25(m∶V)，提取時(shí)間120 min的條件下，分別考察不同提取溫度(30，40，50，60，70 ℃)對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響。

(3)料液比對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響:稱取過(guò)篩100目的辣椒渣20 g，在堿液濃度0.3 mol/L，提取溫度50℃，提取時(shí)間120 min的條件下，分別考察不同料液比(1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40(m∶V))對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響。

(4)堿液濃度對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響:稱取過(guò)篩100目的辣椒渣20 g，在料液比1∶25(m∶V)，溫度50℃，提取時(shí)間120 min的條件下，分別考察不同堿液濃度(0.06，0.08，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mol/L)對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響。

1.3.4 辣椒渣蛋白質(zhì)超聲堿法提取工藝

(1)超聲波功率對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響:稱取過(guò)篩100目的辣椒渣20 g，在堿液濃度0.1 mol/L，料液比為1∶25(m∶V)，提取溫度40℃，提取時(shí)間1 h的條件下，分別考察不同超聲波功率(0，100，150，200，250 W)對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響。

(2)提取時(shí)間對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響:稱取過(guò)篩100目的辣椒渣20 g，在堿液濃度0.3 mol/L，料液比1∶25(m∶V)，提取溫度50℃的條件下，分別考察不同超聲提取時(shí)間(30，60，90，120，150 min)對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響。

(3)提取溫度對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響:稱取過(guò)篩100目的辣椒渣20 g，在堿液濃度0.3 mol/L，料液比1∶25(m∶V)，超聲提取時(shí)間120 min的條件下，分別考察不同提取溫度(30，40，50，60，70 ℃)對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響。

(4)料液比對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響:稱取過(guò)篩100目的辣椒渣20 g，在堿液濃度0.3 mol/L，提取溫度50℃，超聲提取時(shí)間120 min的條件下，分別考察不同料液比(1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40(m∶V))對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響。

(5)堿液濃度對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響:稱取過(guò)篩100目的辣椒渣20 g，在料液比1∶25(m∶V)，溫度50℃，超聲提取時(shí)間120 min的條件下，分別考察不同堿液濃度(0.06，0.08，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mol/L)對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響。

1.3.5 辣椒蛋白質(zhì)提取條件的優(yōu)化 以辣椒蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)，選取最適原料粒度和最適超聲功率，并通過(guò)單一堿法和超聲輔助堿法分別研究提取時(shí)間、提取溫度、料液比和堿液濃度對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取率的影響。選取最優(yōu)的單因素條件，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最佳蛋白質(zhì)提取工藝。

1.3.6 辣椒蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定 在正交最優(yōu)提取條件下，提取辣椒蛋白質(zhì)，將提取液分裝于50 mL離心管，每管30 mL，用 1 mol/L HCl調(diào)節(jié)各管提取液 pH 分別為 2.8，3 .0，3.2，3.4，3.6，3.8，4.0，4.2，4.2，4.4，4.6。靜止 30 min，3 000 r/min離心5 min，去上清液，沉淀經(jīng)干燥后稱重。沉淀物最重的即為辣椒蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料粒度對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響

由圖1可知，隨著原料粒度的增大，蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)，從20目的39.41%到120目的46.02%，原料粒度每增大20目，蛋白質(zhì)提取率平均提高1.32%。原料粒度從100目到120目，蛋白質(zhì)提取率僅增加0.46%。同時(shí)原料粒度增大，蛋白質(zhì)提取率提高，其他可溶性雜質(zhì)也更容易被溶出，降低粗提物中蛋白質(zhì)的含量，且增加后期純化難度［11］。綜合考慮，原料適宜粉碎粒度為100目。

圖1 原料粒度對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響Figure 1 Effect of material size on extraction rate of pepper protein

2.2 超聲功率對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響

由圖2可知，采用超聲波輔助堿法提取辣椒渣蛋白質(zhì)后，辣椒渣蛋白質(zhì)提取率顯著提高，超聲功率250 W時(shí)的提取率比無(wú)超聲輔助提取的提取率高出31.71%。超聲波功率為100，150，200，250 W時(shí)，辣椒渣蛋白質(zhì)提取率由70%分別提高至72%，74%，77%，超聲波功率越高，辣椒渣蛋白質(zhì)提取率越大。研究表明:對(duì)于一定頻率的超聲波，功率增大，聲強(qiáng)越大，空化泡崩潰的時(shí)間變短，提高了目的物的提取率［12］。綜合考慮，超聲波功率應(yīng)選250 W。

圖2 超聲功率對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響Figure 2 Effect of ultrasonic power on extraction rate of pepper protein

2.3 提取時(shí)間對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響

由圖3可知，兩種試驗(yàn)方法的提取率都隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，單一堿提法的蛋白質(zhì)提取率持續(xù)穩(wěn)定上升，而超聲波輔助堿法在90～150 min時(shí)，提取率提高得不顯著。單一堿法在提取時(shí)間240 min時(shí)，提取率達(dá)到64.12%，小于超聲提取時(shí)間30 min的提取率66.19%。由此可見，超聲波的輔助作用能顯著縮短辣椒蛋白質(zhì)的提取時(shí)間;同時(shí)超聲時(shí)間150 min時(shí)，提取率達(dá)到85.73%，比相同時(shí)間的單一堿法提取率高24.5%，超聲波輔助在很大程度也上提高了蛋白質(zhì)的提取率。這是因?yàn)槌暡ㄕ駝?dòng)引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)動(dòng)，改變了細(xì)胞通透性同時(shí)單向振動(dòng)引發(fā)膨脹，增多及加快了堿液向原料細(xì)胞滲透的幾率和速度，從而顯著減少了提取的時(shí)間，增大了提取率［13］。綜合考慮，選擇最佳提取時(shí)間是超聲提取90 min，此時(shí)提取率為82.6%。

圖3 提取時(shí)間對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響Figure 3 Effect of extracting time on extraction rate of pepper protein

2.4 提取溫度對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響

由圖4可知，單一堿法的提取率隨著溫度的上升一直顯著提高，在70℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率為82.25%，而超聲輔助提取溫度達(dá)到50℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率為84.91%，隨后趨于穩(wěn)定。隨著溫度的提高，水分子的熱運(yùn)動(dòng)加劇，與此同時(shí)蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)伸展，這樣有利于蛋白質(zhì)的溶解，從而提高了提取率;但是溫度過(guò)高，易導(dǎo)致辣椒蛋白質(zhì)熱變性，不利于蛋白質(zhì)的加工應(yīng)用［13］。綜合考慮，超聲輔助堿液法的最佳提取溫度為50℃。

圖4 提取溫度對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響Figure 4 Effect of extracting time on extraction rate of pepper protein

2.5 料液比對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響

由圖5可知，隨著料液比的增大，兩種提取方法的提取率都是先增大后降低。隨著料液比的增大，體系的黏度降低，傳質(zhì)過(guò)程加快，因而提取率提高;但料液比過(guò)高，蛋白質(zhì)提取率增加緩慢，不利于蛋白質(zhì)的后期沉淀，且增加提取后廢水處理的負(fù)擔(dān)［14］。單一堿法和超聲輔助堿法分別在料液比為1∶30和1∶25(m∶V)時(shí)，提取率達(dá)到最大。

圖5 料液比對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響Figure 5 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of pepper protein

2.6 堿液濃度對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響

由圖6可知，隨著堿液濃度的提高，辣椒渣中蛋白質(zhì)的提取率不斷提高。堿液濃度0.5 mol/L比0.06 mol/L時(shí)，辣椒渣蛋白質(zhì)提取率高了25%;堿液濃度由0.3 mol/L升至0.5 mol/L時(shí)，蛋白質(zhì)提取率增大的幅度減緩，僅提高了1.7%;單一堿法提取時(shí)，辣椒渣中蛋白質(zhì)提取率即使在高堿液濃度的條件下仍然很低，為64.69%。堿法提取辣椒渣中蛋白質(zhì)時(shí)，所需堿液濃度高，有研究［15，16］表明，在高堿條件下，會(huì)改變蛋白質(zhì)的特性，生成賴丙氨酸等有毒物質(zhì)，引起辣椒蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失;并且采用高濃度的堿液提取時(shí)，酸法沉淀后粗蛋白質(zhì)中會(huì)有大量的鹽，不利于蛋白質(zhì)后期的除鹽純化［17］。綜合考慮，超聲輔助堿法提取的堿液濃度為0.3 mol/L最好。

圖6 堿液濃度對(duì)辣椒蛋白質(zhì)提取的影響Figure 6 Effect of NaOH concentration on extraction rate of pepper protein

2.7 辣椒蛋白質(zhì)超聲堿法提取條件的正交優(yōu)化

在單因素的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)以超聲時(shí)間、超聲溫度、料液比、堿液濃度為四因素三水平的正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test

由表2可知，各因素對(duì)辣椒蛋白提取率的影響順序?yàn)槌暅囟龋境晻r(shí)間＞堿液濃度＞料液比，最佳提取工藝為A3B3C2D2，即超聲溫度60℃，超聲時(shí)間120 min，堿液濃度0.3 mol/L，料液比1∶25(m∶V)。由正交試驗(yàn)分析，得出的最優(yōu)工藝條件與單因素分析得出的最宜提取條件有所偏差，如超聲時(shí)間，考慮到超聲時(shí)間越長(zhǎng)提取率越大，從提取率考慮，超聲時(shí)間120 min更好。在正交最佳工藝下測(cè)得辣椒蛋白質(zhì)的提取率為86.48%。

采用正交最優(yōu)工藝條件，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)［18］。結(jié)果見表3。由表3可知，辣椒蛋白質(zhì)平均提取率為86.41%;相對(duì)平均偏差為0.32%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.39%，且都小于5%。由此表明在最佳正交條件下蛋白質(zhì)提取率高，且試驗(yàn)重現(xiàn)性較好。

2.8 辣椒蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定

在正交最優(yōu)條件下提取辣椒蛋白質(zhì)，采用酸沉淀法和稱重法測(cè)定辣椒蛋白的等點(diǎn)。蛋白質(zhì)在某一pH的溶液中，它所帶的正電荷與負(fù)電荷相等時(shí)，靜電排斥作用最小，蛋白質(zhì)沉淀，因此可選取沉淀最大的pH值作為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)［19］。由圖7 可知，在 pH 3.6 時(shí)，沉淀物最重，即 pH 3.6 為采用堿溶酸沉法提取時(shí)辣椒蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。最后對(duì)辣椒粗蛋白進(jìn)行純度測(cè)定，測(cè)得蛋白質(zhì)純度為60.09%。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)Table 3 Results of reduplicate tests %

圖7 辣椒蛋白質(zhì)溶解度與pH的關(guān)系Figure 7 Effect of pH on solubility of pepper protein

3 結(jié)論

(1)提取辣椒蛋白質(zhì)，超聲輔助堿法比單一堿法提取效果好，同等條件下，大幅度提高了提取率。

(2)用超聲堿法提取蛋白質(zhì)的最佳工藝條件是:堿液濃度 0.3 mol/L，料液比 1∶25(m∶V)，堿提溫度60℃，超聲提取時(shí)間120 min。此條件下辣椒蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到86.41%，粗提取物中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60.09%，并測(cè)得辣椒蛋白質(zhì)的最佳等電點(diǎn)為pH 3.6，為辣椒渣蛋白質(zhì)的提取及應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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