李會(huì)珍 李 娜 張志軍 李曉君 陳 鐵
響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助亞麻木酚素提取工藝及抗氧化性研究
李會(huì)珍 李 娜 張志軍 李曉君 陳 鐵
(中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院,太原 030051)
以亞麻籽為原料,對(duì)超聲波輔助提取亞麻木酚素進(jìn)行了研究。通過單因素試驗(yàn),分別考察原料顆粒度、超聲功率、液固比、超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)亞麻木酚素得率的影響。并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法對(duì)超聲波提取亞麻木酚素工藝進(jìn)行優(yōu)化,建立了二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測(cè)模型。研究結(jié)果表明,超聲波輔助提取亞麻木酚素的最佳工藝條件為:原料顆粒度60目,提取溶劑60%乙醇,超聲功率400 W,液固比17∶1,超聲溫度40℃,超聲時(shí)間15 min,亞麻木酚素得率為7.18 mg/g。抗氧化活性研究表明,亞麻木酚素對(duì)DPPH、過氧化氫和超氧陰離子均有良好的清除能力,IC50值分別為145 mg/L、75 mg/L 和0.25 mg/L。
亞麻籽 木酚素 超聲波 響應(yīng)面法 抗氧化性
亞麻(linum usititatissimum Linaceae),俗稱“胡麻”,屬于亞麻科亞麻屬一年生草本植物,是世界十大油料作物之一[1-2]。亞麻籽含有豐富的脂肪酸、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素及酚酸類、黃酮類等營(yíng)養(yǎng)成分。由于亞麻籽富含必需脂肪酸—α-亞麻酸(LNA)和亞油酸(LA),且這兩種脂肪酸的比例比較適合人類營(yíng)養(yǎng)需求,因此亞麻籽一直被認(rèn)為是人類獲取必需脂肪酸的最佳來源。但是,近年來研究發(fā)現(xiàn),亞麻籽中還含有一種很具開發(fā)潛力的成分——木酚素,是存在于亞麻籽種皮中的一種生理活性物質(zhì),一般約占籽粒質(zhì)量的0.9% ~1.5%,比其他已知含木酚素的66種食品高75~800倍[3]。亞麻木酚素又叫開環(huán)異落葉松酚二葡萄糖苷(SDG,Secoisolariciresinol Diglucoside),是與人體雌激素十分相似的植物激素,對(duì)雌激素依賴性疾病乳腺癌、前列腺癌、經(jīng)期綜合征、骨質(zhì)疏松等有較好的預(yù)防作用。除此之外,臨床研究顯示亞麻木酚素具有抗氧化性,而且對(duì)糖尿病、胃腸腫瘤、冠心病、腎臟病,抗氧化性都有有益的作用[4-7]。近年來,符合療效性要求的高純度標(biāo)準(zhǔn)化木酚素提取物產(chǎn)品也已上市,可廣泛應(yīng)用于膠囊壓片、谷物早餐和快餐食品的添加劑。而中國(guó)是亞麻生產(chǎn)大國(guó),開發(fā)利用亞麻木酚素具有廣闊的市場(chǎng)前景和研究意義。
目前,亞麻木酚素的提取方法主要有溶劑萃取法[8]、亞臨界水提?。?-10]、超臨界CO2萃取法和酶法[11]等。溶劑萃取法雖然成本較低,但是耗時(shí)太長(zhǎng),提取率低。超臨界CO2萃取法和酶法則存在成本較高,不易推廣的缺點(diǎn)。超聲波輔助提取技術(shù)以其溶劑耗量少,省時(shí)高效的特點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用[3]。本試驗(yàn)以Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理和響應(yīng)面法,對(duì)亞麻木酚素超聲波輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,以期獲得最佳提取工藝,并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究,以期為亞麻木酚素的開發(fā)和應(yīng)用提供技術(shù)依據(jù)。
亞麻籽:中北大學(xué)生物資源化工研究所。開環(huán)異落葉松樹脂酚(SECO)標(biāo)樣:純度95%,Sigma公司。正己烷、無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、磷鉬酸等:均為分析純,天津光復(fù)試劑廠。
UV-9600紫外可見光分光光度計(jì):北京瑞麗分析儀器有限公司;TH-400BQG數(shù)控超聲波清洗器:濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司;DHG-9023A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海申光儀器廠。
1.2.1 磷鉬酸顯色法測(cè)定亞麻木酚素標(biāo)準(zhǔn)曲線
以甲醇溶解SECO,配制濃度為11.65μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。分別移取0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL 標(biāo)準(zhǔn)液至20 mL試管中,各加入3倍體積5%的磷鉬酸乙醇溶液(g/mL),在80℃水浴中蒸去溶劑,將各管移入沸水浴中加熱15 min,然后流水冷卻,加入10 mL蒸餾水,振蕩至完全溶解,然后用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描,確定最大吸收波長(zhǎng),在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定各處理的吸光值,以濃度對(duì)吸光值做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.2.2 亞麻木酚素提取及得率測(cè)定
將亞麻籽粉碎后過20、40、60、80、100 目篩,分別與正己烷1∶6混合脫脂10 h后,3 000 r/min離心20 min,脫脂粉末于40℃下熱風(fēng)干燥。準(zhǔn)確稱取脫脂亞麻籽粉3 g放入三角瓶中,按一定的固液比加入60%的乙醇溶液封口,設(shè)置一定的超聲功率、超聲溫度和超聲時(shí)間,每隔5 min震蕩1次,使其超聲均勻。超聲結(jié)束后,抽濾,測(cè)定濾出醇提液體積。量取一定量的醇提液放入試管中,加入1 mol/L的NaOH,使醇提液中NaOH濃度調(diào)至0.25 mol/L,堿解2 h。堿解結(jié)束后加入1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.0。用0.45 μm醋酸纖維素膜微濾。采用正丁醇萃取,減壓濃縮,甲醇復(fù)溶移至容量瓶中,如1.2.1操作進(jìn)行測(cè)定。亞麻木酚素得率按下面公式計(jì)算。
1.2.3 單因素試驗(yàn)
分別考察原料顆粒度20、40、60、80、100 目;超聲功率300、350、400、450、500 W;液固比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1;超聲溫度30、35、40、45、50 ℃;超聲時(shí)間10、15、20、25、30 min 對(duì)亞麻木酚素得率的影響。從試驗(yàn)結(jié)果分析確定考察區(qū)間,以此作為中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案的基礎(chǔ)。
1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝
采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理和響應(yīng)面法優(yōu)化亞麻木酚素的提取工藝。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用顆粒度為60目的脫脂亞麻籽粉為原料,60%乙醇為提取溶劑,提取功率400 W,以得率為響應(yīng)值(Y),以液固比(X1)、超聲溫度(X2)和超聲時(shí)間(X3)分別為自變量,設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)。
表1 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)的因素與水平表
1.2.5 抗氧化能力測(cè)定
DPPH·自由基清除能力按郭雪峰等[12]方法測(cè)定,略有改動(dòng)。10 mL比色管中依次加入4.0 mL 51.3 mg/L DPPH·溶液和1.0 mL 95%乙醇,混勻反應(yīng)穩(wěn)定后,以95%乙醇液為參比,在518 nm處測(cè)吸光值,記為A0;同法依次加入95%的乙醇溶液4.0 mL和1.0 mL待測(cè)試樣溶液,測(cè)定吸光值,記為Ar;依次加入4.0 mL 51.3 mg/L DPPH·溶液和1.0 mL待測(cè)試液,測(cè)定吸光值,記為As。計(jì)算自由基清除率(Y)=[1-(As-Ar)/A0]×100%。清除率為50%時(shí)所需抗氧化劑的濃度即為半數(shù)抑制率IC50值(mg/L)。
過氧化氫(H2O2)清除能力按劉大川等[13]的方法測(cè)定。超氧陰離子自由基(O2-·)清除能力按郭雪峰等[14]的方法測(cè)定。
亞麻木酚素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.203 8X-0.009,相關(guān)系數(shù)R2為0.996 6,表明相關(guān)度高,可以用此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算木酚素的含量。
圖1 磷鉬酸顯色法測(cè)定亞麻木酚素的標(biāo)準(zhǔn)曲線
2.2.1 原料顆粒度的影響
以粉碎后分別過20、40、60、80、100 目篩的亞麻籽粉為原料,在液固比15∶1,超聲溫度40℃,超聲時(shí)間20 min條件下,以產(chǎn)物得率比較不同顆粒度原料的效果(見圖2)。試驗(yàn)結(jié)果表明,原料的顆粒度大小對(duì)得率的影響較大,隨著顆粒度的減小得率先增加后減小,在60目時(shí)達(dá)到最大值。這是因?yàn)殡S著篩子孔徑逐漸減小,雜質(zhì)逐漸被挑出,在后續(xù)工藝中能夠與有機(jī)溶劑充分混合,使提取率大大增加。但是在篩孔達(dá)到80目之后,部分亞麻籽粉也被篩孔阻隔,造成了試驗(yàn)材料的極大浪費(fèi)。綜合考慮試驗(yàn)成本,提取原料的顆粒度應(yīng)采用60目。
圖2 原料顆粒度對(duì)亞麻木酚素得率的影響
2.2.2 超聲功率的影響
以顆粒度為60目的亞麻籽粉為原料(下同),在液固比15∶1,超聲溫度40℃,超聲時(shí)間20 min條件下,分別以300、350、400、450、500 W 超聲功率進(jìn)行提?。ㄒ妶D3)。試驗(yàn)結(jié)果表明,在功率達(dá)到400 W之前,亞麻木酚素得率隨超聲功率的增大而增大,當(dāng)超過400 W后亞麻木酚素得率逐漸下降,說明功率過大會(huì)破壞亞麻木酚素而使得率下降。綜合考慮試驗(yàn)需求,選擇400 W對(duì)亞麻木酚素進(jìn)行提取。
圖3 超聲功率對(duì)亞麻木酚素得率的影響
2.2.3 液固比的影響
超聲溫度40℃,超聲時(shí)間20 min,超聲功率400 W的條件下,液固比對(duì)亞麻木酚素得率的影響見圖4。隨著液固比的增大,提取物得率在15∶1和20∶1時(shí)達(dá)到最大值,繼續(xù)增大液固比,得率反而有所下降,這是因?yàn)楫?dāng)溶劑過量會(huì)造成超聲作用不完全,不能將所有的細(xì)胞壁震破,而導(dǎo)致木酚素得率偏低,綜合考慮生產(chǎn)成本,選擇15∶1為響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)的中心水平因素。
圖4 液固比對(duì)亞麻木酚素得率的影響
2.2.4 提取溫度的影響
在超聲功率400 W,液固比15∶1,提取時(shí)間20 min的條件下,超聲溫度對(duì)亞麻木酚素得率的影響見圖5。結(jié)果表明,隨著超聲溫度的增加,得率先增加后減小,在40℃達(dá)到最大值,45℃后亞麻木酚素得率趨于平緩,逐漸下降。原因是溫度過高,亞麻籽粉中活性成分被破壞,而且雜質(zhì)的溶出量會(huì)增加,所以木酚素得率會(huì)下降。因此超聲溫度的考查水平值定為40℃。
圖5 提取溫度對(duì)亞麻木酚素得率的影響
2.2.5 超聲時(shí)間的影響
在超聲功率400 W,液固比15∶1,提取溫度40℃條件下,考察超聲時(shí)間對(duì)亞麻木酚素得率的影響(見圖6)。由圖6可知,超聲15 min時(shí)木酚素得率最高為6.9 mg/g。15 min后略有下降,可能是因?yàn)殡S超聲處理時(shí)間延長(zhǎng),會(huì)有少量亞麻膠溶出,使得系統(tǒng)中黏度增加,阻礙木酚素溶出,而導(dǎo)致其得率下降。綜合考慮考察指標(biāo)和試驗(yàn)需求,超聲時(shí)間考查水平值定為15 min。
圖6 提取時(shí)間對(duì)亞麻木酚素得率的影響
2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,確定以顆粒度為60目的亞麻籽粉為原料,超聲功率400 W條件下,分別以液固比、超聲溫度和超聲時(shí)間為考察因素,以木酚素得率為試驗(yàn)指標(biāo),根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。
表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
2.3.2 方差分析及二次回歸模型的擬合
通過Design-Expert 8.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,方差分析如表3所示。在一次項(xiàng)中,液固比X1對(duì)提取物得率的影響達(dá)到極顯著水平(P <0.01),在二次項(xiàng)中,液固比X21、超聲溫度X22和超聲時(shí)間X23均達(dá)到了極顯著水平(P<0.01),這表明3個(gè)因素與亞麻木酚素的得率有直接關(guān)系,是主要的限制因子,其較小的變化可引起得率相當(dāng)大的改變。由于各因素對(duì)亞麻木酚素得率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,為了更明確各因子對(duì)其的影響,因此采用軟件對(duì)木酚素的得率進(jìn)行二次回歸模型擬合,回歸方程如下:
方程的顯著性分析得F=9.485 319,相應(yīng)的概率值P<0.01,表明該方程模型極顯著,不同處理間的差異高度顯著。失擬項(xiàng)值為0.487 7沒有達(dá)到顯著水平,表明非試驗(yàn)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不大,說明該模型適合亞麻木酚素提取條件的篩選。
表3 回歸模型的方差分析
2.3.3 提取工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化
響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值Y對(duì)應(yīng)于試驗(yàn)因素X1、X2、X3所構(gòu)成的三維空間的曲面圖,其可以直觀的反映各因素及它們之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。由圖7可以看出,亞麻木酚素得率同液固比與超聲溫度具有明顯的二次拋物線關(guān)系,并且二者有明顯的交互作用,在超聲溫度較低時(shí),得率隨液固比的增加而提高,隨著溫度的升高,增加幅度減小甚至下降,表明在不同溫度下,液固比對(duì)得率的影響也不同;圖8顯示液固比與超聲時(shí)間具有明顯的交互作用,得率隨超聲時(shí)間的增加先增加后減??;圖9顯示在較小的超聲溫度下,得率隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增大,在較大超聲溫度下,得率隨時(shí)間的增加而減小。
圖7 液固比和超聲溫度對(duì)亞麻木酚素得率的影響
圖8 液固比和超聲時(shí)間對(duì)亞麻木酚素得率的影響
圖9 超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)亞麻木酚素得率的影響
2.3.4 最佳工藝條件的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)
由響應(yīng)面圖可知,當(dāng)其中兩個(gè)變量取最佳值,響應(yīng)面的最高點(diǎn)在另一項(xiàng)的設(shè)計(jì)取值范圍內(nèi),說明響應(yīng)面各變量設(shè)計(jì)良好,可以求解響應(yīng)值最高點(diǎn)。用Design-Expert 8.0軟件中的Box-Benhnken模塊對(duì)試驗(yàn)?zāi)P瓦M(jìn)行典型性分析,獲得最優(yōu)的提取工藝條件為:以顆粒度為60目的亞麻籽粉為原料,60%乙醇為提取溶劑,超聲功率400 W,液固比16.94∶1,超聲溫度40.44℃,超聲時(shí)間15.19 min,亞麻木酚素得率預(yù)測(cè)值為7.20%??紤]到實(shí)際操作的便利,確定亞麻木酚素的提取工藝條件為:液固比17∶1,超聲溫度40℃,超聲時(shí)間15 min。為了驗(yàn)證響應(yīng)面法的可行性,采用得到的最佳提取工藝進(jìn)行亞麻木酚素提取試驗(yàn),共進(jìn)行3次重復(fù),平均得率為(7.18±0.005)mg/g。結(jié)果表明,亞麻木酚素在優(yōu)化后的得率與最大得率的預(yù)測(cè)值很接近,預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有良好的擬合性,充分驗(yàn)證了所建模型的有效性,說明回歸方程能較真實(shí)地反映各因素對(duì)亞麻木酚素得率的影響。
表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果
2.4 亞麻木酚素抗氧化活性研究
IC50值常用來比較清除自由基能力的大小,IC50值越小,清除自由基的能力越強(qiáng),表明其抗氧化能力就越強(qiáng)。從表5可以看出,亞麻木酚素對(duì)DPPH·、過氧化氫和超氧陰離子均有良好的清除能力,清除率隨質(zhì)量濃度增加而變化,且清除能力大于VC,這可能與它的結(jié)構(gòu)中的酚羥基有關(guān)[15]。酚羥基易與自由基反應(yīng),形成大的共軛體系,使得自由基電子較為分散而比較穩(wěn)定,從而使SDG表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。
表5 亞麻木酚素抗氧化活性
3.1 采用Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理和響應(yīng)面法,建立了亞麻木酚素提取工藝優(yōu)化的數(shù)學(xué)回歸模型,Y =7.12 +0.38X1+0.18X2+0.056X3-0.21X1X2-0.037X1X3+0.012X2X3-0.46X21-0.602X2-0.57X23。方差分析表明,建立回歸模型的“P>F”值為0.003 6,小于0.01,表明該二次方程模型極顯著,可以較準(zhǔn)確地進(jìn)行亞麻木酚素得率的預(yù)測(cè)。
3.2 亞麻木酚素超聲波輔助提取最佳條件:以顆粒度為60目的亞麻籽粉為原料,60%乙醇為提取溶劑,超聲功率400 W,液固比17∶1,超聲溫度40℃,超聲時(shí)間15 min。在此條件下亞麻木酚素得率為7.18 mg/g,試驗(yàn)可為工業(yè)化提取亞麻木酚素提供一定的技術(shù)依據(jù)。
3.3 亞麻木酚素對(duì)DPPH、過氧化氫和超氧陰離子均有良好的清除能力,IC50值分別為145 mg/L、75 mg/L 和0.25 mg/L。
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Li Huizhen Li Na Zhang Zhijun Li Xiaojun Chen Tie
(School of Chemical Engineering and Environment,North University of China,Taiyuan 030051)
With flaxseeds as raw material,the ultrasonic - assistant extraction of lignan in flaxseeds was studied.Through single - factor experiments,the effects of particle size,ultrasonic frequency,liquid to solid ratio,ultrasonic temperature and time on the yield of lignan in flaxseeds were investigated.On the basis of single-factor experiments,a quadratic polynomial regression equation of the forecasting model was set up by using Box-Behnken core combination design and process optimization of ultrasonic extraction of lignan in flaxseeds,The study results showed that the optimal process conditions of ultrasonic - assistant extraction of lignan in flaxseeds were as follows:particle size 60 mesh of raw materials,extraction solvent 60%ethanol,ultrasonic power 400 W,liquid to solid 17∶1,ultrasonic temperature 40 ℃ and ultrasonic time 15 min,the yield of lignan in flaxseeds was 7.18 mg/g.The antioxidant activity study showed that abilities of lignan in flaxseeds to scavenge DPPH and hydrogen peroxide and superoxide anion were good and IC50were 145 mg/L、75 mg/L and 0.25 mg/L respectively.
flaxseed,lignan,ultrasonic,response surface methodology,antioxidant activities
S565.9
A
1003-0174(2016)08-0062-07
山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(2013-080);山西省國(guó)際科技合作項(xiàng)目(2013081004)
2014-12-10
李會(huì)珍,女,1974年出生,副教授,植物提取與產(chǎn)品開發(fā)
張志軍,男,1973年出生,教授,植物資源開發(fā)與利用