鄰苯二甲酸二丁酯與胰蛋白酶的相互作用*

張國(guó)文，王亞萍

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

摘要：在模擬人體生理?xiàng)l件下(pH值為7.4)，應(yīng)用熒光光譜法、紫外光譜法和圓二色譜法(CD)并結(jié)合原子力顯微鏡(AFM)和分子模擬技術(shù)，研究了鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)對(duì)胰蛋白酶(Trypsin)的光譜性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及催化活性的影響.結(jié)果表明，DBP通過(guò)氫鍵和范德華力與胰蛋白酶形成基態(tài)復(fù)合物而猝滅胰蛋白酶的內(nèi)源熒光，DBP在胰蛋白酶上只有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn).同步熒光、紫外和CD光譜研究發(fā)現(xiàn)，DBP與胰蛋白酶的結(jié)合誘導(dǎo)了酶的α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量的減少，而增加了無(wú)規(guī)卷曲的含量.原子力顯微鏡圖像顯示，DBP的存在引起胰蛋白酶的表面形態(tài)發(fā)生變化，蛋白質(zhì)發(fā)生了聚集.分子模擬結(jié)果表明，DBP結(jié)合于胰蛋白酶S1疏水空腔附近，與氨基酸His 57，Ser 195和Gly 193形成氫鍵.酶活測(cè)定結(jié)果顯示，DBP的存在導(dǎo)致胰蛋白酶活性被抑制.

關(guān)鍵詞：鄰苯二甲酸二丁酯；胰蛋白酶；結(jié)合特性；分子模擬

文章編號(hào)：1007-2985(2015)01-0046-06

中圖分類號(hào)：O657.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1007-2985.2015.01.011

收稿日期：*2014-07-12

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (21167013，31460422)；高等學(xué)校博士點(diǎn)

作者簡(jiǎn)介：張國(guó)文(1966—)，男，江西資溪人，南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事食品化學(xué)與生物分析化學(xué)研究.

鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phosphate，DBP)是一種環(huán)境中常見(jiàn)的鄰苯二甲酸酯類塑化劑，主要用作塑料增塑劑，同時(shí)可以作為潤(rùn)滑劑、膠粘劑和化妝品等的載體.研究表明，DBP具有生殖發(fā)育毒性，對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等具有損傷作用[3-4]且有一定的致癌性.近年來(lái)，已發(fā)生多起DBP在白酒中含量超標(biāo)事件，由DBP所引起的食品安全問(wèn)題也越來(lái)越受到人們的關(guān)注.胰蛋白酶(Trypsin)是人體胰臟中普遍存在的一種消化水解蛋白酶，它對(duì)精胺酸和賴氨酸肽鍵具有選擇性水解作用，在消化過(guò)程中起重要作用.塑化劑可通過(guò)環(huán)境、食物鏈等途徑進(jìn)入人體，一旦被人類接觸或食用，會(huì)對(duì)人體的消化系統(tǒng)產(chǎn)生影響，可能干擾胰蛋白酶的正常生理功能而影響人體消化功能.筆者應(yīng)用多種光譜學(xué)方法并結(jié)合原子力顯微鏡和分子模擬技術(shù)，在模擬人體生理?xiàng)l件下，研究了DBP與胰蛋白酶的結(jié)合性質(zhì)及其對(duì)胰蛋白酶結(jié)構(gòu)和活性的影響，該研究為從分子水平上認(rèn)識(shí)DBP在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、蓄積以及毒性機(jī)理提供有價(jià)值的信息.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

儀器：F-7000型熒光光度計(jì)(日本日立公司)，UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)，MOS 450 圓二色光譜儀(法國(guó)Bio-Logic公司)，MFP-3D-SA原子力顯微鏡(美國(guó)Veeco公司)，pHS-3C型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠).

試劑：胰蛋白酶購(gòu)自Sigma公司，用pH值7.4的Tris-HCl緩沖溶液配制成濃度為1.5×10-6mol/L的貯備液；DBP標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自阿拉丁試劑公司，用無(wú)水甲醇配置成濃度為1.0×10-2mol/L的貯備液；N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽(BAEE)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自阿拉丁試劑公司，用上述緩沖溶液配置成濃度為6.0×10-3mol/L的貯備液；其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熒光光譜和紫外光譜測(cè)定于3 mL濃度為1.5×10-6mol/L胰蛋白酶溶液中逐次加入一定體積的濃度為1.0×10-2mol/L的DBP溶液(5 μL/次)，混勻放置3 min，以280 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，激發(fā)/發(fā)射狹縫為2.5 nm進(jìn)行熒光光譜測(cè)定，并扣除相應(yīng)DBP的熒光光譜，內(nèi)濾效應(yīng)參照文獻(xiàn)予以校正.同時(shí)測(cè)定上述樣品在Δλ=15，60 nm時(shí)的同步熒光光譜.

1.2.2 酶活性測(cè)定準(zhǔn)確移取3 mL濃度為1.5×10-6mol/L的胰蛋白酶溶液至石英比色皿中，掃描其吸收光譜后，依次加入一定量的DBP溶液(5 μL/次)，混合均勻后放置3 min，掃描DBP-胰蛋白酶混合物在200～320 nm范圍的紫外吸收光譜，并測(cè)定相應(yīng)游離濃度的DBP的吸收光譜.

胰蛋白酶可催化N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽(BAEE)為N-苯甲酰-L-精氨酸(BA)，BA在253 nm處的紫外吸收遠(yuǎn)強(qiáng)于BAEE，通過(guò)定量測(cè)定加入胰蛋白酶前后253 nm處吸收峰值的變化可以檢測(cè)胰蛋白酶活性.利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的動(dòng)力學(xué)/時(shí)間軟件，在pH值7.4的Tris-HCl緩沖體系中，胰蛋白酶 (1.5×10-6mol/L)和不同濃度的DBP在37 ℃孵化3 h后(體系甲醇含量控制在體積分?jǐn)?shù)0.03%以內(nèi))，加入BAEE(7.0×10-4mol/L)，每隔20 s測(cè)定體系在253 nm處的吸光值，并通過(guò)相對(duì)活性(%)=(R/R0)×100%，計(jì)算不同濃度DBP存在時(shí)胰蛋白酶的相對(duì)活性，其中R0為不加抑制劑時(shí)吸光度變化的斜率，R為含有不同濃度DBP的體系中吸光度變化的斜率.

1.2.3 圓二色光譜(CD)測(cè)定在持續(xù)氮?dú)猸h(huán)境下，分別測(cè)定190～250 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)游離胰蛋白酶和DBP/trypsin物質(zhì)的量之比為2∶1和5∶1的DBP-胰蛋白酶混合物的CD光譜，并應(yīng)用在線SELCON3軟件計(jì)算與DBP結(jié)合前后胰蛋白酶各二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量(http://dichroweb.cryst.bbk.au.uk/html/home.shtml).

1.2.4 原子力顯微鏡成像配制一定濃度(1.5×10-9mol/L)的胰蛋白酶和物質(zhì)的量之比為10∶1的DBP-胰蛋白酶復(fù)合物(nDBP/n胰蛋白酶= 10∶1)，取5 μL滴于云母片上，室溫放置過(guò)夜，干燥后于原子力顯微鏡下用輕敲模式觀察樣品，掃描成像.

1.2.5 分子模擬利用Autodock4.2軟件結(jié)合Lamarckian Genetic Algorithm算法模擬DBP與胰蛋白酶的結(jié)合模式.胰蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，PDB編號(hào)為2ZQ1[10]，進(jìn)行分子對(duì)接前，對(duì)蛋白模型作除去水分子、加氫及加Gastriger電荷處理.配體DBP的3D結(jié)構(gòu)由Sybyl × 1.1 (USA)軟件畫出，利用MMFF94力場(chǎng)使能量最小化.

2結(jié)果與討論

2.1 DBP誘導(dǎo)胰蛋白酶熒光猝滅

圖1顯示25 ℃時(shí)DBP對(duì)胰蛋白酶熒光的猝滅.隨著溶液中DBP濃度的不斷增加，胰蛋白酶在347 nm處熒光發(fā)射峰強(qiáng)度有規(guī)律地降低，且峰位有輕微的紅移，表明DBP與胰蛋白酶發(fā)生了相互作用，引起胰蛋白酶氨基酸殘基微環(huán)境的改變[11].

熒光猝滅過(guò)程通常分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅，熒光猝滅數(shù)據(jù)可利用如下Stern-Volmer方程描述[12]：

其中：F0和F分別表示加入DBP前后胰蛋白酶的熒光強(qiáng)度；KSV為猝滅常數(shù)；Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)；τ0為熒光壽命，其值約為2.80 × 10-9s[13]；[Q]為猝滅劑DBP濃度.插圖為25，31，37 ℃ 3個(gè)溫度下DBP與胰蛋白酶相互作用的Stern-Volmer曲線，線性擬合得到的KSV值列于表1.結(jié)果顯示，KSV值的變化趨勢(shì)與溫度變化呈負(fù)相關(guān)，且3個(gè)不同溫度下的Kq值(1.81×1012，1.51×1012，1.28×1012L/(mol·s))均大于生物分子的最大擴(kuò)散速率常數(shù)2.0×1010L/(mol·s)[14]，表明DBP對(duì)胰蛋白酶熒光猝滅機(jī)理為形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅[15].

為了進(jìn)一步研究DBP與胰蛋白酶之間的結(jié)合特性、結(jié)合常數(shù)(K)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)，可由下列方程求得[16]：

其中：F0和F分別表示加入DBP前后胰蛋白酶的熒光強(qiáng)度；[Q]>t]和[p]t]分別代表猝滅劑DBP以及胰蛋白酶的總濃度.作log(F0-F)/F對(duì)log1/([Q]>t]-(F0-F)[p]t]/F0)的關(guān)系圖(圖2)，可以算得3個(gè)溫度下反應(yīng)體系的結(jié)合常數(shù)K值并列于表1.K值隨著溫度的升高而降低，說(shuō)明溫度升高會(huì)使復(fù)合物的穩(wěn)定性降低[17].n≈1，表明DBP與胰蛋白酶有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn).

2.2 熱力學(xué)參數(shù)與作用力

為了進(jìn)一步闡明二者的作用機(jī)理，利用熒光數(shù)據(jù)對(duì)體系的熱力學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析.疏水作用力、靜電引力、范德華力和氫鍵被認(rèn)為是小分子與生物大分子相互作用的主要驅(qū)動(dòng)力[18].根據(jù)體系的熱力學(xué)參數(shù)如焓變?chǔ)°、熵變?chǔ)°和自由能變?chǔ)°的值，可確定驅(qū)動(dòng)DBP與胰蛋白酶結(jié)合的主要作用力類型[19].當(dāng)溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)的焓變?chǔ)°可以看作常數(shù)，可由下列方程求得反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)：

其中K是對(duì)應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù)，R是氣體常數(shù)(8.314 (J/mol·K)).利用logK對(duì)1/T作圖，通過(guò)擬合后直線的斜率和截距可以分別計(jì)算出體系的ΔH°和ΔS°值，進(jìn)而計(jì)算得到ΔG°值.表1顯示，ΔG°<0，說(shuō)明DBP與胰蛋白酶的結(jié)合是一個(gè)自發(fā)過(guò)程，ΔS°<0，ΔH°<0，說(shuō)明氫鍵和范德華力是該結(jié)合反應(yīng)的主要驅(qū)動(dòng)力[20].

c trypsin=1.5×10 -6 mol/L;c DBP(10 -5 mol/L)，curves a→k:0,1.66, 3.32,4.98,6.62,8.26,9.90,11.53,13.16,14.78,16.39. 圖1　不同濃度DBP對(duì)胰蛋白酶熒光光譜的影響

圖2　DBP-胰蛋白酶體系的雙對(duì)數(shù)曲線

T/KKSV/(103L/mol)RaK/(103L/mol)nRbΔH°/(kJ/mol)ΔG°/(kJ/mol)ΔS°/((J/mol·K))2985.070.99834.941.110.9986-21.073044.230.99634.041.070.9944-23.48-21.02-8.093103.580.99183.431.010.9912-20.97

注：Ra為KSV的相關(guān)系數(shù)，Rb為結(jié)合常數(shù)K的相關(guān)系數(shù).

2.3 DBP對(duì)胰蛋白酶結(jié)構(gòu)的影響

圖3為胰蛋白酶在不同濃度DBP存在時(shí)酪氨酸(Δλ=15 nm)和色氨酸(Δλ=60 nm)的特征光譜.隨著DBP的加入，酪氨酸和色氨酸殘基的熒光峰強(qiáng)度逐漸降低.當(dāng)DBP濃度為1.639×10-4mol/L時(shí)，酪氨酸熒光峰從295 nm藍(lán)移至288 nm，色氨酸熒光峰由286 nm紅移至290 nm，表明DBP誘導(dǎo)酪氨酸殘基所處微環(huán)境疏水性增加，而色氨酸殘基微環(huán)境疏水性降低.

c trypsin=1.5×10 -6 mol/L;c DBP(10 -5 mol/L),curves a→k:0,1.66,3.32,4.98,6.62,8.26,9.90,11.53,13.16,14.78,16.39. 圖3　DBP對(duì)胰蛋白酶同步熒光光譜的影響

胰蛋白酶在205，279 nm處有強(qiáng)、弱2個(gè)特征紫外吸收峰(圖4)，其中205 nm處吸收峰是由蛋白質(zhì)肽鏈骨架的π-π*躍遷產(chǎn)生的，其峰強(qiáng)度、峰位變化與蛋白質(zhì)多肽鏈的變化有關(guān)[21].隨著DBP濃度的增加，205 nm處吸收峰的強(qiáng)度逐漸降低并伴隨有輕微的紅移，表明DBP誘導(dǎo)胰蛋白酶的構(gòu)象發(fā)生了一定的變化.

CD光譜技術(shù)是檢測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的一種有效手段.圖5為游離胰蛋白酶和不同物質(zhì)的量之比(nDBP/n胰蛋白酶)DBP-胰蛋白酶體系的CD光譜圖.胰蛋白酶在200 nm處負(fù)峰的強(qiáng)度隨溶液中DBP濃度的增加而逐漸降低，表明DBP引起胰蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化.在線SELCON3軟件計(jì)算獲得游離胰蛋白酶含α-螺旋13.8%、β-折疊43.8%、β-轉(zhuǎn)角20.6%、無(wú)規(guī)卷曲21.8%(表2)；當(dāng)DBP與胰蛋白酶的物質(zhì)的量之比分別為2∶1和5∶1時(shí)，α-螺旋的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別減少為10.2%和7.4%，β-折疊的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別減少為40.3%和40.1%，β-轉(zhuǎn)角的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別減少為15.7%和14.5%，而無(wú)規(guī)卷曲的質(zhì)量分?jǐn)?shù)則分別增加至33.8%和38.0%.

c trypsin=1.5×10 -6 mol/L;c DBP(10 -5 mol·L -1),curves a→i: 0,0.83,1.66,2.49,3.31,4.13,4.95,5.77,6.58;curve x:the absorption spectrum of DBP only,c DBP=0.83×10 -5 mol·L -1. 圖4 　同濃度DBP對(duì)胰蛋白酶紫外吸收光譜的影響

c trypsin=1.5×10 -5mol/L,and the molar ratios of DBP to trypsin were 0∶1 (a),2∶1 (b) and 5∶1 (c),respectively. 圖5　DBP與胰蛋白酶相互作用的圓二色譜圖

nDBP∶ntrypsinαHelix/%βSheet/%βTurn/%Randomcoil/%0∶113.843.820.621.82∶110.240.315.733.85∶17.440.114.538.0

2.4 DBP對(duì)胰蛋白酶表面形態(tài)的影響

原子力顯微鏡被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子在空氣或溶液中的形態(tài)觀察研究.圖6顯示游離胰蛋白酶以及DBP-胰蛋白酶混合物的原子力顯微鏡圖像.游離胰蛋白酶分子顆粒較小(圖6a)，計(jì)算得到平均高度為0.8 nm，平均直徑為5.0 nm.當(dāng)與一定濃度的DBP作用后，胰蛋白酶分子的直徑明顯增大(圖6b)，平均高度和平均直徑分別為2.24 nm和11.12 nm，說(shuō)明DBP的加入使得蛋白質(zhì)表面形態(tài)發(fā)生變化，改變了蛋白質(zhì)的微環(huán)境，可能導(dǎo)致胰蛋白酶分子更多地暴露在疏水環(huán)境中，引起蛋白質(zhì)分子的聚集[22].

c trypsin=1.5×10 -9 mol/L,and the molar ratio of DBP to trypsin was 10∶1. 圖6　胰蛋白酶(a)和DBP-胰蛋白酶復(fù)合物(b)的原子力顯微鏡圖

2.5 DBP對(duì)胰蛋白酶活性的影響

c trypsin=1.5×10 -6 mol/L;c BAEE=7.0×10 -4 mol/L. 圖7　DBP對(duì)胰蛋白酶的抑制作用

圖7顯示DBP對(duì)胰蛋白酶相對(duì)活性的影響.DBP對(duì)胰蛋白酶活性的抑制呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系，即隨著DBP濃度的逐漸增加，胰蛋白酶的活性呈現(xiàn)不斷降低的趨勢(shì).當(dāng)DBP的濃度為1.0 × 10-4mol/L時(shí)，胰蛋白酶活性降低為原水平的60.8%，表明DBP的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致酶部分失活，影響其生理功能.

2.6 DBP-胰蛋白酶結(jié)合模式分子模擬

圖8為DBP與胰蛋白酶進(jìn)行100次獨(dú)立的分子對(duì)接所得的能量分布簇狀圖(RMSD為0.2 nm).結(jié)果顯示，具有最低結(jié)合能(-4.81 kcal/mol)的結(jié)合構(gòu)象出現(xiàn)的數(shù)目最多(紅色柱狀表示)，故選取具有最低結(jié)合能的結(jié)合姿態(tài)進(jìn)行定位分析.圖9顯示DBP并未結(jié)合于由殘基189～195，214～220和225～228組成的S1疏水空腔(primary substrate-binding pocket)，而是結(jié)合于S1疏水空腔附近，即結(jié)合于催化三聯(lián)體(His 57，Asp 102和Ser 195)周圍[23]，這可能導(dǎo)致胰蛋白酶的催化活性被抑制.DBP分子中的氧原子分別與氨基酸His 57，Ser 195 和 Gly 193的氫原子形成氫鍵(鍵長(zhǎng)分別為0.218 7，0.175 1和0.214 6 nm)，說(shuō)明DBP與胰蛋白酶之間的結(jié)合存在氫鍵作用，這與熱力學(xué)分析結(jié)果一致.

圖8　分子模擬能量簇狀圖

圖9　DBP與胰蛋白酶的結(jié)合模式

3結(jié)論

DBP能夠與胰蛋白酶相互作用形成復(fù)合物并導(dǎo)致胰蛋白酶的熒光產(chǎn)生靜態(tài)猝滅，DBP與胰蛋白酶只有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，氫鍵和范德華力是DBP結(jié)合胰蛋白酶的主要作用力.DBP的存在使得胰蛋白酶表面形態(tài)發(fā)生改變，可能導(dǎo)致酶分子更多地暴露在疏水環(huán)境中，引起酶分子的聚集.DBP主要結(jié)合于胰蛋白酶S1疏水空腔附近，靠近催化三聯(lián)體(His 57，Asp 102和Ser 195)，與氨基酸His 57，Ser 195 和 Gly 193形成氫鍵，這種結(jié)合模式誘導(dǎo)胰蛋白酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，并導(dǎo)致酶活性降低.

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Interaction of Dibutyl Phosphate with Trypsin

ZHANG Guowen,WANG Yaping

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,Jiangxi China)

Abstract：The effects of plasticizer dibutyl phosphate (DBP) on the spectral properties,structure and catalytic activity of trypsin were investigated using fluorescence,UV-vis absorption and circular dichroism (CD) spectroscopy along with atomic force microscopy (AFM) and molecular simulation under simulative physiological conditions (pH 7.4).The result of fluorescence quenching indicated that a ground state complex was formed between DBP and trypsin through hydrogen bonds and Van Der Waals forces,resulting in the intrinsic fluorescence quenching of trypsin.There was a single class of binding sites on trypsin for DBP.Analysis of synchronous fluorescence,UV-vis absorption and CD spectra demonstrated that the addition of DBP led to the conformational alteration of trypsin,decreases in the α-helix,β-sheet and β-turn contents and an increase in the random coil content.The AFM topography image showed that the binding of DBP with trypsin caused the surface morphology change of trypsin and the protein aggregation.The molecular modeling results exhibited that the binding site of DBP on trypsin was adjacent to the S1 binding pocket,and three hydrogen bonds formed between the amino acid residues His 57,Ser 195 and Gly 193 of trypsin and the oxygen atom of DBP.The enzymatic activity assay indicated that the binding interaction led to the inhibition of the trypsin activity.

Key words：dibutyl phosphate;trypsin;binding characteristic;molecular modeling

(責(zé)任編輯向陽(yáng)潔)