研究報(bào)告

沙漠干熱環(huán)境下創(chuàng)傷失血性休克大鼠模型的建立

劉江偉，錢建輝，李瑞，許文娟，許永華，楊向新，楊帆

(蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院新疆特殊環(huán)境醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊市，新疆830000)

【摘要】目的建立一種沙漠干熱環(huán)境下創(chuàng)傷失血性休克大鼠模型。 方法90只雄性SD大鼠隨機(jī)分為常溫環(huán)境組、干熱環(huán)境I組、干熱環(huán)境II組3個(gè)實(shí)驗(yàn)組。麻醉后大鼠經(jīng)打擊及頸動(dòng)脈放血，造成創(chuàng)傷失血性休克，使大鼠MAP(平均動(dòng)脈壓)達(dá)到(35±5)mmHg水平，比較各組大鼠休克后3 h存活率，并對(duì)死亡大鼠及休克后3 h仍存活大鼠重要臟器取材進(jìn)行病理學(xué)檢查。 結(jié)果休克后3 h常溫環(huán)境組、干熱環(huán)境I組(在休克模型建立成功后10 min內(nèi)從沙漠干熱環(huán)境轉(zhuǎn)運(yùn)到常溫環(huán)境)、干熱環(huán)境Ⅱ組(休克模型建立成功后仍放置在沙漠干熱環(huán)境中)的存活率分別為90%、83.3%、0；干熱環(huán)境I組與常溫環(huán)境組存活率差異無(wú)顯著性(P>0.05)，常溫環(huán)境組和干熱環(huán)境I組存活率明顯高于干熱環(huán)境II組(P<0.01)；病理學(xué)檢查可見(jiàn)常溫環(huán)境組、干熱環(huán)境組I死亡大鼠和干熱環(huán)境組II大鼠心、肺、肝組織水腫、變性、白細(xì)胞浸潤(rùn)、出血較廣泛，細(xì)胞壞死較嚴(yán)重。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功建立了沙漠干熱環(huán)境下創(chuàng)傷失血性休克大鼠模型，同時(shí)提示沙漠干熱環(huán)境能明顯降低創(chuàng)傷失血性大鼠的存活率，傷后應(yīng)立即轉(zhuǎn)運(yùn)后送。

【關(guān)鍵詞】干熱環(huán)境；沙漠；創(chuàng)傷失血性休克；動(dòng)物模型；大鼠

[基金項(xiàng)目]軍隊(duì)臨床高新技術(shù)重大項(xiàng)目(編號(hào)：2010gxjs016)；全軍后勤科研計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2013CLZ13J004)。

[通訊作者]劉江偉(1970-)，男，博士后，教授，主任醫(yī)師，重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：特殊環(huán)境戰(zhàn)創(chuàng)傷研究。 E-mail: ljw273@sohu.com.

【中圖分類號(hào)】R33【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.008

Establishment of a rat model of traumatic hemorrhagic

shock in dry hot desert environment

LIU Jiang-wei, QIAN Jian-hui, LI Rui, XU Wen-juan, XU Yong-hua, YANG Xiang-xin, YANG Fan

(Key Laboratory of Special Environmental Medicine of Xinjiang, Urumqi General Hospital of

Lanzhou Military Region, Urumqi 830000, China)

Abstract【】ObjectiveTo establish a rat model of traumatic hemorrhagic shock in dry-hot desert environment. Methods Ninety male SD rats were randomly equally divided into three groups (n=30): the normal temperature environment traumatic hemorrhagic shock group (normal temperature group) (temperature 25℃, humidity 35%), dry-hot traumatic hemorrhagic shock group I (dry heat group I) and dry-hot traumatic hemorrhagic shock group Ⅱ(dry heat group II)(temperature 40℃, humidity 10%). The rats were anesthetized, fixed, and intravenous indwelling needles were inserted into the right carotid artery, vein and the right femoral artery so as to make bleeding, and at the same time, fracture of the left hindlimb femur was made from the dropped steel wheel. The wounds were quickly bounded after injury. The mean arterial pressure was kept at 35±5 mmHg. The rats of group I was transferred into normal environment. The rats of group II were kept in the dry-hot environment continuously. The 3h-survival rates were calculated, and all the rats were sacrificed at 3 hours after the traumatic injury. Heart, lung and liver tissue samples were taken for histopathological examination using HE staining. Results In the normal environment group, one rat died within less than 2 hours and 2 rats died within 2-3 hours after injury. In the dry-hot environment group I, 2 rats died within 1 hour and 3 rats died within 2-3 hours. In the dry-hot environment group II, 5 rats died within 1 hour and all the rest 27 rats died within 2.5 hours. The survival rates of the normal temperature group, dry-hot groups I and II were 90%, 83.3%, and 0, respectively. There were no significant difference between the normal temperature group and the dry hot group I (P>0.05), but significant difference between the normal temperature group and dry-hot group I and the dry-hot group II (P<0.01). The pathological observation showed that the heart, lung and liver of the dead rats of the normal temperature group, dry hot groups I and in the dry hot group II had more severe edema, degeneration, leukocyte infiltration, wide-spread hemorrhage, and cell necrosis. ConclusionsWe have successfully established a rat model of traumatic hemorrhagic shock in dry-hot desert environment. The results of this study indicate that the hot desert environment may seriously decrease the survival rate of traumatic hemorrhagic shock rats. It suggests that in dry-hot environment, the traumatic hemorrhagic shock patients should be transported to a normal temperature and humidity environment as soon as possible.

【Key words】Dry-hot environment; Traumatic hemorrhagic shock; Animal model; Rats; Survival

創(chuàng)傷失血性休克是由于機(jī)體受到創(chuàng)傷后，各重要臟器受損、大量出血，造成機(jī)體循環(huán)血量驟減，微循環(huán)灌注量下降及伴隨傷后劇烈疼痛、恐懼等各種綜合因素而形成的機(jī)體代償失調(diào)的綜合征。研究表明，50%的戰(zhàn)傷死亡是急性失血所致，約1/3的患者在收住入院前已經(jīng)死于失血性休克，其中高達(dá)50%死亡率發(fā)生在創(chuàng)傷后24 h以內(nèi)，20%的死亡率發(fā)生在2 h內(nèi)[1-2]。戈壁、沙漠地區(qū)夏季的氣候特點(diǎn)主要表現(xiàn)為氣溫高、干燥、晝夜溫差大[3]。夏季炎熱干燥的氣候增加了機(jī)體的熱應(yīng)激反應(yīng)，在機(jī)體受到創(chuàng)傷時(shí)更能誘發(fā)休克的發(fā)生，增加后續(xù)補(bǔ)液治療的難度和死亡率。目前國(guó)內(nèi)外少有沙漠干熱環(huán)境下創(chuàng)傷失血性休克的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬在沙漠干熱環(huán)境下建立一種創(chuàng)傷失血性休克模型，為此環(huán)境下創(chuàng)傷失血性休克的病理生理機(jī)制及救治研究奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和環(huán)境

選取90只健康的雄性SD大鼠，體質(zhì)量280～320 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK(新) 2011-004，使用合格證號(hào)：SYXK(新)2011-003。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成3組，每組30只，常溫環(huán)境組在常溫環(huán)境下(25℃、濕度35%)致傷，傷后10 min內(nèi)運(yùn)回動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室；干熱環(huán)境I組大鼠放置在模擬的沙漠干熱環(huán)境氣候模式下(40℃、濕度10%)，放置60 min后開(kāi)始造模，模型成功后10 min內(nèi)運(yùn)回常溫環(huán)境的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室；干熱環(huán)境II組造模方法同干熱環(huán)境I組，模型成功后仍將大鼠放置干熱環(huán)境中。模擬環(huán)境在“西北特殊環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙”(蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院研制)中進(jìn)行。

1.2儀器與設(shè)備

BL-420F生物機(jī)能監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(成都泰盟公司)、BI-2000電子計(jì)算機(jī)圖像分析儀(成都泰盟公司)、24G靜脈留置針。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1創(chuàng)傷失血性休克模型的建立:實(shí)驗(yàn)前將大鼠常規(guī)禁食、水6 h，干熱環(huán)境I組和干熱環(huán)境II組大鼠，放置在沙漠干熱模擬環(huán)境中(40℃、濕度10%)60 min，大鼠可以自由活動(dòng)，參照孫英剛等文獻(xiàn)建立創(chuàng)傷失血性休克模型[4]，應(yīng)用3%戊巴比妥進(jìn)行腹腔麻醉，在大鼠右側(cè)頸動(dòng)、靜脈和右側(cè)股動(dòng)脈插管放置靜脈留置針，將BL-420F生物機(jī)能監(jiān)測(cè)系統(tǒng)連接于右側(cè)頸動(dòng)脈插管處，進(jìn)行血壓等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的監(jiān)測(cè)；補(bǔ)液通道通過(guò)右側(cè)頸靜脈插管進(jìn)行；右側(cè)股動(dòng)脈插管用于放血。將肝素鈉生理鹽水(500 U/kg)預(yù)處理留置針并在針內(nèi)保留肝素鹽水，連接三通管以備血壓監(jiān)測(cè)和采血。將實(shí)驗(yàn)大鼠穩(wěn)定10 min后，將重達(dá)2 500 g鐵輪從30 cm高度落下?lián)糁写笫笞笙轮晒侵猩隙卧斐煞鬯樾怨钦郏?jiǎn)單包扎創(chuàng)傷肢體，經(jīng)右股動(dòng)脈留置針處放血使MAP維持在(35±5) mmHg，如果血壓不能維持則通過(guò)右頸靜脈補(bǔ)液通道輸注生理鹽水以維持MAP。模型建立控制在(25～30) min內(nèi)，將大鼠MAP達(dá)到(35±5) mmHg做為休克0 h時(shí)間點(diǎn)。建模成功后將干熱環(huán)境I組大鼠轉(zhuǎn)移到常溫環(huán)境中(25℃、濕度35%)，干熱環(huán)境II組大鼠建模與干熱環(huán)境I組相同，建模成功后仍放在人工艙的沙漠干熱環(huán)境中，常溫環(huán)境組創(chuàng)傷在常溫常濕環(huán)境中進(jìn)行。

1.3.2觀察指標(biāo)： 比較各組大鼠3 h存活率，將死亡的大鼠立即取材，對(duì)建模后3 h仍存活大鼠進(jìn)行麻醉后取出重要臟器，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。采用 Fisher’s確切概率法進(jìn)行存活率的比較，以α=0.05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2結(jié)果

2.1大鼠存活情況

常溫環(huán)境組休克后2 h內(nèi)有1只大鼠死亡，2～3 h時(shí)間內(nèi)死亡2只，干熱環(huán)境I組在休克后1 h內(nèi)有2只大鼠死亡，2～3 h時(shí)間內(nèi)有3只大鼠死亡，干熱環(huán)境II組在休克后1 h內(nèi)有5只大鼠死亡，休克后2.5 h內(nèi)30只大鼠全部死亡，三組大鼠休克3 h后存活率見(jiàn)表1。常溫環(huán)境組和干熱環(huán)境I組存活率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，常溫環(huán)境組和干熱環(huán)境I組存活率明顯高于干熱環(huán)境II組(P<0.01)。

表1　各組大鼠休克3 h后存活率

*P>0.05,與常溫環(huán)境組比較；**P<0.01, 與常溫環(huán)境組和干熱環(huán)境I組比較

Note.*P>0.05, compared with the normal temperature group;**P<0.01, compared with the normal temperature group and dry hot group II.

2.2重要臟器病理改變

肝臟：光鏡下可見(jiàn)常溫環(huán)境組大鼠肝組織基本正常，肝小葉、匯管區(qū)清晰，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，干熱環(huán)境I組大鼠肝組織肝小葉、匯管區(qū)結(jié)構(gòu)欠清晰，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝竇輕度擴(kuò)張充血，肝細(xì)胞輕度濁腫并伴點(diǎn)狀出血，干熱環(huán)境II組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)消失，肝細(xì)胞明顯濁腫呈顆粒樣變性，肝竇擴(kuò)張呈彌漫性出血，匯管區(qū)高度充血，膽管周圍中性粒細(xì)胞侵潤(rùn)，伴少量嗜酸性細(xì)胞，干熱環(huán)境II組明顯較常溫環(huán)境組和干熱環(huán)境I組病變重(圖1 A-C)。

肺臟：光鏡下可見(jiàn)常溫環(huán)境組大鼠肺組織沒(méi)有明顯病理性變化，與正常組織無(wú)明顯差異，干熱環(huán)境I組大鼠肺組織可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞在支氣管聚集，肺間質(zhì)散在巨噬細(xì)胞侵潤(rùn)，肺泡壁略增厚，上皮增生，毛細(xì)血管輕度擴(kuò)張充血，干熱環(huán)境II組與干熱環(huán)境I組大鼠肺組織均可見(jiàn)肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞的侵潤(rùn)，充血、水腫、肺泡間隔增寬等變化，但以干熱環(huán)境II尤為明顯，而且出現(xiàn)肺泡腔狹窄，肺泡壁血管高度充血、滲出性出血等變化(圖2 D-F)。

心臟：常溫環(huán)境組大鼠心肌肌束排列整齊，心肌細(xì)胞未見(jiàn)水腫，心肌肌間隙血管未見(jiàn)擴(kuò)張，偶見(jiàn)點(diǎn)狀出血，干熱環(huán)境I組大鼠心肌出現(xiàn)心肌間血管輕度擴(kuò)張充血、點(diǎn)狀出血，細(xì)胞核有散在輕度腫脹，干熱環(huán)境II組大鼠心肌肌間隙血管高度充血，細(xì)胞核腫脹明顯，偶見(jiàn)心肌嗜酸性變，病變明顯較常溫環(huán)境組和干熱組I病變重(圖3 G-I)(圖1～3見(jiàn)文后彩插7)。

3討論

創(chuàng)傷失血性休克會(huì)導(dǎo)致有效血容量明顯減少、血流灌流不足、微循環(huán)障礙，從而直接影響主要臟器如肝、肺、心臟等的功能，若無(wú)法及時(shí)得到有效救治，2 h內(nèi)的致死率為20%[2]。機(jī)體重要臟器的損傷和功能改變，必然導(dǎo)致機(jī)體對(duì)應(yīng)激調(diào)節(jié)功能的障礙，進(jìn)而引起多臟器功能不全，影響機(jī)體的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸。夏季炎熱干燥的氣候增加了機(jī)體的熱應(yīng)激反應(yīng)，在機(jī)體受到創(chuàng)傷時(shí)更能誘發(fā)休克的發(fā)生。

我們同時(shí)成功建立了沙漠干熱環(huán)境和常溫環(huán)境下的創(chuàng)傷失血性休克大鼠模型，在人工實(shí)驗(yàn)艙的模擬干熱環(huán)境(40℃、濕度10 %)中，讓大鼠自由活動(dòng)預(yù)熱60 min后，在人工實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)致傷并達(dá)到休克，干熱環(huán)境 I組休克后10 min及時(shí)轉(zhuǎn)移到到常溫環(huán)境中，模擬創(chuàng)傷后及時(shí)后送，該實(shí)驗(yàn)組在3 h的存活率可達(dá)83.3%，可用于沙漠干熱環(huán)境下創(chuàng)傷失血性休克的進(jìn)一步研究。干熱環(huán)境II組大鼠與干熱環(huán)境I組大鼠致傷環(huán)境相同，不同之處在于建模后繼續(xù)留在干熱環(huán)境中，模擬創(chuàng)傷休克后不能及時(shí)后送的場(chǎng)景，在休克后2.5 h內(nèi)全部死亡，提示在沙漠干熱環(huán)境下的創(chuàng)傷失血性休克的及時(shí)后送到常溫環(huán)境中顯得尤為重要。

本研究通過(guò)病理切片觀察發(fā)現(xiàn)常溫環(huán)境組大鼠肝臟、肺臟、心臟組織沒(méi)有明顯病理性變化，組織結(jié)構(gòu)基本正常。干熱環(huán)境Ⅰ組大鼠出現(xiàn)輕微組織病變，肝細(xì)胞輕度濁腫并伴點(diǎn)狀出血，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁略增厚，上皮增生，毛細(xì)血管輕度擴(kuò)張充血，心肌肌間血管輕度擴(kuò)張充血、點(diǎn)狀出血，細(xì)胞核有散在輕度腫脹，均屬可逆性組織變性。本實(shí)驗(yàn)干熱環(huán)境Ⅰ組和Ⅱ組在致傷前均在人工實(shí)驗(yàn)艙干熱環(huán)境(40℃、濕度10 %)模式下自由活動(dòng)60 min，相當(dāng)于給予了一次長(zhǎng)時(shí)間熱應(yīng)激處理，有研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)臒釕?yīng)激預(yù)處理可以誘導(dǎo)熱休克蛋白表達(dá)，可減輕有害因素對(duì)機(jī)體細(xì)胞的損傷作用[5]，這可能是干熱環(huán)境I組大鼠雖經(jīng)干熱刺激和創(chuàng)傷失血雙重作用，其存活率與常溫環(huán)境組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)的一個(gè)原因。干熱環(huán)境Ⅱ組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)消失，肝細(xì)胞明顯濁腫呈顆粒樣變性，匯管區(qū)高度充血，肺泡腔狹窄，肺泡壁血管高度充血、滲出性出血，心肌肌間隙血管高度充血，見(jiàn)心肌嗜酸性變，組織均呈現(xiàn)不可逆性改變，干熱環(huán)境II組明顯較常溫環(huán)境組和干熱環(huán)境I組病變重。提示在持續(xù)干熱刺激和創(chuàng)傷失血雙重作用下，多臟器出現(xiàn)嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，且創(chuàng)傷失血性休克傷員若不能得到及時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)，其重要臟器組織將會(huì)發(fā)生不可逆的病理變化。

本實(shí)驗(yàn)在全程麻醉下進(jìn)行創(chuàng)傷失血性休克的模型制作，在大鼠安靜的狀態(tài)下保證了插管和檢測(cè)的順利同時(shí)保證致傷點(diǎn)的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)采用的沙漠干熱環(huán)境下創(chuàng)傷失血性休克制作方法在人工艙預(yù)熱后，無(wú)1例因熱刺激和致傷過(guò)重死亡，因而此動(dòng)物模型具有成功率高和可重復(fù)性強(qiáng)的特點(diǎn)，可為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。另外需注意在不影響手術(shù)操作的情況下，麻醉要淺，盡量與臨床實(shí)際相似，肝素用量要控制到最小，以避免出血不止。

鑒于以往不少學(xué)者研究在應(yīng)激、創(chuàng)傷作用下機(jī)體的各臟器變化往往是幾天后的變化，最早也是在4～6 h[6]。我們也將繼續(xù)研究在沙漠干熱環(huán)境下創(chuàng)傷失血性休克早期，尤其是3 h內(nèi)的機(jī)體重要臟器組織及相關(guān)指標(biāo)在熱刺激、創(chuàng)傷、失血等綜合因素作用下的病理生理學(xué)機(jī)制，為沙漠干熱環(huán)境下創(chuàng)傷失血性休克的臨床救治奠定基礎(chǔ)。

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〔修回日期〕2014-12-10