研究報告

枸杞對小鼠輻射損傷后造血系統(tǒng)修復(fù)的促進(jìn)作用

石桂英， 白琳

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京100021)

【摘要】目的探討枸杞在小鼠輻射損傷后造血系統(tǒng)修復(fù)過程中的作用。方法小鼠隨機(jī)分為3組，正常對照組不做任何處理，喂飼正常飼料；另外2組，給予4.5 Gy照射后，喂飼正常飼料或添加枸杞的飼料，1個月后，處死小鼠，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析外周血、脾臟、胸腺及骨髓中各種血細(xì)胞。結(jié)果枸杞飼料組小鼠，外周血細(xì)胞總數(shù)及B細(xì)胞增多，骨髓細(xì)胞總數(shù)減少，骨髓前體B細(xì)胞及未成熟B細(xì)胞增多，造血干、祖細(xì)胞均顯著減少。結(jié)論枸杞促進(jìn)輻射損傷后造血干細(xì)胞動員及分化，加速造血系統(tǒng)的恢復(fù)。

【關(guān)鍵詞】枸杞 輻射損傷 流式細(xì)胞術(shù) 造血干祖細(xì)胞

[基金項目]國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)

[作者簡介]石桂英，女，主管技師，研究方向：衰老與再生。

[通訊作者]白琳，bailin49@163.com。

【中圖分類號】R33【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.010

Promoting effect ofLyciumchinenseMill on hematopoietic

reconstruction in mice after radiation injury

SHI Gui-ying，Bai Lin

(Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College,

Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health, Beijing 100021, China)

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of Lycium chinense Mill on hematopoietic reconstruction in mice after radiation injury. MethodFemale C57BL/6J mice were grouped to 3 groups at random: the control group, with normal food and no treatment, and the other 2 groups, treated with 4.5 Gy irradiation, with normal food or food added with Lycium chinense Mill. After 1 month, the mice were sacrificed and analyzed the peripheral blood, spleen, thymus and bone marrow cells by flow cytometer. Results In the mice fed with Lycium chinense Mill, the percentage of B cells was increased in the peripheral blood, the pre-B and immature B cells were increased, too, and the percentage of hematopoietic stem/progenitor cells was decreased. Conclusion Lycium chinense Mill can promote the mobilization and differentiation of hematopoietic stem/progenitor cells, and accelerate the hematopoietic reconstruction after irradiation injury.

【Key words】LyciumchinenseMill; Radiation injury; Flow cytometer; Hematopoietic stem/progenitor cells; Mice

枸杞是常用滋補(bǔ)性中藥，具有滋補(bǔ)和增強(qiáng)免疫功能的作用，廣泛用于抗衰老、抗腫瘤及抗心血管等疾病[1-4]。可以促進(jìn)骨髓細(xì)胞增殖，刺激造血系統(tǒng)，促進(jìn)白細(xì)胞增高。研究認(rèn)為，枸杞含有多糖、核黃素、煙酸等化學(xué)成分，具有較強(qiáng)的生理活性，如抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤、降血糖、降血脂等。本研究主要探討枸杞在小鼠輻射損傷后造血系統(tǒng)修復(fù)過程中的作用。造血干細(xì)胞在造血系統(tǒng)修復(fù)中起重要作用，是各種血細(xì)胞的來源，同時其自我更新能力維持造血干細(xì)胞的數(shù)量，以及造血系統(tǒng)的穩(wěn)定狀態(tài)[5-7]。本研究分析了造血系統(tǒng)各種細(xì)胞的變化以及造血干細(xì)胞的改變。

1材料和方法

1.1動物與設(shè)備

實驗所用動物為2月齡C57BL/6J雌性小鼠，共30只，購自北京華阜康生物科技有限公司。每組10只，小鼠飼養(yǎng)在SPF動物房內(nèi)，動物生產(chǎn)及使用許可證號：SCXK(京)2009-007、SYXK(京)2011-0022。主要實驗設(shè)備為美國BD公司Aria流式細(xì)胞儀。

1.2中藥喂養(yǎng)

將小鼠隨機(jī)分為正常對照組、4.5 Gy照射+正常飼料組、4.5 Gy 照射+枸杞飼料組。正常對照組小鼠，不進(jìn)行照射，同時喂飼正常小鼠SPF維持料；4.5 Gy照射+正常飼料組，給予小鼠總劑量4.5 Gy照射后，喂飼正常小鼠SPF維持料；4.5 Gy照射+枸杞飼料組，給予小鼠總劑量4.5 Gy照射后，喂飼加入枸杞的飼料。藥物劑量按成人與小鼠之間劑量換算系數(shù)計算，每只小鼠每天攝食量為3 g，小鼠攝入枸杞的劑量為100 mg/kgd。按上述換算所得數(shù)據(jù)，在常規(guī)小鼠飼料中加入相應(yīng)劑量的枸杞配制成枸杞飼料。

1.3流式分析

從小鼠眼眶靜脈叢取外周血100 μL，加紅細(xì)胞裂解液，充分混勻，室溫靜置5 min裂解紅細(xì)胞，離心后PBS緩沖液重懸備用。小鼠脫頸椎處死，取脾臟、胸腺及后肢骨，置于冰上預(yù)冷的PBS緩沖液中。用磨砂玻片將脾臟、胸腺分別研磨成細(xì)胞懸液；后肢骨用研缽壓碎，加6 mL PBS緩沖液反復(fù)吹打，制成細(xì)胞懸液。將上述細(xì)胞懸液用300目尼龍膜過濾后收集到15 mL離心管中，取10 μL細(xì)胞懸液，用PBS緩沖液稀釋10倍后計數(shù)。細(xì)胞懸液離心，1000 rpm，10 min，用PBS緩沖液重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108個細(xì)胞/mL。取106細(xì)胞標(biāo)記熒光抗體(eBioscience公司)。

造血干細(xì)胞標(biāo)記抗體為：B220-biotin、CD4-biotin、CD8-biotin、Mac-1-biotin、Gr-1-biotin、Ter-119-biotin、Mac-1-biotin、IL-7R-biotin、CD34-FITC、CD16/32- Pcrcp-cy5.5、Flt3-PE、Sca1- E-Cy7、cKit-APC、biotin-APC-Cy7。造血干細(xì)胞(LSK)表面標(biāo)記為：lin- sca1+c-kit+，CD34-Flt3-Lin- Sca1+c-Kit+標(biāo)記長期造血干細(xì)胞(LT-HSC)， CD34+Flt3-Lin- Sca1+c-Kit+標(biāo)記短期造血干細(xì)胞(ST-HSC)，CD34+Flt3+Lin- Sca1+c-Kit+標(biāo)記多潛能祖細(xì)胞(MPP)，Lin- Sca1-c-Kit+標(biāo)記髓系祖細(xì)胞(MP)，CD34+CD16/32lowLin-Sca1-c-Kit+標(biāo)記共同髓系祖細(xì)胞(CMP)， CD34+CD16/32highLin-Sca1-c-Kit+標(biāo)記粒單系祖細(xì)胞(GMP)，CD34-CD16/32lowLin-Sca1-c-Kit+標(biāo)記巨核單系祖細(xì)胞(MEP)。骨髓B淋巴細(xì)胞標(biāo)記的抗體有：B220-PE-Cy7、CD43-PE、IgD-FITC、IgM-APC，根據(jù)表面標(biāo)記不同，B淋巴細(xì)胞可分為不同的發(fā)育階段。CD4-FITC、CD8- Pcrcp-cy5.5、B220-PE-Cy7、CD11B- APC-Cy7標(biāo)記骨髓、脾臟、外周血中的T、B淋巴細(xì)胞及髓系細(xì)胞。胸腺細(xì)胞用CD4-FITC、CD8- Pcrcp-cy5.5標(biāo)記。分別配制上述抗體混合液加入細(xì)胞懸液，冰上避光，30 min；加1 mL PBS緩沖液，離心，2600 rpm，5 min，棄上清液，加200 μL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，用300目尼龍膜過濾，冰上避光備用。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)均采用-x±s表示。組間資料分析采用t檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1枸杞對外周血細(xì)胞的影響

小鼠4.5 Gy照射后，喂飼正常飼料或枸杞飼料1個月后，取外周血計數(shù)，流式分析B細(xì)胞 (B220+)、粒細(xì)胞 (CD11b+)及T (CD4+/CD8+)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)照射后小鼠外周血細(xì)胞顯著減少，與正常飼料組相比，枸杞飼料組小鼠外周血細(xì)胞總數(shù)顯著增多(圖1A)，B細(xì)胞比例顯著升高(圖1B)?？梢?，枸杞促進(jìn)外周血細(xì)胞總數(shù)及B細(xì)胞恢復(fù)。

圖1　外周血計數(shù)及B、粒、T淋巴細(xì)胞的比例 Fig.1　Number of cells and percentage of B, myeloid, T cells in the peripheral blood

2.2枸杞對骨髓及脾臟血細(xì)胞的影響

同時，我們?nèi)⌒∈蟮墓撬韬推⑴K細(xì)胞，流式分析B、粒及T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)照射后B細(xì)胞比例無顯著變化，粒細(xì)胞比例升高，而T細(xì)胞比例下降，枸杞飼料組與正常飼料組無顯著差異(圖2)?？梢?，枸杞對骨髓、脾臟血細(xì)胞無顯著影響。

圖2　骨髓及脾臟中B、粒、T細(xì)胞比例 Fig.2　Percentage of B, myeloid, T cells in the bone marrow and spleen

2.3枸杞對骨髓前體B細(xì)胞的影響

B細(xì)胞是在骨髓中發(fā)育成熟的，枸杞飼料組小鼠外周血B細(xì)胞顯著高于正常飼料組，枸杞可能影響了骨髓中B細(xì)胞的發(fā)育，為此，我們分析了骨髓前體B細(xì)胞的發(fā)育。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，照射后骨髓前體B細(xì)胞及未成熟B細(xì)胞顯著增多，成熟B細(xì)胞顯著減少(圖3)。與正常飼料組相比，枸杞飼料組骨髓前體B細(xì)胞及未成熟B細(xì)胞顯著增多，成熟B細(xì)胞顯著減少。由此可見，枸杞促進(jìn)成熟B細(xì)胞進(jìn)入血液，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。

圖3　骨髓中不同發(fā)育階段B細(xì)胞比例 Fig.3　Percentage of different stage B cells in the bone marrow

2.4枸杞對胸腺細(xì)胞的影響

T細(xì)胞在胸腺中發(fā)育成熟。胸腺T細(xì)胞可以分為幾個階段，雙陰性細(xì)胞(CD4-CD8-)、雙陽性細(xì)胞(CD4+CD8+)、單陽性細(xì)胞(CD4+或CD8+)。分析發(fā)現(xiàn)，照射后胸腺單陽性細(xì)胞顯著減少，雙陰性細(xì)胞顯著增加，雙陽性細(xì)胞比例升高，但沒有顯著性(圖4)。與正常飼料組相比，枸杞飼料組CD4+細(xì)胞增多。這說明，枸杞可能促進(jìn)胸腺細(xì)胞發(fā)育為CD4+細(xì)胞。

圖4　胸腺中各種細(xì)胞的比例 Fig.4　Percentage of different cells in the thymus

2.5枸杞對造血祖細(xì)胞的影響

為了進(jìn)一步了解輻射損傷修復(fù)過程中枸杞的作用，我們分析了造血祖細(xì)胞的變化。結(jié)果表明，輻射損傷后淋系共同祖細(xì)胞增多，而髓系共同祖細(xì)胞沒有顯著變化，粒-單核祖細(xì)胞顯著減少。與正常飼料組相比，枸杞飼料組，淋系共同祖細(xì)胞減少，但沒有顯著性；髓系共同祖細(xì)胞明顯減少，粒-單核祖細(xì)胞及巨核-紅系祖細(xì)胞無顯著變化(圖5)。這說明，枸杞促進(jìn)髓系共同祖細(xì)胞的分化。

備注：CMP：髓系共同祖細(xì)胞，GMP：粒-單核祖細(xì)胞，MEP：巨核-紅系祖細(xì)胞 圖5　骨髓中造血祖細(xì)胞的比例 Note: CMP: Common myeloid progenitor cells; GMP: Granulocyte-macrophage progenitor cells; MEP: Megakaryocyte-erythrocyte progenitor cells. Fig.5　Percentage of hematopoietic progenitors in the bone marrow

備注：LSK：lin-sca1 +c-kit +造血干細(xì)胞，LT-HSC：長期造血干細(xì)胞，ST-HSC：短期造血干細(xì)胞，MPP：多潛能造血祖細(xì)胞 圖6　骨髓細(xì)胞數(shù)及造血干細(xì)胞的比例 Note. LSK: lin-sca1 +c-kit +: Hematopoietic stem cells; LT-HSC: Long term hematopoietic stem cells; ST-HSC: Short term hematopoietic stem cells; MPP: Multipotential progenitor cells. Fig.6　Percentage of hematopoietic stem cells in the bone marrow

2.6枸杞對造血干細(xì)胞的影響

為了確定半致死劑量輻射30天后小鼠骨髓細(xì)胞的變化，我們?nèi)⌒∈笠恢缓笾墓晒?、脛骨的骨髓?xì)胞進(jìn)行計數(shù)，發(fā)現(xiàn)此時小鼠骨髓細(xì)胞較正常野生型小鼠偏低，但差異無顯著性。與正常飼料組相比，枸杞飼料組細(xì)胞數(shù)顯著減少(圖6A)。對三組小鼠骨髓造血干細(xì)胞的分析結(jié)果顯示，輻射損傷后，小鼠造血干細(xì)胞(lin-sca1+c-kit+，LSK)減少，枸杞飼料組顯著低于對照及正常飼料組(圖6B)。骨髓中造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞的比例的降低，可能的原因包括：造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞自我更新能力降低，造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞分化能力增強(qiáng)，或者造血干細(xì)胞動員增加。外周血中造血干細(xì)胞的比例是否增加是衡量造血干細(xì)胞動員的關(guān)鍵指標(biāo)之一，為此，我們分析了各組外周血中的造血干細(xì)胞。結(jié)果顯示，

與對照組相比，輻射后正常飼料及枸杞飼料組外周血中造血干細(xì)胞比例顯著升高，枸杞飼料組又顯著高于正常飼料組(圖6B)，這說明輻射損傷動員造血干細(xì)胞，枸杞也促進(jìn)了骨髓造血干細(xì)胞的動員。同時，枸杞飼料組骨髓長期造血干細(xì)胞、短期造血干細(xì)胞及多潛能祖細(xì)胞均顯著減少(圖6C)，而淋系及髓系共同祖細(xì)胞顯著增多(圖5)，說明枸杞促進(jìn)造血干細(xì)胞的分化。

3討論

枸杞是常用滋補(bǔ)性中藥，具有滋補(bǔ)和增強(qiáng)免疫功能的作用，具有廣泛用途。枸杞多糖是枸杞中最主要的活性成分，具有促進(jìn)免疫、抗衰老等多種功能[1-4]。甜菜堿是枸杞中主要的生物堿之一，在脂質(zhì)代謝中有重要作用。枸杞色素是存在于枸杞漿果中的各類呈色物質(zhì)，是枸杞籽的重要生理活性成分，很多研究證明枸杞色素具有提高人體免疫功能、預(yù)防和抑制腫瘤及預(yù)防動脈粥樣硬化等作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，枸杞在輻射損傷后造血系統(tǒng)的修復(fù)中起重要作用。枸杞可以動員骨髓造血干細(xì)胞進(jìn)入外周血，同時促進(jìn)其分化為各系造血祖細(xì)胞，并促進(jìn)成熟B細(xì)胞進(jìn)入血液，加快輻射損傷后成熟血細(xì)胞水平的恢復(fù)，提高機(jī)體免疫功能。

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〔修回日期〕2014-11-04