■王琳琳 張雪嬌 周嘉倩 李俊杰 韓建榮

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院，河北滄州 061108；2.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原 030006）

蘆筍，為百合科天門冬屬多年生草本植物，又名石刁柏、龍須菜，在我國已有100多年的栽培歷史，現(xiàn)已在山西、河南、四川大面積種植[1]。每年過了采收季節(jié)后，蘆筍的地上莖仍繼續(xù)生長，一般莖可高達(dá)2 m左右，這部分莖稱為蘆筍老莖[2]。大量的蘆筍老莖無法利用，只能任其自然腐敗或直接焚燒，既污染了環(huán)境，又造成了資源的浪費(fèi)[3]。已有一些學(xué)者對蘆筍莖、葉進(jìn)行了營養(yǎng)成分分析，證明其營養(yǎng)成分極為豐富，且富含18種氨基酸，是值得開發(fā)的優(yōu)質(zhì)飼料資源[4]。

馬玉勝等[5]對蘆筍莖葉青貯飼料喂綿羔羊增重情況進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，試驗(yàn)組綿羔羊每只平均增重8.4 kg，對照組（喂青干草）每只平均增重6.6 kg，蘆筍莖葉青貯料較青干草飼喂效果更好。韓光亮等[6]對奶牛食用蘆筍莖葉青貯飼料后泌乳量進(jìn)行了研究，結(jié)果日糧中添加蘆筍莖葉青貯料的試驗(yàn)組日產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)奶20.54 kg，對照組（飼喂玉米秸稈青貯料）日產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)奶18.65 kg，提高10.13%。另外，利用微生物將秸稈轉(zhuǎn)化為反芻動物飼料不僅能使資源得到合理利用，而且還增加了飼料種類、節(jié)省了糧食，同時這種方法對環(huán)境污染較小。但是目前研究大都集中在玉米、小麥、水稻等秸稈的生物降解，蘆筍老莖做為反芻動物飼料的報道比較少見。

王琳琳等[7]通過單菌種固態(tài)發(fā)酵、復(fù)合菌種固態(tài)發(fā)酵以及不同比例的復(fù)合菌種固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，對能夠?qū)⑻J筍老莖轉(zhuǎn)化為反芻動物的微生物菌種進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明，蘆筍老莖經(jīng)配比為2∶2∶3的菌種組合青霉（Penicillium sp.）F-5、暗孢毛殼（Chaetomium atrosporum）F-21和曲霉（Aspergillus sp.）F-25發(fā)酵5 d后可溶性蛋白和粗蛋白含量分別提高了39.9%和38.5%，纖維素和木質(zhì)素含量分別降低了1.85%和18.37%。這表明經(jīng)發(fā)酵后，蘆筍老莖蛋白和粗蛋白含量顯著提高，木質(zhì)素含量顯著降低，同時纖維素含量得到了良好的保持，發(fā)酵產(chǎn)物的成分符合反芻動物的消化特點(diǎn)[8-9]，證明蘆筍老莖經(jīng)微生物發(fā)酵后能有效地轉(zhuǎn)化為反芻動物的飼料。但是可溶性蛋白和粗蛋白的提高率還不是很大，這可能與發(fā)酵培養(yǎng)基的成分和發(fā)酵條件的設(shè)置有關(guān)，有待進(jìn)一步優(yōu)化研究。

為了進(jìn)一步提高發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)的含量和降低木質(zhì)素的含量，本研究利用篩選出的菌種組合F-5、F-21和F-25對蘆筍老莖生料培養(yǎng)基進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，通過對發(fā)酵培養(yǎng)基中含水量、氮源及其含量、輔料及其含量等單因素的研究，并進(jìn)行了正交試驗(yàn)，以期得到最適的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，為提高蘆筍老莖利用效率提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

蘆筍老莖，當(dāng)年生，由山西阿林青谷農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)有限公司提供，自然風(fēng)干后粉碎備用。

葡萄皮渣，制作葡萄酒的廢棄物，由山西阿林青谷農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)有限公司提供，烘干粉碎后備用。

麩皮，購于太原市小店區(qū)附近農(nóng)貿(mào)市場。

菌糠，為盆栽姬松茸的菌糠，由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 菌種

青霉（Penicillium sp.）F-5、曲霉（Aspergillus sp.）F-25、暗孢毛殼（Chaetomium atrosporum）F-21，由山西大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院李日強(qiáng)副教授提供，以上菌種保存在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）斜面上。

1.3 培養(yǎng)

菌種保存及活化培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

液體種子培養(yǎng)基：參照李日強(qiáng)[10]稍作調(diào)整,配方為馬鈴薯200 g（加水煮沸過濾）、蔗糖20 g、蘆筍老莖粉10 g、水l 000 ml，自然pH值。將70 ml液體培養(yǎng)基分裝到250 ml三角瓶中，0.1 MPa滅菌20 min。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：由王琳琳等[3]研究可知，生料培養(yǎng)基作為固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)的培養(yǎng)基比較合適，即：蘆筍老莖90%、麩皮8%、(NH4)2SO42%、含水量65%，自然pH值。配好后，直接分裝到500 g的玻璃罐頭瓶中，每瓶分裝70 g培養(yǎng)基（濕重）。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化

將3株菌分別接種于PDA斜面上，28℃培養(yǎng)活化。

1.4.2 液體種子的制備

用生理鹽水將活化后斜面上的孢子洗下，并稀釋成107個/ml的孢子懸液。將孢子懸液5 ml接入裝有70 ml PDA液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃搖床培養(yǎng)3 d。

1.4.3 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)

1.4.3.1 含水量對發(fā)酵產(chǎn)物的影響

適合的含水量一方面使固態(tài)培養(yǎng)基顆粒間有一定的間隙，有利于空氣的進(jìn)入，增加傳氧量；另一方面也促進(jìn)了微生物新陳代謝產(chǎn)物的排出，保證新陳代謝的正常進(jìn)行[11-12]。因此，培養(yǎng)基的含水量需控制在適當(dāng)?shù)乃健?/p>

本試驗(yàn)將1.3節(jié)中固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量分別設(shè)置為60%、65%、70%、75%，其他條件不變。將復(fù)合菌種F-5、F-21和F-25(比例為2∶2∶3)以10%(v/w)的接種量進(jìn)行接種，于28℃下進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵5 d。以1.3節(jié)中不接菌的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，測定發(fā)酵產(chǎn)物中的可溶性蛋白、粗蛋白、纖維素和木質(zhì)素的含量，確定能顯著降低木質(zhì)素、較好保持纖維素含量，并能提高產(chǎn)物中粗蛋白和可溶性蛋白含量的最佳含水量。每個處理重復(fù)3次。

1.4.3.2 氮源對發(fā)酵產(chǎn)物的影響

不同氮源對微生物的生長有不同程度的促進(jìn)作用；氮源含量高低也會直接影響發(fā)酵過程，過高不僅會造成資源浪費(fèi)，還會抑制微生物的生長，過低會使得微生物難以得到充足的營養(yǎng)物質(zhì)[13]。

本試驗(yàn)將1.3節(jié)中固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源分別設(shè)置為2%尿素和2%(NH4)2SO4，其他條件不變。按照F-5、F-21和F-25比例為2∶2∶3以10%(v/w)的接種量進(jìn)行接種，于28℃下進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵5 d，以1.3節(jié)中不接菌的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，測定指標(biāo)及篩選方法同1.4.3.1節(jié)，確定出最佳氮源。

將篩選出的最佳氮源分別設(shè)置其含量為2%、4%、6%、8%，其他條件同1.3節(jié)中固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。按照F-5、F-21、F-25比例為2∶2∶3以10%(v/w)的接種量進(jìn)行接種，于28℃下進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵5 d，以1.3節(jié)中不接菌的固態(tài)培養(yǎng)基為對照，測定指標(biāo)及篩選方法同1.4.3.1節(jié)，確定出最佳氮源含量。

1.4.3.3 輔料對發(fā)酵產(chǎn)物的影響

在固態(tài)發(fā)酵中，添加一定量的輔料一方面可以補(bǔ)充蘆筍老莖在發(fā)酵過程中碳源的單一性，另一方面還可以增加基質(zhì)間的空隙，提高傳氧量，從而有利于發(fā)酵[14-15]。本試驗(yàn)選取麩皮、菌糠、葡萄皮渣作為固態(tài)發(fā)酵中的輔料，并改變主料與輔料的配比，確定最佳輔料與含量。

本試驗(yàn)將1.3節(jié)中固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中輔料分別設(shè)置為8%麩皮、8%菌糠、8%葡萄皮渣，其他條件不變。按照F-5、F-21、F-25比例為2∶2∶3以10%(v/w)的接種量進(jìn)行接種，于28℃下進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵5 d，以1.3節(jié)中不接菌的生料培養(yǎng)基為對照，測定指標(biāo)及篩選方法同1.4.3.1節(jié)，確定出最佳輔料。

利用篩選出的最佳輔料，改變主料與輔料的比例，分別設(shè)置主料∶輔料=90%∶8%、87%∶11%、84%∶14%、81%∶17%，其他條件不變。按照F-5、F-21、F-25比例為2∶2∶3以10%(v/w)的接種量進(jìn)行接種，于28℃下進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵5 d，以1.3節(jié)中不接菌的生料培養(yǎng)基為對照，測定指標(biāo)及篩選方法同1.4.3.1節(jié)，確定出最佳主料與輔料的比例。

1.4.4 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)

為了進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的參數(shù)，在以上單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇含水量、麩皮含量、(NH4)2SO4含量進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)（表1）。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素和水平

1.4.5 分析方法

可溶性蛋白的測定：采用考馬斯亮藍(lán)法測定[16]。

粗蛋白的測定：采用甲醛法測定[17]。

纖維素、木質(zhì)素的測定：參照王玉萬等（1987）的方法[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 含水量對發(fā)酵產(chǎn)物的影響

木質(zhì)素是秸稈細(xì)胞壁的主要成分，它和纖維素、半纖維素通過酯鍵緊密地鑲嵌在一起，形成堅固的酯鏈，包圍著纖維素，使酶不易與纖維素分子接觸，從而限制了瘤胃中細(xì)菌和真菌對纖維素和半纖維素的分解[19]。許多學(xué)者[20-21]表明，實(shí)現(xiàn)生物處理，提高秸稈飼用價值的理想菌株，必須能夠選擇性地降解木質(zhì)素又不致造成纖維素大量消耗，才能使秸稈提供盡可能多的可消化的碳水化合物，進(jìn)而提高秸稈的瘤胃消化率[3]。

表2 不同含水量對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分的影響

從表2可以看出，與對照組相比，四種不同含水量發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性蛋白含量均有所提高，當(dāng)含水量為65%時達(dá)到最高，為（4.84±0.37）mg/g，但含水量為60%、65%和70%的三組間差異不明顯；四組不同含水量發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量雖均顯著高于對照組，但在四組之間沒有顯著性差異，在含水量為75%時最高，為（10.76±0.33）%；與對照相比，四組不同處理發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素的含量沒有顯著差異，均較好地保存了纖維素的含量；在含水量為65%和75%時，發(fā)酵產(chǎn)物中木質(zhì)素的含量低于對照和其他兩組，含水量為65%時，木質(zhì)素含量最低，為10.50%。但含水量為65%時，可溶性蛋白顯著高于含水量為75%。綜上所述，選擇65%為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳含水量。

2.2 氮源及其含量對發(fā)酵產(chǎn)物的影響(見表3)

表3 不同氮源對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分的影響

由表3可以看出，不同的氮源對發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性蛋白含量和粗蛋白含量均沒有顯著差別；以尿素為氮源的處理中纖維素含量高于以(NH4)2SO4為氮源的處理，且有顯著差別，但木質(zhì)素含量同樣高于(NH4)2SO4為氮源的處理；以尿素為氮源的處理，在發(fā)酵過程中及未烘干之前有股比較濃的不愉快味道。綜上所述，選擇(NH4)2SO4為最佳氮源。

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，選擇(NH4)2SO4為最佳氮源，分別設(shè)置(NH4)2SO4含量為2%、4%、6%、8%然后測定發(fā)酵產(chǎn)物中的可溶性蛋白、粗蛋白、纖維素和木質(zhì)素的含量，結(jié)果見表4。

從表4可以看出，不同(NH4)2SO4含量發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性蛋白含量均顯著高于對照組，但這四組間差異性不顯著；在(NH4)2SO4含量為6%時粗蛋白含量最高，達(dá)到14.91%，與對照組相比顯著提高；對于發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素的含量而言，(NH4)2SO4的含量為2%時較好地保存了纖維素的含量，明顯高于其他三組，為（21.75±0.33）%，與對照相比沒有顯著性區(qū)別；(NH4)2SO4的含量為4%和6%時，發(fā)酵產(chǎn)物中木質(zhì)素的含量較對照組和其他組低，在(NH4)2SO4含量為4%時最低，為10.67%。(NH4)2SO4的含量為6%時發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素的含量明顯低于含量為4%組，且相差將近5個百分點(diǎn)；含量為4%時的發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量略低于含量為6%時，但僅為1.07個百分點(diǎn)，綜上所述及結(jié)合反芻動物的消化特點(diǎn)，選擇(NH4)2SO4含量為4%為最佳氮源含量。

表4 不同(NH4)2SO4含量對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分的影響

2.3 輔料及含量對發(fā)酵產(chǎn)物的影響（見表5）

從表5可以看出，以麩皮為輔料的發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性蛋白含量最高，與對照組相比提高41.69%，以菌糠為輔料的發(fā)酵產(chǎn)物中次之，但二者沒有顯著性差異；分別以麩皮、菌糠為輔料的發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量明顯高于對照組和以葡萄渣為輔料的發(fā)酵產(chǎn)物中的含量，且菌糠為輔料的發(fā)酵產(chǎn)物中含量最高，為（10.58±0.27）%；三種輔料的發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素的含量沒有明顯差別，且與對照相比相差不大；以麩皮為輔料的發(fā)酵產(chǎn)物中木質(zhì)素的含量最低，與對照相比降解率達(dá)到了14.11%。

表5 不同輔料對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分的影響

以葡萄皮渣為輔料的處理所得發(fā)酵產(chǎn)物中，可溶性蛋白和粗蛋白的含量明顯低于其他兩組；以麩皮和菌糠為輔料的處理所得發(fā)酵產(chǎn)物中各營養(yǎng)成分均沒有顯著差異，但是麩皮相對于菌糠來講來源上比較廣泛，綜上所述，選擇麩皮為最佳輔料。

在以麩皮為輔料的基礎(chǔ)上，改變發(fā)酵配方的主料與輔料的配比，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中主料與輔料的配比，結(jié)果見表6。

表6 不同主料與輔料比例固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分的影響

從表6可以看出，在主料∶輔料=81%∶17%的發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性蛋白含量最高，達(dá)到(4.92±0.19)mg/g，比對照提高了43.44%，主料∶輔料=84%∶14%的發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性蛋白含量最低，為(3.98±0.23)mg/g；在主料∶輔料=87%∶11%的發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量最高，與對照相比提高了53.65%，在主料∶輔料=90%∶8%、87%∶11%、84%∶14%時發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素含量與對照組相比沒有顯著性差異，降解不多；在主料∶輔料=87%∶11%、84%∶14%的發(fā)酵產(chǎn)物中木質(zhì)素的含量顯著低于對照組，且在主料∶輔料=87%∶11%時木質(zhì)素含量最低，降解率達(dá)21.94%。

在主料∶輔料=87%∶11%和84%∶14%兩組中木質(zhì)素、纖維素、可溶性蛋白的含量沒有顯著差異，但是主料∶輔料=87%∶11%的發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白的含量比主料∶輔料=84%∶14%中高，且有顯著的差異性，綜上所述，選取主料∶輔料=87%∶11%為最佳比例。

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果（見表7）

表7 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

從表7中可以看出，在所選的因素水平范圍內(nèi)，各因素對發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性蛋白含量的影響大小順序?yàn)镃＞A＞B，優(yōu)組合為A1B3C1；對粗蛋白含量的影響大小順序?yàn)镃＞A＞B，優(yōu)組合為A3B1C2；對纖維素含量的影響大小順序?yàn)锽＞C＞A，優(yōu)組合為A3B2C1；對木質(zhì)素含量影響大小順序?yàn)锽＞A＞C,優(yōu)組合為A1B1C2。

對于因素A，其對可溶性蛋白含量影響大小排第二位，此時取A1；其對粗蛋白含量的影響排第二位，此時取A3；對纖維素含量的影響排第三位，取A3；對木質(zhì)素含量的影響排第二位，取A1，因此A因素可取A1或A3。取A1時，可溶性蛋白含量比取A3時提高0.22%，粗蛋白含量降低5.39%，纖維素含量降低2.87%，木質(zhì)素含量降低9.05%。結(jié)合反芻動物的消化特點(diǎn)，因此A因素選擇A1。

對于因素B,其對可溶性蛋白含量影響大小排第三位，取B3，為次要因素；對粗蛋白含量的影響排三位，取B1，為次要因素；對纖維素的影響排第一位，取B2；對木質(zhì)素的影響排第一位，取B1，因此B因素可取B1或B2。取B1時，可溶性蛋白含量比取B2時降低0.46%，粗蛋白含量提高1.15%，纖維素含量降低1.38%，木質(zhì)素含量降低4.51%。綜上所述，B因素選擇B1。

對于因素C，其對可溶性蛋白含量影響大小排第一位，此時取C1；對粗蛋白含量影響大小排第一位，此時取C2；對纖維素含量影響大小排第二位，取C1；對木質(zhì)素含量影響大小排第三位，取C2，為次要因素。因此C因素可取C1或C2。取C1時，可溶性蛋白含量比取C2時升高14.04%，但粗蛋白降低了13.20%，纖維素升高4.61%，木質(zhì)素升高4.9%。取C1時雖然木質(zhì)素含量比取C2時稍高，但是節(jié)省了2%的(NH4)2SO4，降低了成本，更適應(yīng)于擴(kuò)大生產(chǎn)的要求。因此，C因素取C1。綜上所述，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)組合為A1B1C1，即：蘆筍老莖89%、麩皮9%、(NH4)2SO42%、含水量為62%，自然pH值。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)所用菌種是通過篩選而獲得的能有效將蘆筍老莖轉(zhuǎn)化反芻動物飼料的復(fù)合菌種。為了進(jìn)一步提高其發(fā)酵效率，通過改變培養(yǎng)基中各營養(yǎng)物質(zhì)的配比對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

在試驗(yàn)過程中選取了培養(yǎng)基中含水量65%為適宜含水量。在發(fā)酵過程中可以發(fā)現(xiàn)含水量60%時，培養(yǎng)基比較干燥，隱約可以看到?jīng)]有被浸濕的干料；含水量70%、75%時培養(yǎng)基較為濕潤，尤其是含水量75%時培養(yǎng)基明顯結(jié)塊，有水滴浸出，這可能是過多的水分導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)空隙較少，造成供氧不足造成的。

在氮源的選擇上(NH4)2SO4和尿素的效果對發(fā)酵產(chǎn)物中各營養(yǎng)成分沒有明顯差別，但是在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)以尿素為氮源的發(fā)酵過程中有濃烈的不愉快的味道，會影響飼料的適口性且考慮到降低生產(chǎn)成本而言，固選擇了(NH4)2SO4為適宜的氮源；選取(NH4)2SO4含量為4%時為較適宜的氮源含量，過低的氮源含量達(dá)不到菌種生長所需的營養(yǎng)要求，含量過高在發(fā)酵過程中所造成的較低的pH值環(huán)境可能會抑制微生物的生長從而影響了發(fā)酵效果。

在輔料的選擇上，麩皮與菌糠的效果沒有顯著差異，但本著節(jié)省成本和來源廣泛的原則選擇了麩皮作為輔料，主料∶輔料=87%∶11%為最佳比例，麩皮在一定程度上豐富碳源多樣化的同時也起到了疏松作用，增加了氧氣的通透率。

通過對單因素試驗(yàn)進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，對發(fā)酵產(chǎn)物中各營養(yǎng)成分進(jìn)行綜合分析后可得出固態(tài)發(fā)酵蘆筍老莖生產(chǎn)高蛋白反芻動物飼料的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基為：蘆筍老莖89%、麩皮9%、(NH4)2SO42%、含水量62%，自然pH值。