失血性休克后腸淋巴液引流恢復(fù)小鼠腎組織ACE/ACE2平衡的作用*

劉俊芬，蔣麗娜，張立民，劉桂青，趙自剛，劉圣君△，牛春雨△

(河北北方學(xué)院微循環(huán)研究所，河北 張家口 075029)

[摘要]目的： 觀察失血性休克后腸淋巴液(PHSML)引流對(duì)失血性休克小鼠腎組織血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)/ACE2平衡的作用。方法: 復(fù)制小鼠失血性休克模型，隨機(jī)分為休克組與休克+引流組，行液體復(fù)蘇；休克+引流組液體復(fù)蘇后，引流腸淋巴液。在液體復(fù)蘇后6 h，檢測(cè)腎組織ACE、ACE2、血管緊張素II(Ang II)1型受體(AT1R)、Mas相關(guān)G蛋白偶聯(lián)受體(MasR)的mRNA表達(dá)以及Ang II、Ang (1-7)含量。結(jié)果: 失血性休克提高了腎組織ACE mRNA、AT1R mRNA和Ang II水平，降低了ACE2 mRNA、MasR mRNA 和Ang(1-7)水平，PHSML引流抑制了失血性休克對(duì)ACE2和AT1R mRNA表達(dá)的影響；同時(shí)PHSML引流也降低了失血性休克增加ACE/ACE2、Ang II/Ang(1-7)和AT1R/MasR比值的作用。結(jié)論: PHSML引流恢復(fù)了失血性休克后腎組織的ACE/ACE2平衡，有利于減輕失血性休克所致的腎損傷。

[關(guān)鍵詞]失血性休克； 淋巴液； 引流術(shù)； 急性腎損傷； 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶

[中圖分類號(hào)]R364.1+4； R331.4[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.028

[文章編號(hào)]1000-4718(2015)11-2101-06

[收稿日期]2015-06-05[修回日期] 2015-09-01

[基金項(xiàng)目]*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81330007；No.81120108003);廣東省科技計(jì)劃國(guó)際合作項(xiàng)目(No.2014A050503047)

通訊作者△Tel： 020-83827812-51155； E-mail: yuxycn@aliyun.com

Role of post-hemorrhagic shock mesenteric lymph drainage in restoring balance of ACE/ACE2 in kidney of miceLIU Jun-fen, JIANG Li-na, ZHANG Li-min, LIU Gui-qing, ZHAO Zi-gang, LIU Sheng-jun, NIU Chun-yu

(InstituteofMicrocirculation,HebeiNorthUniversity,Zhangjiakou075029,China.E-mail:ncylxf@126.com；lyz19920206@sohu.com)

ABSTRACT[]AIM: To study the role of post-hemorrhagic shock mesenteric lymph (PHSML) drainage on the balance of angiotensin-converting enzyme (ACE) and ACE2 in the kidney. METHODS: A hemorrhagic shock model was established and then fluid resuscitation was performed to the animals in shock and shock+drainage groups, and the PHMSL was drained in shock+drainage group after fluid resuscitation. After 6 h of resuscitation, the mRNA expression of ACE, ACE2, angiotensin II (Ang II) type 1 receptor (AT1R) and Mas-related G-protein-coupled receptor (MasR), and the levels of Ang II and Ang (1-7) in the renal tissues were observed. RESULTS: Hemorrhagic shock increased the levels of ACE mRNA, AT1R mRNA and Ang II, and decreased the levels of ACE2 mRNA, MasR mRNA and Ang(1-7) in the kidney. PHSML drainage abolished the effect of hemorrhagic shock on ACE2 and AT1R mRNA expression. Meanwhile, PHSML drainage reduced the hemorrhagic shock-induced increases in the ratios of ACE/ACE2, Ang II/Ang(1-7) and AT1R/MasR. CONCLUSION: The PHSML drainage restores the balance of ACE/ACE2, which is beneficial to alleviate acute kidney injury following hemorrhagic shock in the mice.

[KEY WORDS]Hemorrhagic shock; Lymph fluid; Drainage; Acute kidney injury; Angiotensin-converting enzyme

重度失血性休克后急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)引起的內(nèi)環(huán)境紊亂與多器官衰竭(multiple organ failure，MOF)的發(fā)生和患者的死亡率相關(guān)[1]。證據(jù)表明，失血性休克后腸淋巴液(post-hemorrhagic shock mesenteric lymph，PHSML)回流與MOF有關(guān)[2]，結(jié)扎腸淋巴管可以減輕失血性休克后腎臟的功能障礙與氧化應(yīng)激程度[3]，但其詳細(xì)機(jī)制還需深入研究。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)是人體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[4]。研究表明，RAS的2條關(guān)鍵軸血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)-血管緊張素(angiotensin，Ang)II-Ang II 1型受體(Ang II 1 receptor，AT1R)、ACE2-Ang(1-7)-Mas相關(guān)G蛋白偶聯(lián)受體(Mas-related G-protein-coupled receptor，MasR)失衡參與了止血帶性休克再灌注后引起的AKI，即：止血帶性休克引起AKI的同時(shí)，ACE表達(dá)上調(diào)，ACE2表達(dá)下調(diào)；敲除ACE2基因的小鼠發(fā)生AKI的程度降低[5-6]。但在失血性休克后AKI的發(fā)生過(guò)程中，腎組織ACE和ACE2的平衡狀態(tài)如何？PHSML引流對(duì)腎組織ACE和ACE2的平衡有何作用？尚未見報(bào)道。為此，本研究觀察了PHSML引流對(duì)失血性休克小鼠腎組織RAS這2條關(guān)鍵軸的作用，為補(bǔ)充失血性休克引起AKI的腸淋巴機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)資料。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

24只雄性BALB/c小鼠(20～28 g)，購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(軍) 2011-004，經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)后用于本實(shí)驗(yàn)。小鼠在實(shí)驗(yàn)前1 d禁食12 h，自由飲水；然后隨機(jī)均分為：正常對(duì)照(control)組、假手術(shù)(sham)組、休克(shock)組和休克+引流(shock+drainage)組。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物的處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)范。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1失血性休克小鼠模型的復(fù)制小鼠經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉(70 mg/kg)麻醉后，參照我室大鼠失血性休克模型的建立方法[7]，進(jìn)行了部分調(diào)整，建立失血性休克模型。具體過(guò)程為鈍性分離右側(cè)股動(dòng)脈，用自制玻璃針經(jīng)股動(dòng)脈注射肝素鈉(1 mL/kg，500 U/kg)用于全身抗凝，連接生物信號(hào)采集系統(tǒng)，用于連續(xù)監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈血壓(mean artery pressure，MAP)；鈍性分離左股側(cè)動(dòng)脈，然后連接1 mL注射器固定于程控式抽注機(jī)(New Era Pump Systems Inc.)，用于放血和輸液；腹部正中線做一個(gè)3 cm左右的切口，分離腸淋巴管及其伴行的腸系膜上動(dòng)脈，用于腸淋巴液引流或假引流；待所有手術(shù)完成、穩(wěn)定30 min后，經(jīng)左股動(dòng)脈、應(yīng)用抽注機(jī)勻速放血，10 min內(nèi)將MAP降至40 mmHg，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)推注機(jī)調(diào)整放血量維持MAP在40 mmHg水平；維持低血壓60 min后，將放出的全血與林格氏液按1∶1混勻，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的方法[8-10]，經(jīng)左側(cè)股動(dòng)脈輸液復(fù)蘇，30 min完成。休克組觀察至液體復(fù)蘇結(jié)束后6 h；休克+引流組在液體復(fù)蘇結(jié)束后，引流休克腸淋巴液至6 h；假手術(shù)組動(dòng)物僅進(jìn)行相同的手術(shù)操作，但不放血、不輸液，觀察至與休克小鼠相對(duì)應(yīng)的時(shí)間；正常對(duì)照組麻醉后直接取材。

2.2腎組織取樣在上述各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的相應(yīng)時(shí)間，在深麻醉狀態(tài)下，留取腎組織。其中，左腎直接冷凍于-75 ℃冰箱，用于組織勻漿制備、檢測(cè)Ang II和Ang(1-7)含量；右腎保存于RNA保護(hù)液中，冷凍于-75 ℃冰箱，用于檢測(cè)ACE、ACE2、AT1R和MasR的mRNA表達(dá)。

2.3實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)取右腎組織，按TRIzol試劑(碧云天生物技術(shù)研究所)操作說(shuō)明提取腎組織總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度，A260/A280在1.8～2.0范圍為合格；按照FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司)操作說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA；取1 μg cDNA作為反應(yīng)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件均為95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min。PCR引物(上海生物工程股份有限公司合成)序列、產(chǎn)生長(zhǎng)度及循環(huán)次數(shù)見表1；GAPDH作為內(nèi)參照。

表1　引物序列

2.4酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)取冷凍保存的左腎組織，分析天平稱重后，按1∶9比例，加入4 ℃的生理鹽水，應(yīng)用玻璃研磨器研碎；3 000 r/min、4 ℃離心20 min，留取上清，制備10%組織勻漿。應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠腎組織Ang II和Ang (1-7) 水平(R&D)。腎組織勻漿蛋白定量采用BCA法(BCA試劑盒由碧云天生物技術(shù)研究所提供)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析。首先進(jìn)行齊性檢驗(yàn)，方差齊的數(shù)據(jù)各組間比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，方差不齊的數(shù)據(jù)采用Tamhame’s T2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1腸淋巴液引流對(duì)失血性休克小鼠腎組織ACE和ACE2 mRNA表達(dá)的作用

與正常對(duì)照組與假手術(shù)組相比，休克組與休克+引流組小鼠腎組織ACE的mRNA表達(dá)增高，ACE2的mRNA表達(dá)顯著降低，休克組小鼠腎組織ACE/ACE2比值顯著增高(P<0.05)；與休克組相比，休克+引流組小鼠腎組織ACE2的mRNA表達(dá)顯著增高，ACE/ACE2比值顯著降低(P<0.05)。此外，假手術(shù)組小鼠腎組織中ACE2的mRNA表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)，ACE的mRNA表達(dá)和ACE/ACE2比值與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

Figure 1.Effects of post-hemorrhagic shock mesenteric lymph drainage on the mRNA expression of angiotensin- converting enzyme (ACE) and ACE2, and the ratio of ACE/ACE2 in the kidney of the mice following hemorrhagic shock. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssham group;▲P<0.05vsshock group.

圖1腸淋巴液引流對(duì)失血性休克小鼠腎組織ACE和ACE2 mRNA表達(dá)以及ACE/ACE2比值的影響

2腸淋巴液引流對(duì)失血性休克小鼠腎組織Ang II和Ang(1-7)含量的作用

休克組小鼠腎組織Ang II含量和Ang II/Ang(1-7) 比值顯著高于正常對(duì)照組與假手術(shù)組，Ang (1-7)含量顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)，休克+引流組小鼠腎組織的上述指標(biāo)與正常對(duì)照組與假手術(shù)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與休克組相比，休克+引流組小鼠腎組織Ang II/Ang(1-7) 比值顯著降低(P<0.05)，Ang II與Ang(1-7)含量未見顯著差異；此外，正常對(duì)照組與假手術(shù)組小鼠腎組織的Ang II和Ang(1-7)含量以及Ang II/Ang(1-7) 比值均無(wú)顯著差異，見圖2。

Figure 2.Effects of post-hemorrhagic shock mesenteric lymph drainage on the levels of angiotensin II (Ang II) and Ang(1-7), and the ratio of Ang II/Ang(1-7) in the kidney of the mice following hemorrhagic shock. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssham group;▲P<0.05vsshock group.

圖2腸淋巴液引流對(duì)失血性休克小鼠腎組織Ang II和Ang(1-7) mRNA表達(dá)以及Ang II/Ang(1-7)比值的影響

3腸淋巴液引流對(duì)失血性休克小鼠腎組織AT1R和MasR mRNA表達(dá)的作用

與正常對(duì)照組與假手術(shù)組相比，休克組和休克+引流組小鼠腎組織AT1R mRNA表達(dá)顯著增高，MasR的mRNA表達(dá)顯著降低，ATR/MasR比值顯著增高(P<0.05)；與休克組相比，休克+引流組小鼠腎組織ATR的mRNA表達(dá)與AT1R/MasR比值顯著降低(P<0.05)，MasR的mRNA表達(dá)與休克組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；此外，正常對(duì)照組與假手術(shù)組小鼠腎組織的AT1R和MasR mRNA表達(dá)以及AT1R/MasR比值均無(wú)顯著差異(P>0.05)，見圖3。

Figure 3.Role of post-hemorrhagic shock mesenteric lymph drainage on the mRNA expressions of angiotensin II type 1 receptor (AT1R) and Mas-related G-protein-coupled receptor (MasR), and the ratio of AT1R/MasR in the kidney of the mice following hemorrhagic shock. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssham group;▲P<0.05vsshock group.

圖3腸淋巴液引流對(duì)失血性休克小鼠腎組織AT1R和MasR mRNA表達(dá)以及ATR/MasR比值的影響

討論

腎組織是RAS的2個(gè)關(guān)鍵酶ACE與ACE2存在的關(guān)鍵位置。最近文獻(xiàn)報(bào)道，ACE與ACE2失衡參與了多種應(yīng)激狀態(tài)下AKI的發(fā)生[11-12]。本研究在項(xiàng)目組前期發(fā)現(xiàn)腸淋巴管結(jié)扎或PHSML引流，均可顯著減輕失血性休克大鼠AKI的基礎(chǔ)上，建立了小鼠失血性休克模型，發(fā)現(xiàn)失血性休克上調(diào)了腎組織ACE-Ang II-AT1R軸表達(dá)，下調(diào)了ACE2-Ang(1-7)-MasR軸表達(dá)，引起了ACE/ACE2失衡；而這種負(fù)性作用部分則被PHSML引流抑制，從而使ACE/ACE2向平衡的方向發(fā)展。

ACE是RAS的核心酶，其作用產(chǎn)物Ang II是RAS發(fā)揮效應(yīng)的最重要組成部分；失血性休克后，受急性失血的影響，交感神經(jīng)興奮，RAS活化，Ang II分泌增多，通過(guò)AT1R，引起腹部器官以及骨骼肌血管收縮，導(dǎo)致血液重新分布，這對(duì)于恢復(fù)回心血量、保證心腦的血液灌注發(fā)揮了重要的作用。但是，長(zhǎng)期、持續(xù)的RAS系統(tǒng)活化、Ang II過(guò)度分泌和AT1R高表達(dá)，則會(huì)加重局部器官缺血從而出現(xiàn)缺血性壞死，也會(huì)引起心腦血管收縮導(dǎo)致缺血性損傷。因此，如何避免ACE-Ang II-AT1R軸的過(guò)度上調(diào)，對(duì)于防治休克具有積極的意義。為此，本研究首先觀察了PHSML引流對(duì)失血性休克小鼠腎組織ACE-Ang II-AT1R軸的作用。研究發(fā)現(xiàn)，休克引起了小鼠腎組織ACE、AT1R的mRNA表達(dá)與Ang II水平均顯著升高，而PHSML引流顯著降低了休克組小鼠腎組織的AT1R mRNA表達(dá)水平，對(duì)ACE mRNA表達(dá)以及Ang II水平也有降低的作用。這說(shuō)明過(guò)度活化的ACE-Ang II-AT1R與失血性休克后腎組織缺血及其帶來(lái)的AKI有關(guān)，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與止血帶休克、腎缺血再灌注后引起的AKI是相一致的[5-6, 11]；考慮到AT1R是Ang II發(fā)揮作用的關(guān)鍵受體，故可以認(rèn)為PHSML引流減輕AKI的作用是通過(guò)抑制ACE-Ang II-AT1R過(guò)度活化實(shí)現(xiàn)的，從PHSML引流降低ACE/ACE2、Ang II/Ang(1-7)和ATR/MasR比值的作用也能進(jìn)一步體現(xiàn)出來(lái)。已有的實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，PHSML中含有高濃度的毒素，經(jīng)腸淋巴途徑回流至全身后引起炎癥反應(yīng)與器官損傷[13]，結(jié)合內(nèi)毒素休克后大鼠腎組織ACE和AngⅡ表達(dá)增高的事實(shí)[14]，故推測(cè)PHSML引流降低腎組織ACE表達(dá)的機(jī)制可能與經(jīng)PHSML回流至全身的毒素減少引起對(duì)機(jī)體的不良刺激減輕有關(guān)，但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

ACE2是RAS的一個(gè)新成員，是ACE的同源物，但卻抑制ACE活性，具有與ACE相反的作用。ACE2通過(guò)催化Ang II轉(zhuǎn)化成Ang(1-7)、促進(jìn)Ang (1-7)與其受體MasR結(jié)合，從而發(fā)揮擴(kuò)張血管、減少細(xì)胞增殖等作用[15-17]，對(duì)于恢復(fù)腎組織的血液灌注具有重要作用[18]。為此，本研究觀察了PHSML引流對(duì)失血性休克小鼠腎組織ACE2-Ang(1-7)-MasR軸的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，失血性休克顯著降低了小鼠腎組織ACE2、MasR mRNA表達(dá)與Ang(1-7)含量，出現(xiàn)了與止血帶性休克后相似的變化[5-6]；說(shuō)明ACE2-Ang(1-7)-MasR軸受抑制參與了休克后AKI的發(fā)生；其機(jī)制可能為，通過(guò)降低Ang(1-7)含量，下調(diào)血管舒張功能，從而加重腎缺血，引起缺血性損傷。更為重要的是，本研究也發(fā)現(xiàn)，PHSML引流提高了休克小鼠腎組織ACE2表達(dá)以及Ang (1-7)含量，說(shuō)明PHSML引流減輕AKI的作用可能是通過(guò)增加ACE2-Ang(1-7)-MasR軸的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的，但這種作用的長(zhǎng)期效果如何，有待進(jìn)一步研究。

一般來(lái)說(shuō)，生理?xiàng)l件下，RAS的2條關(guān)鍵軸ACE-Ang II-AT1R和ACE2-Ang(1-7)-MasR是平衡的，二者的平衡決定了血管的舒縮狀態(tài)與血液的灌注狀態(tài)，從而影響預(yù)后[19-20]。為此，本研究中觀察了PHSML引流對(duì)小鼠腎組織ACE/ACE2、Ang II/Ang(1-7)和 AT1R/MasR比值的影響，以了解二者的平衡狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，休克組小鼠腎組織ACE/ACE2、Ang II/Ang(1-7)和ATR/MasR比值均顯著增加；PHSML引流顯著降低了這些比值，使之恢復(fù)或接近平衡狀態(tài)。尤其是，PHSML引流盡管只是出現(xiàn)了增加MasR表達(dá)的趨勢(shì)，卻使AT1R/MasR比值下調(diào)，更進(jìn)一步表明了失血性休克引起AKI的機(jī)制與ACE和ACE2軸失衡有關(guān)，減少PHSML回流有利于恢復(fù)二者平衡。同時(shí)，也應(yīng)該看到，PHSML引流組小鼠腎組織的ACE和AT1R mRNA表達(dá)仍高于、ACE2和MasR mRNA表達(dá)仍低于對(duì)照組和假手術(shù)組，說(shuō)明引起腎ACE-Ang II-AT1R上調(diào)、ACE2-Ang(1-7)-MasR下調(diào)的因素除了PHSML回流的作用外，還有其它因素參與。

此外，盡管在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，盡量減少了手術(shù)創(chuàng)傷對(duì)小鼠的影響，但在研究中也觀察到了一個(gè)現(xiàn)象，行假手術(shù)的小鼠腎組織ACE2 mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著降低，這可能是由于手術(shù)創(chuàng)傷引起的；也說(shuō)明ACE2可能較其它指標(biāo)更為敏感，這需要在將來(lái)進(jìn)一步探討。應(yīng)當(dāng)指出，本研究采用小鼠這一小型動(dòng)物作為觀察對(duì)象，故股部、腹部手術(shù)均在手術(shù)顯微鏡下操作；由于小鼠的股動(dòng)脈、股靜脈毗鄰很近，鈍性分離二者容易造成某一血管的破裂，因此本文的實(shí)驗(yàn)中并未實(shí)施將動(dòng)、靜脈鈍性分離手術(shù)，這也是本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)股動(dòng)脈進(jìn)行肝素注射抗凝和液體復(fù)蘇的原因。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)方法是參考了相關(guān)文獻(xiàn)[8-10]報(bào)道來(lái)實(shí)施的。應(yīng)當(dāng)指出，本文僅從mRNA水平觀察了腎組織ACE、ACE2、AT1R和MasR的變化，初步顯示了ACE與ACE2的平衡狀態(tài)；今后應(yīng)進(jìn)一步從蛋白水平上進(jìn)行相關(guān)的檢測(cè)分析，將更有利于分析失血性休克后腎組織ACE與ACE2的平衡情況以及PHSML引流的作用。

總之，失血性休克后腎組織ACE-Ang II-AT1R軸上調(diào)，ACE2-Ang(1-7)-MasR軸下調(diào)；PHSML引流調(diào)節(jié)了失血性休克小鼠腎組織ACE/ACE2的平衡。研究結(jié)果也提示，探討減少PHSML回流的治療措施，關(guān)注改善ACE/ACE2平衡的治療手段，有利于防治失血性休克后的AKI。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

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