網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014-12-4 13:45網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.008.html

◇論著◇

SIRT1在丙戊酸對(duì)肝細(xì)胞毒性中的作用研究

侯相瑜，金晶，李宏亮，柳睿，范曉梅，黃民

(中山大學(xué)藥學(xué)院藥物代謝與藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510006)

中國圖書分類號(hào)：R322.47；R329.2；R394.2；R971.6；R977.6

摘要：目的探討沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)在丙戊酸對(duì)肝臟HepG2細(xì)胞毒性中的作用。方法在HepG2細(xì)胞中，丙戊酸(2 mmol·L`(-1))孵育6、12、24、48 h，或丙戊酸(0.5、1、2 mmol·L`(-1))分別孵育48 h，通過Western blot方法檢測丙戊酸對(duì)SIRT1蛋白表達(dá)的影響；通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SIRT1表達(dá)質(zhì)粒和si-SIRT1，采用SRB方法，觀察對(duì)SIRT1基因進(jìn)行過表達(dá)和抑制后，丙戊酸對(duì)HepG2細(xì)胞毒性的改變情況。結(jié)果丙戊酸對(duì)SIRT1的表達(dá)有抑制作用，且具有時(shí)間和劑量依賴性。過表達(dá)SIRT1后，HepG2細(xì)胞對(duì)丙戊酸的毒性敏感性下降，轉(zhuǎn)染前后IC50分別為(4.025±0.47)、(10.87±1.50) mmol·L`(-1)；而干擾SIRT1后，HepG2細(xì)胞對(duì)丙戊酸的毒性敏感性增加，轉(zhuǎn)染前后IC50分別為(1.938±0.16)、(0.663±0.05) mmol·L`(-1)。結(jié)論丙戊酸可抑制SIRT1的蛋白表達(dá)，并且過表達(dá)SIRT1可拮抗丙戊酸對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用。

關(guān)鍵詞：丙戊酸;SIRT1;蛋白表達(dá);肝細(xì)胞毒性;HepG2;細(xì)胞生長

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.008

文章編號(hào)：

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A1001-1978(2015)01-0031-04

收稿日期:2014-09-25,修回日期:2014-11-12

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81102886)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(No B2012077)

作者簡介:侯相瑜(1989-)，男，碩士生，研究方向: 藥物代謝及藥物基因組學(xué),E-mail: houxiangyu1111@126.com;

通訊作者金晶(1980-)，女，博士，講師，研究方向: 臨床藥理學(xué)，，Tel: 020-39943034，E-mail: jinjing@mail.sysu.edu.cn; 黃民(1963-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:臨床藥理學(xué)與藥物基因組學(xué)，，Tel: 020-39943011，E-mail: huangmin@mail.sysu.edu.cn

Abstract:AimTo detect the role of sirtuin1 (SIRT1) in hepatotoxity caused by valproic acid (VPA). MethodsThe changes of SIRT1 expression of HepG2 cells were detected by Western blot. And then SIRT1 plasmid or siRNA was transfected to construct SIRT1 overexpressed or knocked-down HepG2 cells. Furthermore, SRB assays were taken to observe the changes of viability of these cells exposed to VPA. ResultsVPA suppressed SIRT1 expression in a time and dose-dependent manner. SIRT1 overexpression showed a protective effect to the cytotoxicity caused by

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1, SIRT1)是Ⅲ類組蛋白去乙?；窼irtuin家族的一個(gè)亞型，可以催化組蛋白和非組蛋白的賴氨酸殘基的乙?；牧呀鈁1]。研究表明[2-4]，SIRT1使靶蛋白去乙?；诳寡趸瘧?yīng)激、抗炎、抗凋亡，調(diào)節(jié)線粒體生物合成及代謝，重塑、學(xué)習(xí)、記憶等過程中發(fā)揮作用。

丙戊酸(valproic acid，VPA)作為一線抗癲癇藥物，是特發(fā)性全面性癲癇及癲癇全面性發(fā)作的首選用藥，也是部分性發(fā)作、繼發(fā)性發(fā)作及腦病性發(fā)作的次選用藥[5]。然而個(gè)體差異大、不良反應(yīng)多是困擾VPA臨床用藥的關(guān)鍵問題。它引起的不良反應(yīng)主要包括：肝毒性、體重增加、胃腸道不適、血液系統(tǒng)毒性、致畸等[6]。VPA主要通過增加抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)水平而起到抗癲癇的作用[6]。此外，有報(bào)道稱VPA可以抑制Sirt1，而導(dǎo)致小鼠胚胎發(fā)育畸形[7]。研究表明[8]，VPA可以通過影響ABCG1、CPT1A等轉(zhuǎn)運(yùn)體和TGF-β等轉(zhuǎn)錄因子抑制HepG2的生長，而這種抑制作用是否與SIRT1有關(guān)目前還不清楚。因此，本文在細(xì)胞水平觀察SIRT1在VPA對(duì)肝臟HepG2細(xì)胞毒性中的作用。

1材料與方法

1.1藥品和試劑VPA、煙酰胺購買自Sigma公司，SIRT1一抗、β-actin一抗、GAPDH一抗，羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗購買自CST公司，HepG2細(xì)胞株購買自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購買自Hyclone公司，Lipofectamine 2000購買自Invitrogen公司，SIRT1過表達(dá)質(zhì)粒購買自Addgene公司，siRNA購買自廣州銳博公司，Kiton Red S (SRB) 購買自阿法埃莎(天津)化學(xué)有限公司

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于FBS體積分?jǐn)?shù)為0.1的DMEM培養(yǎng)液中，放置于37°C、5% CO2、90%相對(duì)濕度培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞密度至70%，根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑的說明書轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-SIRT1、pcDNA 3.1空載質(zhì)粒或者siRNA進(jìn)入細(xì)胞中。

1.3藥物處理用培養(yǎng)基將VPA和煙酰胺稀釋成梯度濃度，待細(xì)胞密度至70%時(shí)給藥或在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24 h、siRNA轉(zhuǎn)染60 h后給藥，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

2結(jié)果

2.1VPA抑制SIRT1表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)間依賴性如Fig 1所示，隨著VPA(2 mmol·L-1)與肝HepG2細(xì)胞孵育的時(shí)間的延長，細(xì)胞內(nèi)SIRT1蛋白表達(dá)不斷下降，而在12、24、48 h明顯降低(P<0.05)。提示VPA可以抑制SIRT1表達(dá)，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。

2.2VPA抑制SIRT1表達(dá)呈現(xiàn)劑量依賴性不同劑量的VPA(0.5、1、2 mmol·L-1)和1 mmol·L-1陽性藥物煙酰胺(nicotinamide，NAM)與HepG2細(xì)胞孵育48 h。如Fig 2所示，與對(duì)照組相比，隨著VPA劑量的增加，SIRT1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)；2 mmol·L-1VPA比陽性藥物1 mmol·L-1煙酰胺的抑制效果更明顯。說明VPA可以抑制SIRT1表達(dá)，并呈現(xiàn)劑量依賴性。

2.3SIRT1高表達(dá)拮抗VPA引起的細(xì)胞毒性在HepG2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染SIRT1表達(dá)質(zhì)粒pcDNA 3.1-SIRT1及其空載質(zhì)粒pcDNA 3.1 24 h后，加入1 mmol·L-1的VPA孵育48 h。由Fig 3A可知，Western blot結(jié)果顯示，與正常組相比，SIRT1過表達(dá)組SIRT1含量上調(diào)，而且VPA對(duì)SIRT1過表達(dá)組細(xì)胞仍有抑制作用。然后在SIRT1正常組和過表達(dá)組中分別加入梯度濃度的VPA孵育48 h后檢測抑制率，IC50分別為(4.025±0.47)、(10.87±1.50) mmol·L-1(P<0.05)，說明SIRT1高表達(dá)可拮抗VPA對(duì)細(xì)胞的毒性作用(Fig 3B)。

Fig 1　Western blot analysis of SIRT1 expression in HepG2 incubated

*P<0.05,**P<0.01vs0 h

Fig 2　Western blot analysis of SIRT1 expression in

*P<0.05vscon

Fig 3Over expression of SIRT1 on VPA cytotoxity. (A) SIRT1 expression in HepG2 cells after transfected with SIRT1 plasmid and incubated with VPA. (B) The inhibitory effect of VPA on HepG2 cells and SIRT1 over-expressed HepG2 cells(n=3)

*P<0.05vsCon

2.4SIRT1 siRNA使細(xì)胞對(duì)VPA的毒性敏感性增加在HepG2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA及其對(duì)照si-con 24 h后，加入1 mmol·L-1的VPA孵育48 h。由Fig 4A可知，Western blot結(jié)果顯示，SIRT1 siRNA成功干擾SIRT1表達(dá)，且VPA進(jìn)一步抑制SIRT1低表達(dá)細(xì)胞中SIRT1表達(dá)。然后在SIRT1正常組和低表達(dá)組的細(xì)胞中加入梯度濃度的VPA孵育48 h后檢測抑制率，IC50分別為(1.938±0.16)，(0.663±0.05) mmol·L-1(P<0.05)，說明干擾SIRT1表達(dá)使HepG2細(xì)胞對(duì)VPA的毒性敏感性增加(Fig 4B)。

3討論

VPA是廣譜高效的抗癲癇藥物，然而限制其使用的一個(gè)重要缺陷就是它的肝毒性。研究表明[9-10]，VPA的代謝產(chǎn)物為2-丙基-4-戊烯酸(2-propyl-4-pentenoic acid，4-ene VPA)；VPA和4-ene VPA在線粒體基質(zhì)或胞質(zhì)中經(jīng)中鏈脂酰輔酶A合成酶活化為VPA-CoA和4-ene VPA-CoA，在胞質(zhì)中的復(fù)合物經(jīng)肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移進(jìn)入線粒體基質(zhì)，從而抑制線粒體β氧化，同時(shí)消耗大量輔酶A和肉毒堿，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積和空泡變性，是VPA導(dǎo)致肝毒性的主要原因。VPA也可以通過抑制Nrf2、誘導(dǎo)Keap1而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，造成細(xì)胞損傷[11]。

據(jù)報(bào)道，VPA的治療窗為40~100 mg·L-1(300~700 μmol·L-1)，而VPA的代謝存在較大的個(gè)體差異，血藥濃度范圍可以達(dá)到14.6~135 mg·L-1(100～1000 μmol·L-1)[12]。本課題的研究發(fā)現(xiàn)，VPA在1 mmol·L-1和2 mmol·L-1的劑量時(shí)會(huì)明顯抑制SIRT1的表達(dá)，而且這種抑制作用也呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，同時(shí)對(duì)肝HepG2細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們臨床上觀察到的VPA的肝毒性可能與抑制SIRT1蛋白表達(dá)有關(guān)。

Fig 4Knockdoun of SIRT1 on VPA cytoxity (A) SIRT1 expression in HepG2 cells after transfected with SIRT1 siRNA and incubated with VPA. (B) The inhibitory effect of VPA on HepG2 cells and SIRT1 knocked-down HepG2 cells(n=3)

*P<0.05vsSi-con

為驗(yàn)證SIRT1在VPA引發(fā)毒性中的作用，通過轉(zhuǎn)染SIRT1表達(dá)質(zhì)粒，觀察VPA對(duì)細(xì)胞生長的影響，結(jié)果顯示，SIRT1高表達(dá)的HepG2細(xì)胞中VPA的生長抑制作用減弱，提示SIRT1對(duì)VPA引發(fā)的肝細(xì)胞毒性中起到保護(hù)作用。然后通過轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA，構(gòu)建低表達(dá)SIRT1的HepG2細(xì)胞。結(jié)果顯示，VPA對(duì)SIRT1低表達(dá)細(xì)胞生長的抑制作用與正常表達(dá)細(xì)胞相比更明顯，提示SIRT1低表達(dá)使細(xì)胞對(duì)VPA的毒性敏感性增加。SIRT1可以通過使肝細(xì)胞中LXR、PGC-1α、PPARα、FOXO1等核受體和轉(zhuǎn)錄因子去乙?；l(fā)揮促進(jìn)脂肪酸氧化、抑制脂肪酸生成、調(diào)節(jié)膽固醇平衡、抗凋亡抗氧化應(yīng)激等作用，從而起到肝保護(hù)作用[2-3,13]。VPA抑制SIRT1后，這些核受體與轉(zhuǎn)錄因子的活性及其調(diào)控的下游有肝保護(hù)作用的基因表達(dá)是否發(fā)生改變，值得繼續(xù)深入研究。

綜上所述，本研究闡明了VPA可明顯下調(diào)SIRT1的蛋白表達(dá)水平，并引發(fā)細(xì)胞毒性。為使用SIRT1激動(dòng)劑預(yù)防或治療VPA引發(fā)肝毒性存在潛在可能提供理論依據(jù)。

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Valproic acid suppresses SIRT1 inducing hepatotoxicity

HOU Xiang-yu, JIN Jing, LI Hong-liang, LIU Rui, FAN Xiao-mei, HUANG Min

(LabofDrugMetabolismandPharmacokinetics,SchoolofPharmaceuticalSciences,

SunYat-senUniversity,Guangzhou510006,China)

VPA, and the IC50before and after transfection was (4.025±0.47) and (10.87±1.50) mmol·L-1respectively. Moreover, transfection of SIRT1 siRNA sensitized HepG2 cells to VPA, and the IC50before and after transfection was (1.938±0.16) and (0.663±0.05) mmol·L-1respectively. ConclusionVPA suppressed SIRT1 expression in HepG2 cells and overexpression of SIRT1 could reduce cytotoxicity induced by VPA.

Key words: valproic acid; sirtuin 1; protein expression; hepatotoxity; HepG2; cell viability

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