網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014-12-4 13:45網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.027.html

miR-139-5p低表達(dá)重組慢病毒的構(gòu)建及其在H9c2細(xì)胞的表達(dá)驗(yàn)證

姜嫄1,黃卓君2,強(qiáng)兆艷1,吳艷娜1

(天津醫(yī)科大學(xué)1.藥理學(xué)教研室，2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津300070)

中國圖書分類號(hào)：R-332；R322.11；R342.2；R373.9；R394.2；R542.2

摘要：目的構(gòu)建miR-139-5p低表達(dá)慢病毒載體，檢測(cè)其在H9c2細(xì)胞的表達(dá)效果。方法根據(jù)大鼠miR-139-5p序列，設(shè)計(jì)合成其靶點(diǎn)序列，并合成寡核苷酸雙鏈，克隆入慢病毒載體pGC-LV，與pHelper 1.0和pHelper 2.0共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝病毒。收取病毒上清液，純化后感染H9c2細(xì)胞。

熒光倒置顯微鏡下觀察感染效率，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)慢病毒感染后H9c2細(xì)胞中miR-139-5p的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果成功構(gòu)建miR-139-5p低表達(dá)慢病毒載體，病毒感染H9c2細(xì)胞的效率超過95%，miR-139-5p表達(dá)明顯減少。結(jié)論成功構(gòu)建了miR-139-5p低表達(dá)慢病毒載體，包裝的病毒可在H9c2細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)抑制miR-139-5p表達(dá)的效果。

關(guān)鍵詞：miR-139-5p；慢病毒載體；H9c2細(xì)胞；感染；qRT-PCR；低表達(dá)

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.027

文章編號(hào)：

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A1001-1978(2015)01-0127-04

收稿日期:2014-09-25,修回日期:2014-11-09

基金項(xiàng)目：國家自然基金項(xiàng)目(No 81102446)；天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 11JCYBJC14900);天津市高校國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目：201310062007

作者簡介：姜嫄(1990-)，女，碩士生，研究方向：心血管藥理學(xué)，E-mail:438001632@qq.com；

通訊作者吳艷娜(1974-)，女，博士，副教授，研究方向：心血管藥理學(xué),，Tel:022-83336835,E-mail:yanna_wu@126.com

Abstract:AimTo construct a lentiviral low expression of miR-139-5p vector and validate its expression efficiency in H9c2 cells. MethodTarget sequence was designed according to the sequence of rat miR-139-5p. Oligonucleotide duplex was synthesized and cloned into the lentiviral vector pGC-LV. The recombinant lentiviral vector, pHelper 1.0, and pHelper 2.0 were co-transfected into 293T cells, packaging virus. Then H9c2 cells were infected with the supernatant containing lentiviral particles, and its infection efficiency and miR-139-5p expression were determined by fluorescent microscope and real-time quantitative PCR, respectively. ResultsA lentiviral low expression of miR-139-5p vector was successfully constructed. The infection efficiency in H9c2 cells reached over 95%, and the relative expression of miR-139-5p was significantly down-regulated. ConclusionThe lentiviral low expression of miR-139-5p vector is successfully constructed, and the expression of miR-139-5p in infected H9c2 cells is inhibited effectively.

MicroRNAs (miR)是一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，通過結(jié)合靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)，介導(dǎo)靶基因mRNA降解，調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)[1]，進(jìn)而參與體內(nèi)各系統(tǒng)生理及病理過程。心血管研究表明，miR密切參與調(diào)節(jié)血管生成、心臟發(fā)育、心力衰竭、缺血/再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)損傷等病理生理過程，并可能是其中的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子[2]。本室前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-139-5p在經(jīng)歷肢體缺血預(yù)適應(yīng)(limb ischemic preconditioning,LIPC)和經(jīng)歷I/R損傷的大鼠心肌中的表達(dá)存在明顯差異，提示miR-139-5p可能在LIPC所提供的心臟保護(hù)中發(fā)揮關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用。為進(jìn)一步研究miR-139-5p的功能，本研究擬構(gòu)建miR-139-5p低表達(dá)慢病毒表達(dá)載體，并包裝成病毒感染大鼠H9c2心肌細(xì)胞，為探討其參與心臟保護(hù)作用的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞、菌株與質(zhì)粒慢病毒載體系統(tǒng)包括pGC-LV載體，pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體(Genechem公司)；H9c2細(xì)胞(ATCC，美國)；293T細(xì)胞、大腸桿菌菌株DH5α(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)。

1.2主要試劑與儀器AgeI、EcoRI限制性內(nèi)切酶、T4連接酶(NEB公司，美國)；Taq 酶 (SinoBio)；質(zhì)粒抽提試劑盒(Promega，美國)；In-FusionTMPCR Cloning Kit(clontech，美國)；DMEM培養(yǎng)基(低糖)、胎牛血清(Hyclone，美國)；胰蛋白酶(Sigma，美國)；TRIzol RNA分離試劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Lipofectamine 2000(Invitrogen，美國)；SYBR FAST Qpcr Kit Master Mix (2×) Universal (KAPA Biosystem)；RT-PCR儀(Mastercycler，Eppendorf，德國)；BIO-RAD IQ5多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems, 美國)；凝膠成像儀(天能公司)；Thermo Forma 3111型CO2孵箱、Nanodrop2.0核酸測(cè)定儀(Thermo，美國)；CK40-F200型倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本)。

1.3設(shè)計(jì)miR-139-5p 靶點(diǎn)序列及合成寡核苷酸雙鏈通過miRBase數(shù)據(jù)庫查詢到miR-139-5p (MIMAT0000845) 序列為5′-UCUACAGUGCACGUGUCUCCAG-3′。利用Invitrogen 網(wǎng)站(http://maidesigner.invitrogen.coni/maiexpress/design.do)，設(shè)計(jì)合成miR-139-5p 靶點(diǎn)序列5′-CTGGAGACACGTGCACTGTAGA-3′，經(jīng)GenBeank數(shù)據(jù)庫的BLAST檢索，確認(rèn)目的基因序列沒有其它同源序列。合成寡核苷酸雙鏈，正義鏈：5′-AATTCAAAAATCTACAGTGCACGTGTCTCCAG-3′；反義鏈：5′-CCGGCTGGAGACACGTGCACTGTAGATTTTTG-3′。

1.4重組慢病毒載體的構(gòu)建將雙鏈DNA片段和經(jīng)AgeI和EcoRI酶切后線性化的載體pGC-LV質(zhì)粒在T4 DNA連接酶作用下于16℃連接過夜。將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化氯化鈣法新鮮制備的DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液涂布在AMP抗性(100 mg·L-1) LB培養(yǎng)平皿，37℃培養(yǎng)16 h。篩選陽性克隆并進(jìn)行菌落PCR鑒定，將鑒定為陽性的克隆(pGC-LV-miR-139-5p)進(jìn)行測(cè)序分析。菌落PCR引物序列：上游5′-GGAAAGAATAGTAGACATAATAGC-3′；下游5′-CGCGTGGATAACCGTATTAC-3′。 測(cè)序引物序列5′-CCATGATTCCTTCATATTTGC-3′。

1.5慢病毒顆粒的制備調(diào)整HEK293T細(xì)胞密度為6×108·L-1，接種于15 cm培養(yǎng)皿，5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)箱內(nèi)過夜。待細(xì)胞融合度達(dá)70%~80%時(shí)，將pGC-LV-miR-139-5p、pHelper 1.0和pHelper 2.0 3種質(zhì)粒在Lipofectamine 2000作用下共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。8 h后更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞上清液，于4℃、4 000 r·min-1離心10 min。上清液用0.22 μm濾器過濾，濃縮后于-80℃保存。命名為miR-139-5p inhibition。

1.6梯度稀釋法測(cè)定病毒滴度以每孔4×107·L-1的密度將HEK293T細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 μL。37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。取7個(gè)Ep管，在每個(gè)管中加入90 μL無血清培養(yǎng)基。取待測(cè)定的病毒原液10 μL加入到第1個(gè)管中，混勻后取10 μL加入到第2個(gè)管中。依次倍比稀釋至最后1管。選取所需細(xì)胞孔，吸出90 μL培養(yǎng)基，加入90 μL對(duì)應(yīng)稀釋好的病毒溶液，繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，加入完全培養(yǎng)基100 μL。4 d后，觀察熒光表達(dá)情況。熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)的增加而減少。根據(jù)表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的HEK293T細(xì)胞數(shù)目計(jì)算病毒滴度。

1.7重組慢病毒感染H9c2細(xì)胞以含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H9c2細(xì)胞，按4×107·L-1密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，在37℃、5% CO2孵箱中孵育24 h。待細(xì)胞融合度達(dá)30%左右時(shí)，加入用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基稀釋好的重組慢病毒或空載病毒以及促感染劑polybrene (5 mg·L-1)，感染H9c2細(xì)胞。24 h后更換為新鮮培基。細(xì)胞感染后3 d，用嘌呤霉素(1 g·L-1)進(jìn)行3次細(xì)胞篩選。之后在顯微鏡下檢查GFP熒光表達(dá)情況以判斷感染效率。轉(zhuǎn)染效率(熒光率)大于95%，說明已經(jīng)篩選出穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。

1.8實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)H9c2細(xì)胞中miR-139-5p的相對(duì)表達(dá)量用TRIzol提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA后，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。RT引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTGGAGAC-3′；PCR上游引物5′-CAGCGGTCTACAGTGCACGT-3′，PCR下游引物5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：10 μL KAPA Mix (2×)、0.2 μL miR-139-5p Primer up (10 μmol·L-1)、0.2 μL miR-139-5p Primer down (10 μmol·L-1)、1 μL稀釋4倍的cDNA，用雙蒸水定容。PCR程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃ 5 s、65℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；分析熔解曲線。使用2-△△CT法計(jì)算miRNA相對(duì)表達(dá)量。

Fig 1Sequencing results of recombinant plasmids pGC-LV-miR-139-5p

2結(jié)果

2.1重組慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定重組質(zhì)粒pGC-LV-miR-139-5p經(jīng)測(cè)序后，結(jié)果與目的片段一致(Fig 1)，說明載體構(gòu)建成功。

2.2慢病毒包裝及滴度將低表達(dá)重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pGC-LV-miR-139-5p與 pHelper 1.0和pHelper 2.0包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下可見大量綠色熒光顆粒，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，慢病毒包裝成功。梯度滴定法測(cè)定miR-139-5p inhibition 病毒滴度為8×1011TU·L-1。2.3miR-139-5p表達(dá)水平檢測(cè)將重組慢病毒miR-139-5p inhibition或其陰性對(duì)照載體(control)感染H9c2細(xì)胞，72 h后均觀察到有GFP表達(dá)。從熒光觀察結(jié)果可見目的細(xì)胞的感染效率達(dá)到95%以上，說明構(gòu)建的慢病毒載體轉(zhuǎn)染有效(Fig 2)。4 d后，收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)miR-139-5p基因表達(dá)情況。與control組相比，miR-139-5p inhibition組miR-139-5p表達(dá)量明顯降低(P<0.01)。見Fig 3。

Fig 2GFP expression of lentivirus infection of H9c2 cells (×100)

A: miR-139-5p inhibition; B: Control

Fig 3Statistical analysis showing expression of miR-139-5p

**P<0.01vscontrol

3討論

心肌miR的表達(dá)變化參與多種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展[3-4]。已有研究發(fā)現(xiàn)心肌I/R損傷或心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(hypoxia-reoxygenation，H/R)損傷可誘導(dǎo)多種miR表達(dá)變化[5-8]。亦有研究證實(shí)miR在心肌I/R或H/R損傷中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。抑制miR-92a或miR-7a/b的表達(dá)可以縮小心肌I/R損傷所致的梗死面積，減少H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[9-10]。在體大鼠心臟miR-125b或miR-22表達(dá)增加可明顯縮小I/R誘導(dǎo)的心肌梗死面積，并減少心肌細(xì)胞凋亡[11-12]?？梢?，以miR為靶點(diǎn)的研究可能為心肌I/R損傷提供有效的防治策略。

目前針對(duì)miR-139-5p的研究主要集中在腫瘤領(lǐng)域，其可能是食管鱗狀細(xì)胞癌早期診斷和預(yù)測(cè)的潛在的生物標(biāo)記物[13]，并可能是乳腺癌代謝途徑的重要調(diào)控子[14]。也有少量研究報(bào)道出現(xiàn)在腦和神經(jīng)系統(tǒng)，提示miR-139-5p可以減弱12 h缺血缺氧誘導(dǎo)的新生小鼠的大腦損傷[15]。miR-139-5p在心血管系統(tǒng)疾病中的作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-139-5p在經(jīng)歷LIPC和I/R損傷的大鼠心肌中的表達(dá)呈現(xiàn)反方向的變化趨勢(shì)，其在LIPC組心肌組織表達(dá)減少，而在I/R組表達(dá)增加?？紤]到I/R的損傷作用和LIPC的保護(hù)作用，推測(cè)其表達(dá)變化可能LIPC所提供的心臟保護(hù)中發(fā)揮關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用。為進(jìn)一步研究miR-139-5p的功能，本研究構(gòu)建miR-139-5p低表達(dá)的H9c2穩(wěn)定細(xì)胞株。前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，利用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入H9c2心肌細(xì)胞的效率僅為5%，難以篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。而慢病毒載體包容量大，可將其攜帶的目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組，使外源基因能夠長期穩(wěn)定表達(dá)，且能夠有效轉(zhuǎn)染周期性和非周期性細(xì)胞、干細(xì)胞、受精卵以及分化后的后代細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)在多種類型的細(xì)胞中特異而穩(wěn)定地表達(dá)目的基因，從而快速而高效地研究基因功能。故最終選擇慢病毒載體系統(tǒng)感染H9c2心肌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)抑制miR-139-5p表達(dá)的目的。研究表明，重組慢病毒是攜帶目的基因進(jìn)入H9c2細(xì)胞的有效方法，MOI值為1 ∶250時(shí)轉(zhuǎn)染效率幾乎可達(dá)100%。

總之，本研究成功構(gòu)建了miR-139-5p低表達(dá)慢病毒載體，并包裝成病毒感染大鼠H9c2心肌細(xì)胞，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的miR-139-5p低表達(dá)H9c2心肌細(xì)胞株，為探討其參與心臟保護(hù)作用的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn):

[1]Bartel D P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function [J].Cell, 2004, 116(2):281-97.

[2]Van Rooij E. Introduction to the series on microRNAs in the cardiovascular system[J].CircRes, 2012, 110(3):481-2.

[3]孫丹云, 劉紅梅, 唐淵, 等. G蛋白抑制多肽匯利欣康對(duì)心肌肥大microRNA表達(dá)的影響[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2012, 30(2): 175-9.

[3]Sun D Y, Liu H M, Tang Y, et al. Effects of G protein inhibitory peptide Huilixinkang on expressions of microRNA in myocardial hypertrophy[J].ChinPharmacolBull, 2014, 30(2): 175-9.

[4]Csonka C, Kupai K, Kocsis G F, et al. Measurement of myocardial infarct size in preclinical studies[J].JPharmacolToxicolMethods, 2010, 61(2):163-70.

[5]Thum T. MicroRNA therapeutics in cardiovascular medicine[J].EMBOMolMed, 2012, 4(1): 3-14.

[6]Baars T, Skyschally A, Klein-Hitpass L, et al. microRNA expression and its potential role in cardioprotection by ischemic postconditioning in pigs[J].PflugersArch, 2014，466(10)：1953-61.

[7]Shen B, Zhou S, He Y, et al. Revealing the underlying mechanism of ischemia reperfusion injury using bioinformatics approach[J].KidneyBloodPressRes, 2013, 38(1): 99-108.

[8]Hu J R, Lv G H, Yin B L. Altered microRNA expression in the ischemic-reperfusion spinal cord with atorvastatin therapy[J].JPharmacolSci, 2013, 121(4): 343-6.

[9]Hinkel R, Penzkofer D, Zühlke S, et al. Inhibition of microRNA-92a protects against ischemia/reperfusion injury in a large-animal model. [J].Circulation, 2013, 128(10): 1066-75.

[10]Di Ieva A, Butz H, Niamah M, et al. MicroRNAs as biomarkers in pituitary tumors[J].Neurosurgery, 2014, 75(2): 181-9.

[11]Liu Y Q, Li Y, Qin J, et al. Matrine reduces proliferation of human lung cancer cells by inducing apoptosis and changing miRNA expression profiles[J].AsianPacJCancerPrev, 2014, 15(5): 2169-77.

[12]Palma C A, Al Sheikha D, Lim T K, et al. MicroRNA-155 as an inducer of apoptosis and cell differentiation in acute myeloid leukaemia. [J].MolCancer, 2014, 13: 79.

[13]Zhu H, Fan G C. Role of microRNAs in the reperfused myocardium towards post-infarct remodelling. [J].CardiovascRes, 2012, 94(2): 284-92.

[14]Tian Y, Daoud A, Shang J. Effects of bpV(pic) and bpV(phen) on H9c2 cardiomyoblasts during both hypoxia/reoxygenation and H2O2-induced injuries[J].MolMedRep, 2012, 5(3): 852-8.

[15]Park M, Youn B, Zheng X L, et al. Globular adiponectin, acting via AdipoR1/APPL1, protects H9C2 cells from hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis[J].PLoSOne, 2011, 6(4): e19143.

Construction of a lentiviral low expression of miR-139-5p vector

and validation of its transduction efficiency in H9c2 cells

JIANG Yuan1, HUANG Zhuo-jun2, QIANG Zhao-yan1, WU Yan-na1

(1.DeptofPharmacology；2.BasicMedicalCollege,TianjinMedicalUniversity，Tianjin300070,China)

Key words: miR-139-5p; lentiviral vectors; H9c2 cells; infection; qRT-PCR; low expression