·基礎(chǔ)研究·

十二指腸空腸旁路術(shù)治療后T2DM大鼠血糖水平及回腸組織中GLUT-1表達(dá)觀察

馮啟凱1，季萬(wàn)勝2，楊洪鳴1，郭瑜1，劉鳳嬌1，曲梅花1

(1濰坊醫(yī)學(xué)院山東省高校應(yīng)用藥理學(xué)重點(diǎn)強(qiáng)化建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，山東濰坊261053；2濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

摘要：目的觀察十二指腸空腸旁路術(shù)(DJB)后2型糖尿病(T2DM)大鼠血糖水平及回腸組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(GLUT-1)的表達(dá)變化。方法雄性Wistar大鼠36只，隨機(jī)分為空白組、模型組和手術(shù)組。模型組和手術(shù)組以腹腔注射鏈脲佐菌素建立T2DM模型。手術(shù)組施行DJB術(shù)。分別于術(shù)后第1、4、8周(空白組、模型組于同一時(shí)間)測(cè)大鼠空腹血糖、空腹胰島素水平。術(shù)后第8周處死大鼠，分別采用免疫熒光雙標(biāo)記法及Western blotting法檢查回腸組織中的GLUT-1。結(jié)果手術(shù)組術(shù)后1、4、8周后空腹血糖、空腹胰島素水平降低，與術(shù)前相比，P均<0.01；手術(shù)組、空白組術(shù)后1、4、8周空腹血糖及空腹胰島素水平低于模型組(P均<0.01)。手術(shù)組、模型組、空白組GLUT-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為(226±7)、(78±5)、(46±4)個(gè)，三組兩兩相比，P均<0.01；手術(shù)組、模型組、空白組回腸組織中GLUT-1相對(duì)表達(dá)量分別為1.642 1±0.213 4、0.723 2±0.126 2、0.315 4±0.075 1，三組兩兩相比，P均<0.01。結(jié)論 DJB術(shù)后T2DM大鼠血糖水平降低，回腸組織中GLUT-1表達(dá)增高，其降糖作用可能與調(diào)節(jié)GLUT-1表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：2型糖尿??；十二指腸空腸旁路術(shù)；血糖；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.39.008

中圖分類號(hào)：R587.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：(2015-07-27)

通信作者：曲梅花

國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(IDF)認(rèn)為減重手術(shù)是血糖控制不良尤其伴高血壓、血脂異常及肥胖2型糖尿病(T2DM)患者的適宜治療手段[1，2]。有學(xué)者[3，4]評(píng)估了減重手術(shù)和藥物治療的有效性和安全性，但手術(shù)治療糖尿病的機(jī)制一直未明確。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT-1)是分布最廣泛的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[5]，可介導(dǎo)葡萄糖在細(xì)胞內(nèi)外的轉(zhuǎn)運(yùn)。鑒于小腸是葡萄糖吸收的主要部位，2015年2~6月，我們觀察了十二指腸空腸旁路術(shù)(DJB)治療后T2DM大鼠血糖水平及回腸組織中GLUT-1的表達(dá)變化，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料雄性Wistar大鼠36只，SPF級(jí)，體質(zhì)量200~220 g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供(許可證號(hào)SCXK魯20130001)；鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；安穩(wěn)血糖儀和血糖試紙條購(gòu)自廣東三諾生物傳感股份有限公司；GLUT-1酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)RD公司；鼠抗人Antihu一抗、兔抗鼠GLUT-1一抗購(gòu)自美國(guó)Milipore公司；驢抗鼠Cy3二抗、山羊抗兔FITC二抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；冰凍切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)LEICA公司；低溫冷凍離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；奧林巴斯IX71熒光顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司；ZEISS全自動(dòng)圖像分析儀購(gòu)自北京普瑞賽司儀器有限公司。

1.2動(dòng)物分組及DJB手術(shù)方法將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、手術(shù)組，每組12只。模型組、手術(shù)組大鼠禁食12 h，以STZ 53 mg/kg腹腔注射，3 d后鼠尾末端靜脈取血，以空腹血糖>13.9 mmol/L且穩(wěn)定7 d以上判定為T2DM模型制作成功[6]。手術(shù)組施行DJB手術(shù)：大鼠術(shù)前12 h禁食，術(shù)前6 h禁水；給予氯胺酮150 mg/kg腹腔注射麻醉；在胃幽門處剪斷十二指腸，縫合封閉斷端；于屈氏韌帶下約10 cm處剪斷空腸，空腸遠(yuǎn)端與幽門部進(jìn)行吻合，于空腸斷端下約7 cm處進(jìn)行空腸近端吻合；用腹腔大網(wǎng)膜分別包繞上述兩個(gè)吻合口以防止吻合口漏[7]；術(shù)后27 ℃保溫，碘伏消毒腹部切口約1周，持續(xù)3 d腿部肌注青霉素5萬(wàn)IU防感染，每天2次腰背部?jī)蓚?cè)皮下補(bǔ)液，3 d后半流質(zhì)飲食，逐步過(guò)渡到正常飲食。

1.3血糖及胰島素檢測(cè)手術(shù)組于術(shù)后1、4、8周(模型組、空白組于同一時(shí)間)在大鼠尾端靜脈取血，用血糖儀測(cè)定大鼠空腹血糖。眼內(nèi)眥采集靜脈血1 mL，室溫靜置于離心管30 min自凝，5 000r/min離心10 min后取上清，采用ELISA法檢測(cè)血清胰島素。

1.4回腸組織中GLUT-1檢測(cè)術(shù)后8周，將各組大鼠頸椎脫臼處死，取末端回腸3~4 cm，置于4%多聚甲醛固定15 min，冰凍切片，血清封閉，37 ℃恒溫孵育2 h，Antihu(鼠抗人，1∶150)+0.03% TritonX-100，4 ℃過(guò)夜，PBS漂洗，加入熒光二抗Cy3(驢抗鼠，1∶800)、GLUT-1R(兔抗鼠，1∶100)、二抗FITC(山羊抗兔，1∶150)，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(200×)，記錄每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，取均值。冰塊上切取回腸組織5~8 cm，迅速液氮凍存；抽提蛋白質(zhì)，Western blotting法檢測(cè)GLUT-1，用ZEISS全自動(dòng)圖像分析儀及VIDAS數(shù)據(jù)分析儀，測(cè)定目的條帶的灰度值，以此作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1三組空腹血糖、空腹胰島素水平比較手術(shù)組術(shù)后1、4、8周后空腹血糖、空腹胰島素水平與術(shù)前相比，P均<0.01；手術(shù)組、空白組術(shù)后1、4、8周空腹血糖及空腹胰島素水平與模型組相比，P均<0.01。見表1。

表1　 三組大鼠手術(shù)前后空腹血糖、空腹胰島素

水平比較( ± s)

表1　 三組大鼠手術(shù)前后空腹血糖、空腹胰島素

組別空腹血糖(mmol/L)空腹胰島素(mIU/L)手術(shù)組 術(shù)前19.56±2.178.93±0.75 術(shù)后1周5.28±2.21*#4.98±0.84*# 術(shù)后4周5.52±2.24*#4.13±0.72*# 術(shù)后8周5.57±2.15*#4.25±0.85*#模型組 術(shù)前19.34±2.348.89±1.41 術(shù)后1周19.56±2.788.76±1.73 術(shù)后4周20.61±2.439.01±2.46 術(shù)后8周18.98±2.268.86±1.86空白組 術(shù)前5.62±0.65#3.88±0.68# 術(shù)后1周5.35±0.71#4.02±0.54# 術(shù)后4周5.49±0.46#3.95±0.76# 術(shù)后8周5.61±0.57#4.11±0.77#

注：與同組術(shù)前相比，*P<0.01；與模型組相比，#P<0.01。

2.2三組回腸組織中GLUT-1表達(dá)比較手術(shù)組、模型組、空白組GLUT-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為(226±7)、(78±5)、(46±4)個(gè)，三組兩兩相比，P均<0.01。手術(shù)組、模型組、空白組回腸組織中GLUT-1相對(duì)表達(dá)量分別為1.642 1±0.213 4、0.723 2±0.126 2、0.315 4±0.075 1，三組兩兩相比，P均<0.01。見圖1。

注：1為空白組；2為模型組；3為手術(shù)組。

圖1各組大鼠回腸組織中GLUT-1表達(dá)比較

3討論

糖尿病是危害人類健康的常見病、多發(fā)病。針對(duì)T2DM因胰島素抵抗或(和)胰島素分泌缺陷引起的高血糖及并發(fā)癥，傳統(tǒng)治療手段以控制飲食、服用降糖藥物、注射胰島素為主，但很難達(dá)到治愈的效果。目前，關(guān)于減重手術(shù)治療糖尿病的研究逐漸增多。治療糖尿病的手術(shù)有多種類型，主要包括吸收不良型手術(shù)、限制性手術(shù)和兩者結(jié)合的術(shù)式[8]。DJB手術(shù)在傳統(tǒng)減重手術(shù)治療機(jī)制的基礎(chǔ)上，保留胃容積、將近端十二指腸曠置，用以治療非肥胖型T2DM。在本研究中，手術(shù)組術(shù)后8周大鼠空腹血糖值由(19.56±2.17)mmol/L下降到(5.57±2.15)mmol/L，降糖作用明顯。

DJB手術(shù)治療T2DM的機(jī)制一直未明，主要有以下幾種假說(shuō)[9~12]：①腸-胰島軸假說(shuō)；②脂肪-胰島軸假說(shuō)；③胰島素樣生長(zhǎng)因子假說(shuō)；④腸道菌群改變假說(shuō)。葡萄糖調(diào)節(jié)是一個(gè)全身性、復(fù)雜、有序、精密調(diào)控的過(guò)程，多種激素和生長(zhǎng)因子相互協(xié)調(diào)。作為葡萄糖進(jìn)出細(xì)胞的載體，GLUTs起重要作用。其中，GLUT-1在人體內(nèi)分布最為廣泛，同時(shí)也是對(duì)體內(nèi)微環(huán)境變化反應(yīng)最為靈敏的GLUTs之一[13]。細(xì)胞糖代謝的第一個(gè)限速步驟是葡萄糖攝入，GLUT-1在此過(guò)程的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[14]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GLUT-1的調(diào)控與細(xì)胞對(duì)葡萄糖的需求相一致[15]，GLUT-1的調(diào)控包括急性調(diào)控及慢性調(diào)控兩個(gè)方面。急性調(diào)控主要是調(diào)控GLUT-1從細(xì)胞內(nèi)的貯存囊泡向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位和GLUT-1內(nèi)在活性方面，并不涉及GLUT-1 mRNA和蛋白質(zhì)的合成調(diào)節(jié)。細(xì)胞膜上的GLUT-1在應(yīng)激情況下會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)位進(jìn)而使葡萄糖分子進(jìn)入細(xì)胞的數(shù)量大幅度增加，同時(shí)GLUT-1的亞細(xì)胞分布也受細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響。

本研究結(jié)果顯示，手術(shù)組GLUT-1表達(dá)高于模型組及空白組，提示DJB手術(shù)能上調(diào)T2DM大鼠回腸組織中GLUT-1的表達(dá)水平，進(jìn)而降低血糖水平。我們還發(fā)現(xiàn)，模型組與手術(shù)組大鼠術(shù)前伴有高胰島素血癥，存在嚴(yán)重的胰島素抵抗，而手術(shù)組術(shù)后胰島素水平降低，低于模型組，推測(cè)DJB手術(shù)可能還有糾正胰島素抵抗的作用，與調(diào)節(jié)GLUT-1表達(dá)共同達(dá)到降低血糖的效果。

總之，DJB手術(shù)可降低T2DM大鼠血糖水平，上調(diào)回腸組織中GLUT-1表達(dá)，其降糖作用可能與調(diào)節(jié)GLUT-1表達(dá)有關(guān)。

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