樹(shù)脂固定化β-半乳糖苷酶制備低聚半乳糖

費(fèi)俊杰，李冰冰，陳勇，應(yīng)漢杰

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心，南京211800)

摘要：以樹(shù)脂為載體研究β-半乳糖苷酶固定化條件，來(lái)改善酶性質(zhì)。以吸附率和回收率最高的離子交換樹(shù)脂I002為載體，通過(guò)先吸附后交聯(lián)的方法固定β-半乳糖苷酶，優(yōu)化固定化條件。結(jié)果表明：加酶量為51.8 U(以1 g樹(shù)脂計(jì))，固定pH為6.5，溫度是25 ℃，吸附時(shí)間12 h，戊二醛體積分?jǐn)?shù)為4%，交聯(lián)溫度是40 ℃，時(shí)間是6 h時(shí)，固定化效果最好。獲得的固定化酶活可達(dá)16.2 U，固定酶回收率為39.1%，得到低聚半乳糖(GOS)的產(chǎn)率為24.2%。該研究為工業(yè)化利用固定化乳糖酶連續(xù)生產(chǎn)低聚半乳糖提供了技術(shù)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：β-半乳糖苷酶；固定化；低聚半乳糖;樹(shù)脂

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.04.004

收稿日期：2014-04-23

基金項(xiàng)目：國(guó)家杰出青年基金(21025625)；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2012AA021203)；國(guó)家支撐計(jì)劃(2012BAIG4001)；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(21106070)；長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新發(fā)展計(jì)劃(PCSIRT)；江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程；江蘇自然科學(xué)基金(SBK201150207)

作者簡(jiǎn)介：費(fèi)俊杰(1989—)，男，江蘇啟東人，碩士研究生，研究方向：酶催化；應(yīng)漢杰(聯(lián)系人)，教授，E-mail：yinghanjie@njtech.edu.cn

中圖分類號(hào)：Q814文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Galactooligosaccharides production byβ-galactosidase immobilized onto resins

FEI Junjie,LI Bingbing,CHEN Yong,YING Hanjie

(National Engineering Technique Research Center for Biotechnology,College of Biotechnology

and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

Abstract：We used resin as a carrier to immobilize β-galactosidase for the production of galactooligosaccharides. Cation exchange resin with the highest absorption rate and recover rate was selected as the carrier. The immobilization condition was optimized through cross-linking after immobilization of β-galactosidase.The best condition was enzyme load 51.8 U/g resin,pH 6.5,25 ℃, time 12 h; and the concentration of glutaraldehyde of 4%(v/v); the temperature in cross-linking action was 40 ℃,the time was 6 h. Under the conditions, the activity of immobilized enzyme was 16.2 U/g resin,the recovery of enzyme fixed was 39.1%,the galactooligosaccharides (GOS) production was 24.2%. The method provides technical basis for continuous production of GOS.

Keywords：β-galactosidase;immobilized;galactooligosaccharides;resin

低聚半乳糖(GOS)屬于益生元，是近年來(lái)備受關(guān)注的功能性低聚糖，并且是眾多功能性低聚糖中獲得最廣泛認(rèn)可、最為安全的低聚糖之一。它不僅可以促進(jìn)人體腸道內(nèi)益生菌增殖，調(diào)整腸道菌群平衡，增強(qiáng)人體免疫機(jī)能和機(jī)體的非特異和特異性免疫反應(yīng)等功能，還有低甜度、低能量、非消化性、安全性高等特點(diǎn)，是其他低聚糖無(wú)法相比的，可以說(shuō)是促進(jìn)人體健康的重要功能性食品成分，可廣泛應(yīng)用于食品加工業(yè)中。

目前，低聚半乳糖的制備主要有5種方法[2-3]：①天然提取法。在自然界中，低聚半乳糖含量較少，并且不帶電荷，分離提取較為困難；②酸水解多糖法。酸水解多糖轉(zhuǎn)化率低，產(chǎn)品成分復(fù)雜，難以得到含量較高的低聚半乳糖；③化學(xué)合成法?；瘜W(xué)合成法試劑毒性大，易殘留，不適用食品級(jí)低聚半乳糖生產(chǎn)；④發(fā)酵法。直接用微生物發(fā)酵制備低聚半乳糖目前研究較少，該方法需要從發(fā)酵液中分離提取低聚半乳糖，發(fā)酵液成分復(fù)雜，分離較為困難。以上4種方法由于產(chǎn)物成分復(fù)雜，分離成本高，目前不適合工業(yè)化生產(chǎn)；⑤酶法合成。酶法合成低聚半乳糖主要以牛乳來(lái)源的乳糖為底物，利用微生物β-D-半乳糖苷酶催化合成，乳糖來(lái)源充足，而β-D-半乳糖苷酶主要由微生物發(fā)酵制得，生產(chǎn)成本較低，是目前工業(yè)化生產(chǎn)低聚半乳糖的主要方法。酶法合成GOS分為游離酶和固定化酶兩種。固定化酶法合成GOS具有酶利用率高，穩(wěn)定性好，產(chǎn)率高， 產(chǎn)物后處理工藝少等優(yōu)點(diǎn)，已成為合成研究的熱點(diǎn)。樹(shù)脂是一種廉價(jià)的材料，具有機(jī)械強(qiáng)度好，物化性能穩(wěn)定，容易再生等特點(diǎn)。

本文采用樹(shù)脂作為β-半乳糖苷酶的固定化載體，分別對(duì)酶固定化的條件及固定化酶的性質(zhì)進(jìn)行研究，以期為酶法合成低聚半乳糖提供新的思路。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

低聚半乳糖標(biāo)品，上海惠誠(chéng)生物科技有限公司；諾維信(Novozymes)乳糖酶Lactozym Pure 6 500 L，北京嘉瑞富德食品科技公司；葡萄糖、戊二醛(體積分?jǐn)?shù)50%)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乳糖、半乳糖、牛血清白蛋白(BSA)，上?；菖d生化試劑有限公司；KH2PO4、K2HPO4、乙醇、正丙醇、NaOH、無(wú)水Na2CO3，西隴化工股份有限公司；鄰硝基苯酚(ONP)、鄰硝基苯-β-D-半乳糖糖苷(ONPG)、考馬斯亮藍(lán)G250，Sigma公司；98%濃硫酸、鹽酸，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

D113樹(shù)脂、D001-CC樹(shù)脂、HPD300樹(shù)脂、DA201-A樹(shù)脂，南開(kāi)大學(xué)化工廠；I002樹(shù)脂、HZ004樹(shù)脂，由筆者所在課題組制備。

ZQZY-C型恒溫?fù)u床，上海知楚儀器有限公司；HH-2型恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；UV-2600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司；1200 series高效液相色譜儀，安捷倫公司；HPX-87H型 Aminex色譜柱，Bio-Rad公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樹(shù)脂預(yù)處理方法

D113、D001-CC、HZ004和I002樹(shù)脂是陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，HPD300、DA201-A樹(shù)脂是大孔吸附樹(shù)脂。先在乙醇里浸泡8 h，用去離子水洗滌，再浸入1 mol/L NaOH浸泡8 h，用去離子水洗至中性，最后浸入1 mol/L HCl浸泡8 h，用去離子水洗至中性，去離子水浸泡備用。

I002樹(shù)脂的活化：10 g樹(shù)脂加入到40 mL的0.1 mol/L pH 8.0的磷酸緩沖液中，攪拌15 min后，測(cè)pH，維持 pH 7.8.0～8.2，1 h后過(guò)濾抽干。

1.2.2固定化乳糖酶的制備

取1 g樹(shù)脂加入到5 mL的酶液里，在30 ℃條件下吸附12 h后，加入200 μL戊二醛溶液，25 ℃、150 r/min固定化處理6 h。固定化結(jié)束后，固定化酶用去離子水洗滌，晾干，測(cè)定固定化酶活和上清液酶活。

1.2.3酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取28 mg的鄰硝基苯酚(ONP)，1 mL的甲醇溶解，再用pH為6.5、濃度0.1 mol/L的磷酸緩沖液定容至100 mL，配制成2 mmol/L的ONP原液，加入不同體積的ONP和磷酸緩沖液，總量為4 mL。在40 ℃條件下反應(yīng)20 min，加入2 mL的1 mol/L的Na2CO3滅活測(cè)定波長(zhǎng)420 nm處的吸光度OD420，并繪制乳糖酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4乳糖酶酶活的測(cè)定

游離酶活力測(cè)定：取3 mL含有4 g/L ONPG的磷酸緩沖溶液于試管中，在40 ℃條件下水浴7 min，加入1 mL稀釋過(guò)的酶液，振蕩，40 ℃條件下反應(yīng)10 min，再加入2 mL濃度為1 mol/L的Na2CO3終止反應(yīng)，搖勻，在420 nm處測(cè)定OD420。

固定化酶活的測(cè)定：稱取1 g的固定化酶顆粒，加入10 mL pH 6.5的磷酸緩沖溶液溶解的底物ONPG，于40 ℃反應(yīng)20 min，加入1.5 mL濃度為1 mol/L的Na2CO3來(lái)滅活，測(cè)定滅活結(jié)束后OD420。

酶活的定義：在特定的反應(yīng)條件下(40 ℃、pH 6.5、反應(yīng)10 min),每分鐘催化生成1 μmol的ONP所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)，即

(1)

式中：N為游離酶的稀釋倍數(shù)；0.714為換算系數(shù)，即ONP濃度為1 μmol/L的OD420；t為反應(yīng)時(shí)間(min)。

1.2.5產(chǎn)物定量方法

使用美國(guó)安捷倫1200系列HPLC檢測(cè)乳糖和轉(zhuǎn)苷反應(yīng)后的物質(zhì)(GOS，D-半乳糖和D-葡萄糖)。檢測(cè)條件：流動(dòng)相為5 mmol/L硫酸，柱溫為65 ℃，色譜柱為Aminex HPX 87H，流速0.6 mL/min，示差折光檢測(cè)器檢測(cè)，每次進(jìn)樣量10 μL。

1.2.6固定化酶活性吸附率和回收率計(jì)算

固定化酶活性吸附率和回收率的計(jì)算方法分別見(jiàn)式(2)和式(3)。

(2)

固定化酶回收率=

(3)

2結(jié)果與討論

2.1β-半乳糖苷酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照實(shí)驗(yàn)方法中酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制來(lái)測(cè)定吸光值OD420，繪制β-半乳糖苷酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線。ONP原液添加量與測(cè)到的OD420的數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1　OD 420數(shù)值

由表1數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=0.714 34X，R2=0.999 2。

2.2乳糖酶固定化條件的優(yōu)化

2.2.1固定化樹(shù)脂的選擇確定

純酶液酶活為51.796 U，加各種樹(shù)脂1 g，按照1.2.4節(jié)實(shí)驗(yàn)方法測(cè)其上清液的酶活和固定化酶活，然后根據(jù)式(2)、式(3)來(lái)計(jì)算吸附率和回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知：大孔吸附樹(shù)脂I002、HPD300、DA201-A的吸附率相對(duì)比較高，可能原因是大孔吸附樹(shù)脂的表面積大且吸附量大。離子交換樹(shù)脂固定化乳糖酶時(shí)，酶蛋白與樹(shù)脂進(jìn)行離子交換的機(jī)率比較高，對(duì)酶活的影響較小，因此，其固定化酶活回收率較高。在6種樹(shù)脂中，I002樹(shù)脂對(duì)乳糖酶的吸附率和回收率最高，分別為80%和38.5%，故選擇I002交換樹(shù)脂作為乳糖酶固定化載體。

表2　不同樹(shù)脂載體的吸附率和回收率比較

2.2.2戊二醛用量對(duì)酶固定化的影響

吸附在離子交換樹(shù)脂I002上的乳糖酶容易受外界的影響而脫落，因此，可以用戊二醛作為交聯(lián)劑來(lái)進(jìn)一步提高固定化酶的穩(wěn)定性。取處理后的I002樹(shù)脂1 g加入到0.2 mol/L、pH 6.5磷酸緩沖液稀釋的酶液中，然后加入51.8 U/g(以1 g樹(shù)脂計(jì))的β-半乳糖苷酶，在25 ℃條件下吸附12 h后，加入不同體積分?jǐn)?shù)的戊二醛，在40 ℃條件下150 r/min的搖床中交聯(lián)6 h，研究戊二醛用量對(duì)固定化酶活和固定化酶回收率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1　 戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)酶固定化的影響 Fig.1　 Effects of glutaraldehyde volume concentration on enzyme immobilization

由圖1可知：固定化酶回收率和固定化酶活在戊二醛體積分?jǐn)?shù)為4%的時(shí)候最大。其中，戊二醛在用量不高時(shí)主要起分子間的交聯(lián)作用，可是當(dāng)戊二醛用量過(guò)高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致酶分子自己的結(jié)合，從而改變蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象，使得固定化酶活降低，所以最佳戊二醛用量確定為4%。

2.2.3溫度對(duì)酶固定化的影響

離子交換反應(yīng)需要一定的活化能,溫度的升高有利于交換速度的提高,影響分子熱運(yùn)動(dòng)的速度,但溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性而失活,因此多種因素決定了溫度對(duì)酶的固定化過(guò)程的影響,綜上固定化乳糖酶存在一個(gè)最適溫度范圍。

按實(shí)驗(yàn)方法1.2.2節(jié)處理后的乳糖酶(戊二醛體積分?jǐn)?shù)4%)，在不同溫度下交聯(lián)6 h，研究不同溫度對(duì)固定化酶回收率和固定化酶活的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　 溫度對(duì)酶固定化的影響 Fig.2　 Effects of temperature on enzyme immobilization

由圖2可知：在40 ℃時(shí)固定化酶回收率和固定化酶活最大，固定化溫度在30～50 ℃時(shí)固定化回收率為39.1%和固定化酶活為16.2 U，且變化不大。酶蛋白在樹(shù)脂上的吸附是一個(gè)吸熱過(guò)程,在溫度較低時(shí),酶不容易吸附到樹(shù)脂上，隨著固定化溫度的升高,分子運(yùn)動(dòng)逐漸加劇,載體對(duì)酶的吸附量也會(huì)有所提高。當(dāng)溫度超過(guò)50 ℃，固定化酶回收率和固定化酶活會(huì)降低且變化幅度很大，是由于溫度過(guò)高，導(dǎo)致戊二醛對(duì)酶變性作用過(guò)強(qiáng)，而且酶蛋白在較高的溫度下容易變性失活。綜上，最佳固定化溫度選擇為40 ℃。

2.3固定化乳糖酶性質(zhì)的研究

2.3.1pH對(duì)乳糖酶酶活的影響

在0.2 mol/L磷酸緩沖鹽體系下(含1.5 mmol/L的MgCl2)，在溫度40 ℃條件下，分別測(cè)固定化酶與游離酶相對(duì)酶活，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　 pH對(duì)β-D-半乳糖苷酶活性的影響 Fig.3　 Effects of pH on activity of β-D-galactosidase

由圖3可知：pH為5.0～8.3時(shí)，乳糖酶游離狀態(tài)下最適pH為6.2，乳糖酶固定在I002樹(shù)脂上后，pH為6.2～7.4時(shí)，酶活性很穩(wěn)定，即使在酸性條件下，酶的相對(duì)活力都比游離酶活高，這表明通過(guò)結(jié)合在載體后，酶分子穩(wěn)定性得到了提高[7-8]。這是因?yàn)槊腹潭ㄟ^(guò)程中與載體多位點(diǎn)結(jié)合[9-10]，構(gòu)象更加穩(wěn)定，減弱了外部溶液變化對(duì)酶分子構(gòu)象的影響。

2.3.2溫度對(duì)乳糖酶酶活的影響

在0.2 mol/L磷酸緩沖鹽體系下(含1.5 mmol/L的MgCl2)，pH為6.5條件下考察溫度對(duì)游離酶和固定化酶的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4　 溫度對(duì)β-D-半乳糖苷酶活性的影響 Fig.4　 Effects of temperature on activity of β-D-galactosidase

由圖4可知：乳糖酶游離狀態(tài)下的適合溫度為40 ℃，乳糖酶固定在I002樹(shù)脂上后，溫度在30～50 ℃時(shí)相對(duì)酶活都較高。這表明通過(guò)載體的結(jié)合，酶分子穩(wěn)定性得到了提高?？赡苁且?yàn)槊阜肿咏Y(jié)構(gòu)剛性增強(qiáng)，所以不易折疊變性。

2.3.3固定化的轉(zhuǎn)苷反應(yīng)結(jié)果

I002樹(shù)脂固定β-半乳糖苷酶，乳糖250 g/L，pH 6.5，比酶活為3 U/mL，在磷酸緩沖體系中40 ℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，測(cè)定產(chǎn)物含量，在轉(zhuǎn)苷反應(yīng)形成GOS過(guò)程中，各個(gè)產(chǎn)物生成量與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系見(jiàn)圖5。

圖5　 反應(yīng)生成物濃度與時(shí)間之間的關(guān)系 Fig.5　 Relationship of product concentration and reaction time

由圖5可以看出，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間低于60 min時(shí)，GOS的生成量急劇增加，三糖的合成速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他糖的合成速率；當(dāng)反應(yīng)超過(guò)120 min，三糖、四糖的生成量趨于穩(wěn)定，但葡萄糖和半乳糖的量持續(xù)增加；盡管反應(yīng)至240 min時(shí)，GOS含量達(dá)到最大(60.5 g/L)，相對(duì)乳糖的收率為24.2%，但是自從反應(yīng)超過(guò)120 min，GOS的生成量增加不明顯。因此，為了提高GOS的生產(chǎn)效率，確定60 min為合適的反應(yīng)時(shí)間。

2.3.4固定化酶反應(yīng)的穩(wěn)定性

固定化乳糖酶在pH 6.5和40 ℃的條件下連續(xù)操作9次，每次操作后測(cè)定固定化酶活，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6　 固定化酶的操作穩(wěn)定性 Fig.6　 Operational stability of immobilized enzyme

由圖6可知：固定化酶的相對(duì)活性隨反應(yīng)次數(shù)的增加而逐漸降低，酶活的降低可能有兩方面原因，一方面是固定化酶在進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)過(guò)程中，長(zhǎng)時(shí)間機(jī)械攪拌會(huì)導(dǎo)致部分乳糖酶的失活；另一方面在重復(fù)回收的過(guò)程中可能會(huì)有一些人為的損失。但結(jié)果表明：固定化乳糖酶重復(fù)使用9次后仍保留了較高的活性，β-半乳糖苷酶的相對(duì)活力仍為75%，可見(jiàn)固定化乳糖酶具有良好的反應(yīng)連續(xù)性和穩(wěn)定性。

2.3.5固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

考察乳糖酶在固定化和游離狀態(tài)下，在5 ℃冰箱內(nèi)的儲(chǔ)存穩(wěn)定性是衡量其商業(yè)化應(yīng)用的重要指標(biāo)。將固定化乳糖酶和游離乳糖酶置于5 ℃冰箱內(nèi)保存，每隔一段時(shí)間去測(cè)定乳糖酶活力，其酶活變化情況見(jiàn)圖7。

圖7　 乳糖酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性 Fig.7　 Storage stability of β-D-galactosidase

由圖7可知：固定化乳糖酶儲(chǔ)存90 d，其酶活力保持在89%，而游離酶保持在77%。與游離酶相比，固定化酶在5 ℃儲(chǔ)存時(shí)穩(wěn)定性增強(qiáng)，這可能是由于酶的固定化降低了蛋白酶對(duì)乳糖酶的降解能力。酶的低溫貯存穩(wěn)定性增強(qiáng)，可進(jìn)一步提高酶的應(yīng)用價(jià)值，為固定化酶的實(shí)際應(yīng)用提供了有利的數(shù)據(jù)參考。

3結(jié)論

選擇6種離子交換樹(shù)脂進(jìn)行固定化吸附率和回收率的比較實(shí)驗(yàn)，并對(duì)吸附率和回收率最高的I002樹(shù)脂進(jìn)行吸附交聯(lián)固定化，用戊二醛作為交聯(lián)劑。處理后的1 g離子交換樹(shù)脂I002加入用pH 6.5、0.2 mol/L磷酸緩沖液稀釋的酶液，加酶量經(jīng)測(cè)定為51.8 U/g(以1 g樹(shù)脂計(jì))，在25 ℃吸附12 h后，加入體積分?jǐn)?shù)4%的戊二醛，在40 ℃條件下交聯(lián)6 h，最終獲得的固定化酶活為16.2 U，固定化酶回收率為39.1%。并且利用固定后的樹(shù)脂在比酶活為3 U/mL(磷酸緩沖鹽溶液)，pH為6.5，溫度為40 ℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，得到GOS產(chǎn)率為24.2%。

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(責(zé)任編輯荀志金)