李雅莉，趙　玲，張　麗，張　蘭，李　林

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室；2.北京市老年病醫(yī)療研究中心；3.北京市神經(jīng)藥物工程研究中心，北京　100053)

復(fù)原再造膠囊對(duì)全腦缺血小鼠學(xué)習(xí)記憶及腦內(nèi)氧化應(yīng)激的影響

李雅莉，趙玲，張麗，張?zhí)m，李林

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室；2.北京市老年病醫(yī)療研究中心；3.北京市神經(jīng)藥物工程研究中心，北京100053)

【摘要】目的研究中藥新復(fù)方制劑復(fù)原再造膠囊對(duì)全腦缺血小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響及其與氧化應(yīng)激相關(guān)的作用機(jī)制。方法采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉/再灌注致全腦缺血小鼠模型，以Morris水迷宮和跳臺(tái)試驗(yàn)檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，尼氏染色法觀察海馬神經(jīng)元的病理變化，黃嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸法分別測(cè)定腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量。結(jié)果全腦缺血/再灌注引起小鼠學(xué)習(xí)記憶能力受損，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少，大腦皮層SOD活性降低，MDA含量增加。復(fù)原再造膠囊于造模后灌胃給藥14 d，能明顯改善全腦缺血小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，減少海馬區(qū)神經(jīng)元的損傷和丟失，提高大腦皮層SOD活性，降低MDA含量。結(jié)論復(fù)原再造膠囊可通過(guò)抑制全腦缺血再灌注引起的氧化應(yīng)激而改善學(xué)習(xí)記憶功能，提示該藥具有治療缺血性腦血管病的應(yīng)用前景。

【關(guān)鍵詞】復(fù)原再造膠囊；中藥；全腦缺血；學(xué)習(xí)記憶功能；神經(jīng)元；氧化應(yīng)激；小鼠

腦血管病具有高發(fā)病率、高致殘率、高致死率等顯著特點(diǎn)，已經(jīng)成為繼心血管病、腫瘤之后嚴(yán)重威脅人類生命的第三大類疾病，給患者及社會(huì)帶來(lái)沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1，2]。目前臨床普遍采用血管內(nèi)介入及靜脈溶栓法治療缺血性腦血管病，這一過(guò)程中不可避免出現(xiàn)血管再通后的缺血再灌注損傷問(wèn)題。缺血后的再灌注損傷對(duì)人類健康的危害極大，快速恢復(fù)腦組織的血液灌注是救治腦缺血的前提[3，4]，因此開(kāi)發(fā)有效的神經(jīng)保護(hù)劑成為基礎(chǔ)與臨床學(xué)者共同關(guān)注的熱點(diǎn)。

復(fù)原再造膠囊是由黃芪、赤芍、葛根、蒺藜、秦艽等組成的中藥復(fù)方制劑，具有補(bǔ)氣活血、祛風(fēng)通絡(luò)、除煩解肌、平肝解郁的功效。本文研究了復(fù)原再造膠囊對(duì)全腦缺血小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響及其與抗氧化應(yīng)激相關(guān)的作用機(jī)制，為臨床治療缺血性腦血管病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

ICR小鼠，雌雄兼用，無(wú)特殊病原體(specific-pathogen free, SPF)級(jí)，體重(30±3)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)：SCXK(京)2002-0003。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室SPF級(jí)動(dòng)物房，許可證號(hào)：SYXK(京)2000-0043。手術(shù)前夜禁食、不禁水。

1.2藥物與儀器

復(fù)原再造膠囊：天力正元醫(yī)藥技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司提供。中藥陽(yáng)性對(duì)照藥：人參再造丸，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠生產(chǎn)(國(guó)藥準(zhǔn)字Z11020060)。西藥陽(yáng)性對(duì)照藥：尼莫地平，正大青春寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(國(guó)藥準(zhǔn)字H33022285)。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Folin酚試劑由北京鼎國(guó)生物試劑公司提供；其他藥品與試劑，均為市售分析純。

Morris水迷宮及其分析軟件、跳臺(tái)反應(yīng)箱，均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供；ASE-620型恒溫冷凍切片機(jī)，美國(guó)山盾公司產(chǎn)品；日本Olympus BH-2型光學(xué)顯微鏡；美國(guó)Image Plus 4.0 圖像分析軟件；HP8453型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó)惠普公司產(chǎn)品。

1.3分組與給藥

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行全腦缺血造模手術(shù)，術(shù)后隨機(jī)分為7組：假手術(shù)組，模型組，復(fù)原再造膠囊小劑量組(2 g生藥/kg)、中劑量組(4 g生藥/kg)、大劑量組(8 g生藥/kg)，尼莫地平組(0.02 g/kg)，人參再造丸組(1 g/kg)。造模后1 h開(kāi)始灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥14 d，假手術(shù)組、模型組給予等容積生理鹽水。

1.4小鼠全腦缺血/再灌注模型制備[5]

全部模型制作在屏障環(huán)境下進(jìn)行，室溫保持在(23～25)℃，相對(duì)濕度60%，以電熱毯保持體溫在(37.5±0.5)℃。小鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，距尾尖部1 cm斷尾放血約0.4 mL。即刻用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，斷血2次，每次15 min，中間再灌10 min。最后消毒，縫合肌肉皮膚，腹腔注射硫酸慶大霉素。假手術(shù)組不夾閉，不放血，其余同模型組。

1.5行為學(xué)檢測(cè)

1.5.1Morris水迷宮試驗(yàn)[6]:定向航行實(shí)驗(yàn)：用于測(cè)定小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。各組小鼠每天訓(xùn)練2次，共訓(xùn)練4 d。第1天訓(xùn)練時(shí)，所選入池位置為平臺(tái)所對(duì)及相鄰象限，將小鼠于象限邊緣1/2弧度處頭朝池壁入水，經(jīng)120 s未找到平臺(tái)者，將其引領(lǐng)至平臺(tái)，放置30 s，引導(dǎo)其學(xué)習(xí)記憶。第2～4天重復(fù)如上操作，記錄小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)和游泳距離，將各組小鼠Morris 水迷宮作業(yè)中第2～4天的平均逃避潛伏期和平均游泳距離作為衡量其學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)，并計(jì)算小鼠的游泳速度判斷其有無(wú)肢體運(yùn)動(dòng)障礙。

空間探索實(shí)驗(yàn)：用于測(cè)定小鼠的空間位置記憶能力。第5天撤除平臺(tái)，將小鼠從任選的非平臺(tái)象限，面向池壁放入水中，記錄1 min內(nèi)小鼠在池中各象限的游泳時(shí)間和游泳距離，然后分析小鼠在平臺(tái)象限游泳時(shí)間占總時(shí)間的百分比(時(shí)間%)、在平臺(tái)象限游泳距離占總游泳距離的百分比(游泳距離%)。

1.5.2跳臺(tái)試驗(yàn)[7]:檢測(cè)小鼠的被動(dòng)回避記憶能力。第1天進(jìn)行訓(xùn)練，將各組小鼠分別放入跳臺(tái)反應(yīng)箱中適應(yīng)3 min，通以36 V交流電，訓(xùn)練5 min。24 h后將小鼠放于銅柵上通電，記錄第一次跳上跳臺(tái)的時(shí)間(反應(yīng)期)、第一次跳下的時(shí)間(潛伏期)。

1.6尼氏染色

用于觀察神經(jīng)元形態(tài)。小鼠灌殺后將腦組織取出，儲(chǔ)存于后固定液中，之后制作成10 μm厚的冰凍切片，焦油固紫工作液中染色(15～30) min，蒸餾水洗去浮色后，依次置入70%、80%、95%的酒精中分色，至顯微鏡下觀察尼氏顆粒清晰。切片入特殊分色液退背景。酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.7腦組織SOD活性和MDA含量測(cè)定

小鼠大腦皮層稱重后，按1∶10加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)，勻漿。按照試劑盒說(shuō)明書，分別采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性，硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1復(fù)原再造膠囊對(duì)全腦缺血小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

采用Morris水迷宮法測(cè)定小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。定向航行試驗(yàn)的結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，腦缺血模型小鼠第2～4天的逃避潛伏期、3 d平均逃避潛伏期均明顯延長(zhǎng)(P<0.01)；復(fù)原再造膠囊中、大劑量灌胃給藥能明顯縮短腦缺血小鼠的3 d平均逃避潛伏期(P<0.05，P<0.01)(表1)。模型小鼠第2～4天的游泳距離、3 d平均游泳距離均明顯延長(zhǎng)(P<0.05，P<0.01)；復(fù)原再造膠囊中、大劑量組3 d平均游泳距離顯著縮短(P<0.01)(表2)。對(duì)各組游泳速度進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)各組之間游泳速度無(wú)明顯差異，說(shuō)明各組小鼠逃避潛伏期的差異與游泳速度無(wú)關(guān)，主要與學(xué)習(xí)記憶能力的變化有關(guān)。

表1　復(fù)原再造膠囊對(duì)全腦缺血小鼠Morris水迷宮逃避潛伏期的影響(s)

FYZZ：復(fù)原再造膠囊；RSZZ：人參再造丸。M±SD；##P<0.01, 與假手術(shù)組相比；*P<0.05,**P<0.01與模型組相比。

Note.FYZZ: Fu-Yuan-Zai-Zao capsule; RSZZ: Ren-Shen-Zai-Zao Wan. M±SD；##P<0.01,vs. sham group；*P<0.05,**P<0.01,vs. model group.

表2　復(fù)原再造膠囊對(duì)全腦缺血小鼠Morris水迷宮游泳距離的影響(cm)

FYZZ：復(fù)原再造膠囊；RSZZ：人參再造丸。M±SD；#P<0.05，##P<0.01，與假手術(shù)組相比；*P<0.05,**P<0.01, 與模型組相比。

Note.FYZZ: Fu-Yuan-Zai-Zao capsule; RSZZ: Ren-shen-zai-zao wan. M±SD；#P<0.05，##P<0.01,vs. sham group；*P<0.05,**P<0.01,vs. model group.

在撤除平臺(tái)后的空間探索試驗(yàn)中，與假手術(shù)組相比較，腦缺血模型小鼠在平臺(tái)象限的游泳時(shí)間和游泳距離均明顯縮短(P<0.05，P<0.01)；復(fù)原再造膠囊大劑量組在平臺(tái)象限的游泳時(shí)間和游泳距離較腦缺血模型組顯著延長(zhǎng)(P<0.05)(表3)。

2.2復(fù)原再造膠囊對(duì)全腦缺血小鼠被動(dòng)回避記憶能力的影響

應(yīng)用跳臺(tái)試驗(yàn)觀察小鼠被動(dòng)回避記憶能力。結(jié)果顯示，與假手術(shù)對(duì)照組相比，腦缺血模型小鼠的反應(yīng)期明顯延長(zhǎng)(P<0.01)，潛伏期縮短(P<0.05)；復(fù)原再造膠囊各劑量能明顯縮短腦缺血小鼠的反應(yīng)期(P<0.01)，延長(zhǎng)潛伏期(P<0.01)(表4)，表明被動(dòng)回避記憶能力增強(qiáng)。

2.3復(fù)原再造膠囊對(duì)全腦缺血小鼠海馬神經(jīng)元存活的影響

應(yīng)用尼氏染色方法觀察海馬神經(jīng)元的變化。與假手術(shù)組相比，腦缺血模型組小鼠海馬CA1區(qū)尼氏體數(shù)量減少、染色變淺，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量、面積和灰度均顯著減低(P<0.05)，表明有明顯的神經(jīng)元損傷和丟失；復(fù)原再造膠囊各組均可減少腦缺血小鼠海馬CA1區(qū)尼氏體的丟失，增加陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量、面積和灰度(P<0.05)，表明海馬神經(jīng)元的損傷和丟失明顯減輕(表5、圖1見(jiàn)封二)。

表3　復(fù)原再造膠囊對(duì)全腦缺血小鼠Morris水迷宮空間探索試驗(yàn)的影響±s)

FYZZ：復(fù)原再造膠囊；RSZZ：人參再造丸。#P<0.05，##P<0.01, 與假手術(shù)組相比；*P<0.05, 與模型組相比。

Note.FYZZ: Fu-Yuan-Zai-Zao capsule; RSZZ: Ren-Shen-Zai-Zao Wan.#P<0.05，##P<0.01,vs. sham group；*P<0.05,vs. model group.

表4　復(fù)原再造膠囊對(duì)全腦缺血小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)的影響±s)

FYZZ：復(fù)原再造膠囊；RSZZ：人參再造丸。#P<0.05，##P<0.01, 與假手術(shù)組相比；**P<0.01, 與模型組相比。

Note.FYZZ: Fu-Yuan-Zai-Zao capsule; RSZZ: Ren-Shen-Zai-Zao Wan.#P<0.05，##P<0.01,vs. sham group；**P<0.01,vs. model group.

表5　復(fù)原再造膠囊對(duì)全腦缺血小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的影響(尼氏染色)±s)

FYZZ：復(fù)原再造膠囊；RSZZ：人參再造丸。#P<0.05，與假手術(shù)組相比;*P<0.05，與模型組相比。

Note.FYZZ: Fu-Yuan-Zai-Zao capsule; RSZZ: Ren-Shen-Zai-Zao Wan.#P<0.05,vs. sham group；**P<0.01,vs. model group.

表6　復(fù)原再造膠囊對(duì)全腦缺血小鼠大腦皮層SOD活性和MDA含量的影響±s)

FYZZ：復(fù)原再造膠囊；RSZZ：人參再造丸。#P<0.05，##P<0.01，與假手術(shù)組相比；*P<0.05，**P<0.01，與模型組相比。

Note.FYZZ: Fu-Yuan-Zai-Zao capsule; RSZZ: Ren-Shen-Zai-Zao Wan.#P<0.05,##P<0.01,vs. sham group；*P<0.05,**P<0.01,vs. model group.

2.4復(fù)原再造膠囊對(duì)全腦缺血小鼠腦組織氧化應(yīng)激的影響

與假手術(shù)組相比，腦缺血模型小鼠大腦皮層SOD活性明顯降低(P<0.01)，脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物MDA含量升高(P<0.05)；復(fù)原再造膠囊各劑量能明顯升高腦缺血小鼠大腦皮層SOD活性(P<0.05，P<0.01)，降低MDA含量(P<0.05)(表6)。

3討論

良好的血液供應(yīng)對(duì)于維持機(jī)體正常的組織代謝具有重要意義。雙側(cè)頸總動(dòng)脈反復(fù)缺血再灌結(jié)合尾部放血降壓制備的小鼠腦缺血模型，能夠較好地模擬臨床上腦血管嚴(yán)重狹窄或阻塞合并血液低灌流引起的腦循環(huán)障礙，造成腦組織缺血性損傷，可用于探討人類缺血性中風(fēng)的發(fā)病規(guī)律，評(píng)價(jià)抗缺血性中風(fēng)藥物的療效。本研究結(jié)果顯示，全腦缺血再灌注導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶功能和被動(dòng)回避記憶能力減低；腦缺血術(shù)后灌胃給予復(fù)原再造膠囊，能夠明顯改善模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，提示該藥可能有利于臨床治療腦缺血致認(rèn)知功能障礙。

全腦缺血損傷最主要的表現(xiàn)是遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，海馬對(duì)缺血的反應(yīng)最為明顯，海馬中又以CA1區(qū)為缺血易損區(qū)[8]。尼氏小體是分布于神經(jīng)元軸突和軸丘以外胞漿中的一種嗜堿性顆粒，其化學(xué)成分為核糖核酸及蛋白質(zhì)，是一種含鐵質(zhì)的核酸蛋白。正常情況下，神經(jīng)元的尼氏小體有其特定的數(shù)量和特征性的形態(tài)分布。在腦缺血等病理狀態(tài)下，神經(jīng)元變性時(shí)，尼氏小體的變化十分敏感，逐漸由塊狀或顆粒狀變?yōu)榉勰?，甚至消失。本?shí)驗(yàn)中復(fù)原再造膠囊能夠明顯減輕小鼠全腦缺血所致海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的尼氏小體減少，表明能夠使存活神經(jīng)元數(shù)量增多，這可能是該藥改善腦缺血?jiǎng)游飳W(xué)習(xí)記憶功能的作用機(jī)制之一。

腦缺血再灌注后導(dǎo)致機(jī)體氧自由基增高與清除系統(tǒng)失去平衡，脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng)，可導(dǎo)致大量的自由基無(wú)法清除，造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損、繼而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和死亡。體內(nèi)存在的自由基消除系統(tǒng)如SOD能夠清除超氧陰離子，是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶。SOD活性降低可導(dǎo)致體內(nèi)氧自由基含量增高，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，造成細(xì)胞損傷[9]。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠腦缺血后大腦皮層SOD活性降低，脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物MDA含量增高；復(fù)原再造膠囊能夠增高腦內(nèi)SOD活性，減低MDA含量，表明該藥具有抗氧化應(yīng)激的作用，這可能是其減少神經(jīng)元損傷和丟失的作用機(jī)制之一。

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〔修回日期〕2015-07-01

研究報(bào)告

Fu-Yuan-Zai-Zao capsule improves learning and memory ability

through inhibiting oxidative stress in global brain ischemic mice

LI Ya-li, ZHAO Ling, ZHANG Li, ZHANG Lang, LI Lin

(1. Department of Pharmacology, Xuanwu Hospital of Capital Medical University; 2. Beijing Geriatric Medical Research Center;

3. Beijing Engineering Research Center for Nervous System Drugs, Beijing 100053, China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of Fu-Yuan-Zai-Zao capsule, a novel compound drug of traditional Chinese medicine, on learning and memory ability and its mechanism related to oxidative stress induced by global brain ischemia. Methods The mouse model of global brain ischemia was established by bilateral common carotid arteries occlusion and reperfusion. The learning and memory ability was measured by Morris water maze and step down tests. Nissl staining was used to detect the pathological changes in the hippocampal neurons. The activity of superoxide dismutase (SOD) and the content of malondialdehyde (MDA) were evaluated by xanthinoxidase assay and thiobarbituric acid method, respectively. Results The global brain ischemia and reperfusion induced an impairment of learning and memory function, a decrease in the number of neurons in the hippocampal CA1 region, a decline in SOD activity and an increase in MDA content in the cerebral cortex of mice. Intragastrical administration of Fu-Yuan-Zai-Zao capsule for 14 d after brain ischemic surgery significantly improved the learning and memory impairment, increased the number of neurons in the hippocampal CA1 region, elevated SOD activity and reduced MDA content in the cerebral cortex. ConclusionsFu-Yuan-Zai-Zao capsule ameliorates the learning and memory impairment through inhibiting oxidative stress induced by global brain ischemia in mice. The results suggest that Fu-Yuan-Zai-Zao capsule may have future application in the treatment of ischemic cerebrovascular diseases.

【Key words】Fu-Yuan-Zai-Zao capsule, Chinese traditional medicine; Global cerebral ischemia; Learning and memory ability; Neuron; Oxidative stress; Mouse

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.008.001

【中圖分類號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2015) 08-0001-05

[通訊作者]李林(1953-)，女，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)、中藥藥理學(xué)。E-mail: linlixw@126.com。

[作者簡(jiǎn)介]李雅莉(1972-)，女，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)。E-mail: yll200014@126.com。

[基金項(xiàng)目]北京市科技專項(xiàng)(Z131102002813066)，北京市高層次衛(wèi)生人才計(jì)劃項(xiàng)目(2011-1-7，2014-2-014)。