杜曉陽 王連濤 董功航

MicroRNAs是一段由18～24個核苷酸組成的小片段RNA，它能夠結(jié)合到靶基因上，抑制或降解靶基因，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNAs會參與到細胞的增殖、分化、凋亡、侵襲、遷移等生理活動中[1, 2]。近年來，隨著對miR-150等microRNAs研究的逐漸深入，越來越多的研究成果證實其可參與到腫瘤的形成、進展與對化療發(fā)生耐藥的過程中[3-5]。但是，目前miR-150在結(jié)直腸癌細胞中發(fā)揮的作用尚不明確。為了探索miR-150對結(jié)直腸癌患者腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力的影響，我們采集7例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織樣本進行細胞培養(yǎng)、RNA提取及miR-150表達水平的檢測，探索過表達的miR-150對腫瘤細胞產(chǎn)生的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究中7例結(jié)直腸癌患者的樣本均采集于我院及中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院收治的患者，結(jié)直腸癌細胞系CACO2，HCT-116，HT-29，SW620均購自中科院上海細胞生物研究所。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 TRNzol RNA提取試劑， miR-150特異引物、microRNAs RT-qPCR試劑盒、RNA酶抑制劑，micrON ? hsa-miR-150-5p mimic、micrON ? hsa-miR-NC mimic、riboFECT ? CP，Lipofectamine 2000。

1.2.2 主要儀器 PCR 擴增儀，ABI 7500 Real-Time PCR system，倒置熒光顯微鏡，細胞計數(shù)器，電子顯微鏡，BD侵襲小室。

2 主要方法及步驟

2.1 細胞培養(yǎng)

取適量的完全培養(yǎng)基重懸細胞，接種于培養(yǎng)皿中，在5%CO2、37℃的恒溫箱中進行培養(yǎng)，每兩天換液一次。在六孔板上按照適當(dāng)?shù)拿芏冉臃NCACO2，HCT-116，HT-29，SW620各一孔，在細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，當(dāng)其密度達到80%-90%時對其RNA進行消化提取。

2.2 RNA的提取及miR-150的表達檢測

2.2.1 RNA的提取 將在對7例結(jié)直腸癌患者施行手術(shù)的過程中采集的腫瘤組織標(biāo)本打碎至呈勻漿狀。將氯仿（每使用1毫升的TRNzol試劑應(yīng)加入0.2ml的氯仿）加入此勻漿中進行震蕩，在4℃的低溫下進行離心操作，提取上層的上清液。將異丙醇（每使用1毫升的TRNzol試劑應(yīng)加入0.5ml的異丙醇）加入到此上清液中進行震蕩，在4℃的低溫下進行離心操作。將此上清液倒出后，將濃度為75%的酒精（每使用1毫升的TRNzol試劑應(yīng)加入1ml濃度為75%的酒精，并用已脫酶水進行配制）加入管中洗滌沉淀，進行震蕩，在4℃的低溫下進行離心操作。棄去上清液，在真空抽干機中將剩余的酒精除去，加入40-60ml的 DEPC水，在水浴器（55-60℃）中放置 10min，以溶解RNA。用分光光度計檢測RNA的質(zhì)量及濃度。提取貼壁細胞RNA的方法大致同上。

2.2.2 MiR-150的表達水平檢測 RT:配制逆轉(zhuǎn)錄工作液，在每個樣品中提取2-3ul的RNA溶液，置于離心管中，依次加入逆轉(zhuǎn)錄體系中必須的試劑（總體系為25ul）進行震蕩與離心操作，然后置于PCR儀上，設(shè)定儀器的運行條件為37℃ 60min-85℃ 5min。qPCR:配制qPCR工作液，在使用cDNA前需用DEPC水將其稀釋20-100倍，按照All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit (Gene Copoeia)試劑盒的說明書配制qPCR的工作體系，使最終體系達到20ul，用配好的八連管進行震蕩與離心操作，將qPCR工作液置于7500 real-time PCR system上，設(shè)定條件為95℃10min-95℃ 10 seconds-60℃ 1min，進行40個循環(huán)。從7500 Software v2.0.6 中獲得相關(guān)的數(shù)據(jù)。

2.3 miR-150轉(zhuǎn)染細胞

2.3.1 細胞的準(zhǔn)備 在進行miR-150轉(zhuǎn)染前一天將HCT-116細胞（0.25×106/孔）和 HT-29細胞（0.4×106/孔）接到6孔板上，當(dāng)細胞的密度增長到50%時對其進行轉(zhuǎn)染。

2.3.2 配制轉(zhuǎn)染工作液 將250ul/孔 的OPTI-MEM和5ul的 miR-150 mimic、250ul/孔 的 OPTI-MEM 和 5ul的Lipofacetime 2000同時進行混合，并進行輕輕吹打，在放置5分鐘后將這兩種預(yù)混液混合在一起，在放置20分鐘后再加入到需進行轉(zhuǎn)染的細胞中。

2.3.3 轉(zhuǎn)染 去除原來的培養(yǎng)液，把已配好的轉(zhuǎn)染混合液加入到生長密度達到70%的細胞中，再以1.5ml/孔的1640完全培養(yǎng)基補齊培養(yǎng)混合液，在二氧化碳恒溫箱中培養(yǎng)5個小時后更換新鮮不含抗生素的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24個小時。

2.4 細胞侵襲試驗

2.4.1 侵襲試驗 在將細胞轉(zhuǎn)染后進行一天的培養(yǎng)，制作細胞懸液，將細胞的密度調(diào)整為5×105/ml，取細胞懸液100μl加入到已解凍的Transwell上室，并在其下室加入600μl含10%PBS的培養(yǎng)基，在對照孔的下室加入不含血清的培養(yǎng)基，在5%CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48個小時。

2.4.2 細胞計數(shù) 在將細胞培養(yǎng)48個小時后，取出Transwell小室，棄去孔中的培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，用4%的多聚甲醛固定15～30分鐘，將小室適當(dāng)風(fēng)干，用0.1%的結(jié)晶紫染色15～20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移的細胞，用PBS洗3遍。在200倍或400倍的顯微鏡下隨機選擇5～10個視野觀察細胞并進行計數(shù)。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，用GraphPad Prism 5.0 軟件進行繪圖分析，本研究中的數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，組間差異用獨立樣品T檢驗進行分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 MiR-150在本組7例結(jié)直腸癌患者的癌組織與癌旁組織及細胞系中表達的水平

本組7例結(jié)直腸癌患者的癌組織與癌旁組織中miR-150的表達水平見圖1A。與在癌組織中表達的水平相比，miR-150在本組患者癌旁組織中表達的水平有不同程度的升高，最高達167倍。將本組患者各結(jié)直腸癌細胞系按照MiR-150的表達水平（從高到低）進行排序的情況是：HT-29，HCT-116，SW620，CACO2。詳情見圖1B。

圖1 A：miR-150在7例患者的癌組織與癌旁組織中的表達水平的比較圖1B：miR-150在CACO2、HCT-116、HT-29和SW620的表達水平的曲線

圖2 ：在HCT-116和HT-29中過表達的MiR-150對腫瘤細胞侵襲、遷移能力的影響

4.2 在結(jié)直腸癌細胞系中過表達的miR-150對腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響

在結(jié)直腸癌細胞系HCT-116和HT29中存在過表達的miR-150，構(gòu)建過表達miR-150的結(jié)直腸腫瘤細胞系進行分析，結(jié)果顯示，存在miR-150過表達的HCT-116和HT29腫瘤細胞穿過屏障被染色的5個顯微鏡高倍視野的均數(shù)為46與54，其侵襲力分別降低1.9倍和1.5倍，可見過表達的miR-150能夠明顯降低腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。詳情見圖2。

5 討論

據(jù)報道，miR-150的異常表達與結(jié)直腸癌細胞的惡性程度、此病患者的臨床療效及預(yù)后密切相關(guān)[6]，但其具體調(diào)控的分子通路及機制目前仍不明確。我們對7例結(jié)直腸癌患者的7對癌組織及癌旁組織進行了miR-150表達水平的定量分析，結(jié)果顯示，miR-150在癌旁組織中表達的水平普遍高于其在癌組織中表達的水平。我們在對結(jié)直腸癌細胞系中過表達的miR-150進行分析后發(fā)現(xiàn)，過表達的miR-150能夠明顯降低結(jié)直腸癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。這一研究結(jié)果與秦教授和馬博士的研究結(jié)果相一致[6]。該研究對比分析了大樣本量的正常組織、腺瘤組織與癌組織中miR-150的表達水平，并研究了對腫瘤患者進行隨訪的資料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤組織惡性程度的升高，其中miR-150的表達水平會相應(yīng)下降?？梢姡琺iR-150的表達水平與腫瘤的惡性程度、腫瘤患者對化療的敏感性及其預(yù)后有關(guān)。miR-150的表達水平越低，腫瘤患者對化療的敏感度越低，其預(yù)后越差。我們猜測，miR-150的表達水平在癌旁組織中較高的主要原因可能是，癌旁組織中細胞的自我保護機制可被激活，使miR-150在癌旁組織中的反應(yīng)性增高，并抑制腫瘤細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，進而可抑制腫瘤細胞的生長。有文獻指出，在肺癌[7]及胃癌[8]組織中，miR-150能抑制腫瘤細胞的凋亡及促進其增殖，對腫瘤的發(fā)生、進展有促進的作用。在我們的研究中，miR-150在癌旁組織中呈高表達，可作為抑癌因子抑制腫瘤的生長。

MicroRNAs對生命過程的調(diào)控主要是通過調(diào)控其靶基因的表達來完成的。采用生物信息學(xué)的方法進行分析，我們預(yù)測miR-150可調(diào)控幾百個靶基因，但目前在腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)的靶基因較少。MUC4及ZEB1基因分別在胰腺癌及食管癌細胞中得到確認。MUC4是廣泛存在于人體組織中的跨黏膜蛋白。Sanjeev K.Srivastava在其研究中證實，MUC4在胰腺惡性腺瘤及其腫瘤細胞系中的表達量比在正常胰腺組織中的表達量更高。在其他的惡性腫瘤中，MUC4的表達量也可發(fā)生異常的改變。MUC4具有促進胰腺癌腫瘤細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。MUC4的3‵端非編碼序列中含有miR-150能結(jié)合的高度保守序列。研究證實，miR-150能夠直接與MUC4結(jié)合，下調(diào)MUC4表達的水平，抑制腫瘤細胞的生長、克隆形成、遷移及侵襲，加強細胞間的粘附作用，抑制腫瘤的進展。我們運用熒光定量PCR法檢測7例結(jié)直腸癌患者的癌及癌旁組織中miR-150的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其癌旁組織中miR-150的表達水平明顯高于其癌組織中miR-150的表達水平。關(guān)于miR-150細胞功能的實驗結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌細胞系過表達的miR-150能夠抑制腫瘤細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移?？梢?，miR-150在惡性腫瘤組織中可下調(diào)MUC4的表達，抑制腫瘤的生長、集落形成、遷移與侵襲，增強PC細胞間的粘附能力[2]，進而起到抑制腫瘤生長的作用。

Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT)能 夠 增強腫瘤細胞的遷移及侵襲能力[9]。已有研究成果證實，ZEB1，ZEB2與EMT的發(fā)生有直接的關(guān)系[10]?；熢雒粢蜃?TNF-α 在對腫瘤進行化療的過程中可起到重要的作用。EMT能夠誘導(dǎo)TNF-α抵抗的產(chǎn)生，在腫瘤的發(fā)展中可被異常激活，使腫瘤細胞的侵襲力增強，增加腫瘤的轉(zhuǎn)移率與治愈后的復(fù)發(fā)率，并可導(dǎo)致腫瘤細胞耐藥。Takehiko Yokobori在其研究中證實，miR-150能夠下調(diào)ZEB1的表達水平，抑制EMT、腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移及耐藥性的發(fā)生。ZEB1在結(jié)直腸癌侵襲與轉(zhuǎn)移的過程中扮演著至關(guān)重要的角色。在將來的工作中，我們會構(gòu)建穩(wěn)定表達miR-150的細胞系，再一次驗證miR-150的功能，驗證MUC4及ZEB1在結(jié)直腸癌細胞系中為miR-150直接靶基因的理論。

本研究的結(jié)果證實，miR-150在結(jié)直腸腫瘤細胞中的高表達能明顯降低其侵襲及轉(zhuǎn)移的能力，抑制其生長。我們有理由相信，miR-150能夠通過抑制MUC4及ZEB1基因的表達來抑制腫瘤細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，進而可控制腫瘤的發(fā)展。隨著對MiR-150在結(jié)直腸癌中發(fā)揮作用的深入了解，我們深信其有可能成為將來治療結(jié)直腸癌的潛在靶點，上調(diào)其在結(jié)直腸癌患者體內(nèi)表達的水平可抑制腫瘤的生長，增加患者對化療的敏感性，提高患者的臨床療效，改善患者的預(yù)后。

[1] Karaayvaz M, Zhai H, Ju J. miR-129 promotes apoptosis and enhances chemosensitivity to 5-fluorouracil in colo rectal cancer.[J]. Cell Death Dis,2013,4:e659.

[2] Srivastava S K, Bhardwaj A, Singh S, et al. MicroRNA-150 directly targets MUC4 and suppresses growth and maligna nt behavior of pancreatic cancer cells.[J]. Carcinogenes is,2011,32(12):1832-1839.

[3] Esquela-Kerscher A, Slack F J. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer.[J]. Nat Rev Cancer,2006,6(4):259-269.

[4] Cho W C. OncomiRs: the discovery and progress of micro RNAs in cancers.[J]. Mol Cancer,2007,6:60.

[5] Garofalo M, Croce C M. MicroRNAs as therapeutic targets in chemoresistance.[J]. Drug Resist Updat,2013.

[6] Ma Y, Zhang P, Wang F, et al. miR-150 as a potential bio marker associated with prognosis and therapeutic outco me in colorectal cancer.[J]. Gut,2012,61(10):1447-1453.

[7] Zhang N, Wei X, Xu L. miR-150 promotes the proliferation of lung cancer cells by targeting P53.[J]. FEBS Lett,2013,587(15):2346-2351.

[8] Wu Q, Jin H, Yang Z, et al. MiR-150 promotes gastric can cer proliferation by negatively regulating the pro-apop totic gene EGR2.[J]. Biochem Biophys Res Commun,2010,392(3):340-345.

[9] Zhou C, Nitschke A M, Xiong W, et al. Proteomic analysis of tumor necrosis factor-alpha resistant human breast cancer cells reveals a MEK5/Erk5-mediated epithelial-me senchymal transition phenotype.[J]. Breast Cancer Res,2008,10(6):R105.

[10] Casas, E., et al.. Snail2 is an essential mediator of Twi st1-induced epithelial mesenchymal transition and meta stasis. Cancer Res 71, 245-254 (2011).