呂 曼 類彥立 李鐵剛

(1. 中國科學院海洋研究所海洋生物分類與系統(tǒng)演化實驗室 青島 266071; 2. 國家海洋局第一海洋研究所海洋沉積與環(huán)境地質國家海洋局重點實驗室 青島海洋科學與技術國家實驗室海洋地質過程與環(huán)境功能實驗室 青島 266061;3. 中國科學院大學 北京 100049)

有孔蟲(Foraminifera)門隸屬于原生動物界, 目前已知化石種約36000種, 現(xiàn)生種約4000—6000種,大部分為海洋底棲種類(Sen Gupta, 1999)。有孔蟲因其殼體可長期保存在海洋水體及沉積物中, 因此在古海洋學等學科研究中有重要價值(汪品先等, 1980,1988)。另外在環(huán)境指示(Eichler et al, 2012)、生態(tài)評估(Boucheta et al, 2012)以及海洋生態(tài)系統(tǒng)的能量流動與物質循環(huán)中, 都扮演著重要角色。

現(xiàn)生有孔蟲有鈣質玻璃殼、鈣質瓷質殼、砂質殼(膠結殼)和無殼(蛋白質膜)等多種類型。其中玻璃質類底棲有孔蟲 Ammonia(Brünnich, 1772)是中國近海重要的優(yōu)勢類群, 常以優(yōu)勢種出現(xiàn), 在中國各海域均見報道(汪品先等, 1980; 成鑫榮, 1987; 李保華等,2008; 趙泉鴻等, 2009; 李小艷等, 2010; 類彥立等,2015)。這類有孔蟲常被用來指示濱岸和低鹽等海洋環(huán)境, 具有重要的生態(tài)價值(郝詒純等, 1980; 汪品先等, 1980)。

Ammonia是最早被確定為有孔蟲的一個屬, 其種類之多、形態(tài)變異之大使得這類有孔蟲的分類鑒定尤為困難和混亂(Holzmann et al, 2000; Hayward et al,2004), 同樣的困難也存在于其他類群的有孔蟲。而分子技術的應用為解決這一難題提供了新的思路(Pawlowski et al, 2010, 2014, 2013)。有孔蟲分子生物學研究已經有較長的歷史(Langer et al, 1993), 對于Ammonia屬的分子鑒定多基于對編碼核糖體RNA基因的序列分析, 這方面的工作在國外已經有很多報道(Pawlowski et al, 1994b, 1995; Hayward et al, 2004),而國內的開展尚未普及(徐美香等, 2004; 李保華等,2005, 2007): 技術應用的不成熟、相關數據庫信息量太少等都是其限制因素。

眾所周知, 有孔蟲很難在實驗室培養(yǎng)并且繁殖,而且野外采樣也受到時間和空間的限制。因此, 如何有效保存有孔蟲的 DNA以用于后續(xù)研究, 是有孔蟲分子生物學研究能夠廣泛開展的前提。海洋生物常用的保存方式有冷凍、乙醇固定及福爾馬林固定等。但有研究指出后兩種化學固定方法并不適用于有孔蟲(Holzmann et al, 1996)。

本工作通過參考前人研究結果(徐美香等, 2004;李保華等, 2005, 2007; Pawlowski et al, 1994b, 1995;),最終選出3種保存方法, 即烘干法、冷凍法和裂解液法, 進行了更為系統(tǒng)的有孔蟲 DNA保存方法的實驗研究。另外, 由于不同殼質類型的有孔蟲所適用的DNA提取方法不盡相同(Pawlowski, 2000)。本實驗還比較了 DOC裂解液法和 Guanidine裂解液法對Ammonia屬DNA提取效能的不同, 以期篩選出最適合玻璃質殼類底棲有孔蟲的 DNA保存和提取方法,提供適合野外采集及實驗室等不同環(huán)境下的最優(yōu)方案。進而為分子生物學在這類有孔蟲研究中的應用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 活體有孔蟲材料準備 實驗所用的有孔蟲材料是2014年2月份采自青島灣潮間帶的底棲優(yōu)勢類群, 卷轉蟲屬 Ammonia spp. 經形態(tài)鑒定, 主要為Ammonia aomoriensis (Asano, 1951)與 Ammonia beccarii(Linnaeus, 1758)的混合種。把沉積物樣品置于14°C左右的培養(yǎng)箱中孵化 2天, 挑選爬到沉積物表面、殼體完整、大小均一、房室呈棕黃色、體表黏附有顆粒物的 Ammonia spp., 這樣的有孔蟲活性較好(Holzmann et al, 1996; Schweizer et al, 2005)。放到盛有過濾海水的培養(yǎng)皿中, 投喂硅藻, 在實驗室培養(yǎng) 1周。將有孔蟲小心轉移到滅菌過濾海水中, 在體視顯微鏡下, 用毛筆仔細清洗殼體表面的雜質, 準備進行DNA提取和保存實驗。

1.1.2 試劑準備 DOC裂解液(0.1mol/LTris-HCl pH8.5, 4mmol/L EDTA pH8.0, 1%DOC, 0.2%TX-100);Guanidine裂解液(4mol/L Guanidinium isothiocyanate,0.05mol/L Tris-HCl pH7.6, 0.01mol/L EDTA,0.068mol/L Sarkosyl=N-Lauroylsarcosine sodium salt,1%β-巰基乙醇)(Pawlowski, 2000); 異丙醇; 70%乙醇;1×TE Buffer; 瓊脂糖; TAE 電泳緩沖液; 2×PCR Mix(TIANGEN Golden Easy PCR System); ddH2O;PCR引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.1.3 儀器準備 PCR儀; 凝膠成像分析系統(tǒng);電泳儀; 干燥箱; 高速冷凍離心機; –20°C、–80°C 冰箱; 恒溫水浴鍋。

1.2 DNA提取方法

采用DOC裂解液和Guanidine裂解液兩種處理方法提取Ammonia DNA, DOC裂解液法設置2個平行組, Guanidine裂解液法設置3個平行組, 每個平行組均為單個樣本。實驗操作如下:

1.2.1 DOC裂解液法 取一只清洗過的Ammonia實驗樣品放置在含50μL DOC裂解液的1.5mL無菌離心管中, 研磨使殼破碎。于60°C水浴孵化1h。10000 r/min離心5min, 去除不溶物。所得即為基因組DNA,于 –20°C 保 存 (Holzmann et al, 1996; Pawlowski,2000)。

1.2.2 Guanidine裂解液法 取一只清洗過的Ammonia實驗樣品放置在含 50μL Guanidine裂解液的 1.5mL無菌離心管中, 研磨使殼破碎。60°C加熱15min, 或室溫過夜。8000 r/min離心 1min, 取上清液。加入與第一步中Guanidine裂解液等量的異丙醇,混勻。在–20°C沉淀至少2h, 或過夜。最大轉速離心15min, 移去上清液, 注意不要擾動沉淀。用 100μL 70%乙醇洗滌沉淀物, 最大轉速離心1min, 移去上清液。將沉淀物真空干燥5—10min, 或者室溫下干燥更長時間。用15—20μL 1×TE Buffer溶解沉淀物, 在4°C放置至少1h, 或過夜, 期間取出渦旋數次。所得即為基因組 DNA, 于–20°C 保存(Pawlowski, 2000)。

1.3 DNA保存方法

對實驗樣品分別進行烘干、冷凍和裂解液保存等3種方法處理。鑒于預實驗以及 Holzmann等(1996)的實驗結果, 加之實驗樣品數量限制, 為了最大限度進行實驗研究, 進行如下實驗設計: 烘干法共 11個處理組, 未設平行組; 冷凍法共 4個處理組, 每個處理設2個平行組; 裂解液法共6個處理組, 每個處理設2個平行組。采用1.2.1中介紹的DOC法提取DNA。具體操作如下:

1.3.1 烘干保存法 取清洗好的 Ammonia實驗樣品放置在 1.5mL無菌離心管中, 每管一只。分別在溫度為 20、30、40、50、60、70、80、90、100、110和 120°C烘干 30min, 每個溫度組烘干 11只。每個溫度組各取一只, 立即提取 DNA。其余的在室溫下保存, 之后每周取每個溫度組的一個樣本提取DNA, 連續(xù)進行10周實驗。每次實驗均取一只活的Ammonia提取DNA作為陽性對照, 另用無菌水做空白對照。

1.3.2 冷凍保存法 取清洗好的 Ammonia實驗樣品放置在1.5mL無菌離心管中, 每管一只。設以下4個冷凍組: 在無水和 50μL無菌過濾海水中分別在–20°C和–80°C下冷凍。之后每周對每個冷凍組提取DNA, 連續(xù)進行8周實驗, 提取前需要解凍并排出海水。設置陽性和空白對照。

1.3.3 裂解液保存法 為比較裂解液中是否含有EDTA對于Ammonia DNA保存效果的差異, 進行如下實驗。取清洗好的Ammonia實驗樣品放置在1.5mL無菌離心管中, 每管一只。設以下6個實驗組: 分別在2種裂解液(含4mmol/L EDTA的DOC以及不含EDTA 的 DOC)、3 種溫度(室溫、4°C、–20°C)下對樣品進行保存實驗。之后每周對每個實驗組提取DNA,連續(xù)進行8周實驗。設置陽性和空白對照。

1.4 DNA檢測方法

基于核糖體 RNA(rRNA)基因大亞基(large subunit, LSU)片段的序列分析在 Ammonia屬種類鑒定等方面的研究中已經有很好的應用(Pawlowski et al, 1994a, 1995; Holzmann et al, 1996, 2000; Schweizer et al, 2011)。

本實驗運用 PCR技術, 對所有實驗組提取的DNA, 擴增其 LSU rRNA基因片段(大約 750bp), 取4μL擴增產物, 經 1.0%瓊脂糖凝膠(TAE緩沖液,110V)電泳 20min、EB染色 10min, 然后用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。通過分析電泳條帶質量判斷所提取的DNA質量。DNA提取方法組的比較, 是直接觀察電泳圖條帶的質量并結合后期測序結果; DNA保存方法組的比較, 是在獲得電泳圖之后, 用 ImageJ軟件對電泳圖中目的條帶的亮度進行定量分析, 用“灰度值”表示定量分析的結果, PCR條帶的亮度或者灰度值可用于間接反映DNA保存的質量(宋鋒等, 2010)。

PCR 引物: 正向 2TA(5′CACATCAGCTCGAGT GAG3′), 反向 L1F(5′ACTCTCTCTTTCACTCC3′)。反應體系: 25μL (2×PCR Mix 12.5μL, 10μmol/L 的正反向引物各 0.5μL, DNA 模板 2μL, ddH2O 9.5μL)。反應條件: 95°C 預變性 60s; 94°C 變性 30s、52°C 退火 30s、72°C延伸90s, 共34個循環(huán); 72°C延伸3min。

1.5 數據統(tǒng)計分析

對電泳條帶的亮度量化后, 用 SPSS19.0軟件包中有關的方差分析做數據統(tǒng)計分析, 采用LSD檢驗。比較Ammonia DNA的保存效果在不同處理方法、不同保存時間組之間的差異。

2 結果與結論

2.1 DNA提取方法比較

由圖1可以看出, 經DOC 裂解液法和Guanidine裂解液法提取到的DNA, 在PCR擴增之后都能得到整齊、單一、明亮的、與目標條帶大小一致的條帶, 且后續(xù)測序結果證實是目標條帶。證明這兩種方法所提取的Ammonia屬有孔蟲DNA的濃度和純度都能滿足后續(xù)PCR的需求。但是DOC裂解液法比Guanidine法操作更簡單, 試劑更便宜, 所以前者更適合Ammonia屬有孔蟲DNA的提取。

圖1 兩種DNA提取方法的PCR擴增電泳圖譜Fig.1 Gel electrophoreses of PCR products obtained from two methods of DNA extraction

2.2 DNA保存方法比較

2.2.1 烘干保存法 經 ImageJ軟件分析各組的PCR條帶所得灰度值見表1。用SPSS19.0做單因素方差分析, 采用LSD檢驗。結果顯示20°C組和30°C顯著高于40°C組(P＜0.05), 從均值圖看 20°C組結果最好, 但未與30°C組產生顯著差異(圖2)。綜合考慮實驗的簡便性和保存結果的優(yōu)異性, 建議 20°C為最佳烘干溫度。另外, 比較第0、1、2周的結果發(fā)現(xiàn), 三組間沒有顯著差異(P＞0.05), 表明烘干后立即提取DNA和保存一段時間之后提取的結果無顯著差異。到第10周灰度值有顯著下降(P＜0.05), 說明保存時間超過10周樣品DNA可能會有顯著降解。

表1 烘干保存各實驗組PCR條帶的灰度值Tab.1 The gray value of PCR products amplified from samples preserved in air-dry method

圖2 烘干保存法的PCR擴增電泳圖譜Fig.2 Gel electrophoreses of PCR products preserved in air-dry method

2.2.2 冷凍保存法 各組的PCR條帶灰度值見表2(以均值表示)。用SPSS19.0作3因素單變量方差分析, 不同時間組采用LSD檢驗。結果顯示–80°C組均值高于–20°C組, 但未達到統(tǒng)計上的顯著水平(P＞0.05)。無水組結果顯著好于有水組(P＜0.05)。不同保存時間之間沒有顯著差異, 直到第8周, 各組依然有較好的結果(圖 3)。因此, 采用–20°C 或–80°C 無水條件對Ammonia屬有孔蟲進行冷凍處理, 至少 8周以內其DNA都有較好的保存效果。

2.2.3 裂解液保存法 各組的 PCR條帶灰度值見表 2(以均值表示)。統(tǒng)計分析方法與“冷凍保存組”相同。均值比較結果顯示4°C組效果比室溫和–20°C組好, 含EDTA組比不含EDTA組效果好, 但都沒有達到統(tǒng)計上的顯著水平(P＞0.05)。不同保存時間之間沒有顯著差異, 直到第8周, 各處理組依然有較好的結果(圖 4)。因此, 若采用 DOC裂解液保存Ammonia屬有孔蟲的DNA, 建議選擇4°C含EDTA的裂解液,至少8周以內對DNA都有較好的保存效果。

2.2.4 三種方法總體比較 分別選取烘干法、冷凍法和裂解液法中保存效果最好的組, 比較它們之間的差異。烘干法選取 20°C, 1—8周組; 冷凍法選取–80°C無水, 1—8周組; 裂解液法選取4°C含EDTA,1—8周組。結果顯示組間有顯著差異: 冷凍法優(yōu)于烘干法, 烘干法優(yōu)于裂解液法(P＜0.05)。因此, 最適合鈣質玻璃殼底棲有孔蟲的 DNA保存方法為–80°C無水條件下冷凍; 若–80°C 冷凍條件不可得, 可用–20°C冷凍代替, 但對樣品的有效保存時間可能不如–80°C條件下長。

表2 冷凍保存及裂解液保存各實驗組PCR條帶的灰度值Tab.2 The gray value of PCR products amplified from samples preserved in freezing and lysis buffer method

圖3 冷凍保存8周的PCR擴增電泳圖譜Fig.3 Gel electrophoreses of PCR products preserved in freezing method for 8 weeks

圖4 裂解液保存8周的PCR擴增電泳圖譜Fig.4 Gel electrophoreses of PCR products preserved in lysis buffer for 8 weeks

3 討論

玻璃質類底棲有孔蟲是我國近海最常見的優(yōu)勢有孔蟲類群之一, 在潮間帶該類群可占整體有孔蟲群落的30%—70%, 其群落結構有重要的生態(tài)指示意義(Murry, 1991; 李保華等, 2008; 李小艷等, 2010)。對有孔蟲準確的分類鑒定是研究其群落結構的前提;尤其是對Ammonia屬為代表的玻璃質有孔蟲, 形態(tài)鑒定較為混亂(類彥立等, 2015), 分子鑒定手段的應用對彌補傳統(tǒng)形態(tài)學分類的不足具有重要作用(Pawlowskiet al, 1994b, 1995)。然而國內在現(xiàn)生有孔蟲分子生物學方面的研究還幾乎處于空白期。工作的一大難點在于分子技術的應用, 例如DNA提取方面,由于經常有微生物與有孔蟲共生等原因導致很難獲得純的有孔蟲DNA(Holzmannet al, 1996; Pawlowski,2000)。加之作為單細胞原生動物, 有孔蟲DNA拷貝量比起其他多細胞動物要小得多, 使用單個樣本提取出滿足PCR要求的基因組DNA困難較大; 而對多樣本提取 DNA時很難保證所有樣本是同一個種, 尤其對于像Ammonia這樣的形態(tài)鑒定疑難類群。研究中常常需要在對樣品提取DNA的同時, 借助SEM等技術進行形態(tài)鑒定。因此, 干燥之后的樣品還能穩(wěn)定提取 DNA, 并且滿足后續(xù) PCR擴增, 對于有孔蟲分子生物學研究非常重要。另外, 某些有孔蟲類群的rRNA基因有高度的細胞內變異, 給 DNA測序工作帶來了一定的困難(Pawlowski, 2000)。

對有孔蟲 DNA進行有效保存是進行后續(xù)分子鑒定的前提。Holzmann等(1996)對Ammonia的DNA保存方法進行了一些研究, 但除了 30°C干燥保存外, 其余方法所探索的保存時間都不超過5周。國內未見有專門研究有孔蟲 DNA保存方法的報道。本研究進行了更多的保存方法以及更長的保存周期(8至 10周)的實驗探索, 各種方法各有優(yōu)缺點,以期滿足不同保存時間以及不同條件下(如野外或實驗室等)的需求。

有孔蟲基因結構的一些獨特之處, 例如 SSU rRNA和LSU rRNA基因序列不僅擁有不同尋常的長度, 而且存在很大的種內變異(Pawlowski, 2000), 使得一些種類的核糖體基因很難成功擴增。另外個體大小、蟲體活性、有殼等因素都限制了有孔蟲DNA提取的成功率。因此, 即使是對新鮮樣品直接提取DNA,也不一定能夠成功進行 PCR擴增。這也可能是導致相同實驗條件下結果相差很大的原因(例如圖3中4、5號條帶以及圖4中2、3號條帶)。

由于本實驗中使用了2TA-L1F和2TA-L7兩對引物進行巢式PCR擴增(Schweizer et al, 2011), DOC裂解液法提取DNA后PCR結果出現(xiàn)雙帶(如圖1a中1、2號條帶所示)。有研究顯示Ammonia屬LSU rRNA基因的擴增可能不需要巢式 PCR(Holzmann et al,1996)。本研究通過對擴增出的雙帶進行測序, 表明它們分別是引物2TA-L1F及2TA-L7擴增的產物, 從而證實Ammonia屬LSU rRNA基因的擴增不需要巢式PCR。

有報道指出 EDTA對有孔蟲的殼有破壞作用(Seears et al, 2014)。在本實驗過程中, 每次提DNA之前均對樣品鏡檢, 發(fā)現(xiàn)用含 EDTA裂解液保存的Ammonia樣品的殼溶解程度比不含EDTA組的更嚴重; 在室溫和4°C保存的Ammonia樣品的殼溶解程度比–20°C組的更嚴重。推測隨著殼的逐漸溶解, 原本由殼保護著的核物質可能會受到某種影響。為了探索這種影響對Ammonia DNA保存效果造成的差異, 本實驗分別檢驗了含與不含EDTA的裂解液對于Ammonia DNA的保存效果, 前者效果普遍比后者好。

綜上所述, 本研究以玻璃質殼類底棲有孔蟲的代表類群Ammonia spp.為材料, 比較了3種DNA保存方法(烘干、冷凍、DOC裂解液)以及2種DNA提取方法(DOC 裂解液法、Guanidine裂解液法)。實驗結果表明: (1) 烘干保存法中 20°C為最佳烘干溫度,保存時間超過10周樣品DNA可能會有顯著降解; 冷凍保存法中–20°C和–80°C冷凍保存直至第8周樣品DNA依然較完好; DOC裂解液保存法中樣品用含EDTA的裂解液在4°C保存效果較好, 至少可以保存8周。(2) 從對有孔蟲DNA保存效果來看, –80°C無水條件下冷凍效果最佳; 烘干保存法使得有孔蟲形態(tài)鑒定與分子鑒定可以更好地結合; 裂解液法保存則可以很方便地直接進行后續(xù) DNA提取實驗, 較適合短期保存。3種保存方法各有優(yōu)缺點, 可根據不同實驗需求進行選擇。(3) DOC裂解液法和 Guanidine裂解液法對玻璃質類有孔蟲 DNA提取效果都很好,但前者更經濟且操作簡便。

4 結論

玻璃質殼類底棲有孔蟲DNA保存和提取優(yōu)化方案如下:

DNA保存:

保存法1——烘干法:

A. 設備器皿準備:

干燥箱、1.5mL無菌離心管。

B. 操作步驟:

(1) 取單只實驗樣品, 于無菌過濾海水中洗凈;

(2) 蟲體置于1.5mL無菌離心管中, 于20—30°C干燥30min;

(3) 在提取DNA之前于室溫、密封保存。

保存法2——冷凍法:

A. 設備器皿準備:

–20°C冰箱、–80°C超低溫冰箱、1.5mL無菌離心管。

B. 操作步驟:

(1) 取單只實驗樣品, 于無菌過濾海水中洗凈;

(2) 蟲體置于1.5mL無菌離心管中, 密封;

(3) 在提取 DNA 之前于–20°C 或–80°C 冷凍保存。

保存法3——裂解液法:

A. 設備和試劑準備:

(1) 設備器皿: 4°C冷藏箱、1.5mL無菌離心管;

(2) 試劑: DOC裂解液(Pawlowski, 2000)。

組分:

TRIS 1mol/L pH 8.5 100μL

EDTA 0.5mol/L (pH 8.0) 8μL

DOC (Na deoxycholate) 10% 100μL

TX-100 10% 20μL

H2O 780μL

B. 操作步驟:

(1) 取單只實驗樣品, 于無菌過濾海水中洗凈;

(2) 蟲體置于 1.5mL無菌離心管中, 加入含4mmol/L EDTA的DOC裂解液;

(3) 在提取DNA之前于4°C保存。

DNA提取:

A. 設備和試劑準備:

(1) 設備器皿: 水浴鍋、高速離心機、1.5mL無菌離心管;

(2) 試劑: DOC裂解液, 組分同“保存法3”。

B. 操作步驟:

(1) 取單只實驗樣品, 于無菌過濾海水中洗凈;

(2) 蟲體置于 1.5mL無菌離心管中, 加入 50μL DOC裂解液;

(3) 將蟲體徹底研磨碎, 于60°C水浴孵化1h;

(4) 10000r/min離心5min, 去除不溶物;

(5) 上清液中即為提取的基因組 DNA, 于–20°C保存。

致謝 感謝同濟大學海洋與地球科學學院的翦知湣教授給予類彥立在有孔蟲研究中的無私建議和指導, 另外中國科學院南京地質與古生物研究所李保華研究員曾共同探討, 感謝 Paul Br?nniman Foundation 2015基金以及Prof. Dr. Jan W. Pawlowski(University of Geneva, Switzerland)給予方法學討論,中國科學院海洋研究所實驗員王雪皎、鄭萌萌、曹麗娜協(xié)助工作。謹致謝忱。

成鑫榮, 1987. 長江口表層沉積物中活有孔蟲分布的初步研究.海洋地質與第四紀地質, 7(1): 73—79

李小艷, 石學法, 程振波等, 2010. 渤海萊州灣表層沉積物中底棲有孔蟲分布特征及其環(huán)境意義. 微體古生物學報,27(1): 38—44

李保華, Ertan K T, Hemleben C, 2005. 有孔蟲分子生物學研究進展. 自然科學進展, 15(5): 534—538

李保華, 王曉燕, 龍江平, 2008. 海南島近岸沉積物中的有孔蟲特征與分布. 微體古生物學報, 25(3): 225—234

李保華, 李鐵剛, Ertan K T等, 2007. 西北太平洋浮游有孔蟲的 SSU rDNA序列及其古海洋學意義. 自然科學進展,17(3): 391—395

汪品先, 章紀軍, 閔秋寶, 1980. 東海表層沉積物中有孔蟲的分布. 見: 海洋微體古生物論文集. 北京: 海洋出版社,20—38

汪品先, 章紀軍, 趙泉鴻等, 1988. 東海底質中的有孔蟲和介形蟲. 北京: 海洋出版社. 1—307

宋 鋒, 孫 敏, 羅克明, 2010. 一種基于PCR技術鑒定單拷貝轉基因煙草的方法. 中國生物工程雜志, 30(4): 83—88

趙泉鴻, 湣翦知, 張在秀等, 2009. 東海陸架泥質沉積區(qū)全新世有孔蟲和介形蟲及其古環(huán)境應用. 微體古生物學報,26(2): 117—128

郝詒純, 裘松余, 林甲興等, 1980. 有孔蟲. 北京: 科學出版社,1—224

類彥立, 李鐵剛, 2015. 奧茅卷轉蟲 Ammonia aomoriensis(Asano, 1951)與畢克卷轉蟲Ammonia beccarii (Linnaeus,1758) (有孔蟲)的分類學以及在黃東海分布的溫鹽深特征比較研究. 微體古生物學報, 32(1): 1—19

徐美香, 趙泉鴻, 肖 湘, 2004. 南海沉積物中有孔蟲分子生物學鑒定的初步研究. 臺灣海峽, 23(3): 354—359

Boucheta V M P, Alvea E, Rygg B et al, 2012. Benthic foraminifera provide a promising tool for ecological quality assessment of marine waters. Ecological Indicators, 23:66—75

Eichler P P B, Eichler B B, Gupta B S et al, 2012. Foraminifera as indicators of marine pollutant contamination on the inner continental shelf of southern Brazil. Marine Pollution Bulletin, 64(1): 22—30

Hayward B W, Holzmann M, Grenfell H R et al, 2004.Morphological distinction of molecular types in Ammonia-towards a taxonomic revision of the world’s most commonly misidentified foraminifera. Marine Micropaleontology, 50(3—4): 237—271

Holzmann M, Pawlowski J, 1996. Preservation of foraminifera for DNA extraction and PCR amplification. Journal of Foraminiferal Research, 26(3): 264—267

Holzmann M, Pawlowski J, 2000. Taxonomic relationships in the genus Ammonia (Foraminifera) based on ribosomal DNA sequences. Journal of Micropalaeontology, 19(1): 85—95

Langer M R, Lipps J H, Piller W E, 1993. Molecular paleobiology of protists: Amplification and direct sequencing of foraminiferal DNA. Micropaleontology, 39(1): 63—68

Murry J W, 1991. Ecology and Palaeoecology of Benthic Foraminifera. New York: John Wiley and Sons Inc., 397

Pawlowski J, 2000. Introduction to the molecular systematics of foraminifera. Micropaleontology, 46(S1): 1—12

Pawlowski J, Bolivar I, Fahrni J et al, 1994b. Taxonomic identification of foraminifera using ribosomal DNA sequences. Micropaleontology, 40(4): 373—377

Pawlowski J, Bolivar I, Farhni J et al, 1995. DNA analysis of“Ammonia beccarii” morphotypes: one or more species?.Marine Micropaleontology, 26(1—4): 171—178

Pawlowski J, Bolivar I, Guiard-Maffia J et al, 1994a.Phylogenetic Position of foraminifera inferred from LSU rRNA gene sequences. Molecular Biology and Evolution,11(6): 929—938

Pawlowski J, Holzmann M, 2014. A plea for DNA barcoding of foraminifera. The Journal of Foraminiferal Research, 44(1):62—67

Pawlowski J, Holzmann M, Tyszka J, 2013. New supraordinal classification of Foraminifera: molecules meet morphology.Marine Micropaleontology, 100: 1—10

Pawlowski J, Lecroq B, 2010. Short rDNA barcodes for species identification in foraminifera. The Journal of Eukaryotic Microbiology, 57(2): 197—205

Schweizer M, Pawlowski J, Duijnstee I A P et al, 2005.Molecular phylogeny of the foraminiferal genus Uvigerina based on ribosomal DNA sequences. Marine Micropaleontology, 57(3—4): 51—67

Schweizer M, Polovodova I, Nikulina A et al, 2011. Molecular identification of Ammonia and Elphidium species(Foraminifera, Rotaliida) from the Kiel Fjord (SW Baltic Sea) with rDNA sequences. Helgoland Marine Research,65(1): 1—10

Seears H A, Wade C M, 2014. Extracting DNA from within intact foraminiferal shells. Marine Micropaleontology, 109:46—53

Sen Gupta B K, 1999. Modern Foraminifera. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1—371