楊月月，遲德富，宇　佳

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，中國 哈爾濱　150040)

ABA對匍枝筋骨草防御酶活性及蛻皮激素合成的影響

楊月月，遲德富*，宇佳

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，中國 哈爾濱150040)

摘要向培養(yǎng)了7 d的匍枝筋骨草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系內(nèi)分別添加0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/L的ABA，以研究ABA對匍枝筋骨草細(xì)胞防御系統(tǒng)的作用及ABA對蛻皮激素合成的影響．試驗結(jié)果表明：向培養(yǎng)7 d的懸浮體系中，添加0.1~0.4 mg/L的ABA后，懸浮細(xì)胞第4天出現(xiàn)褐化；添加0.5 mg/L的ABA后，第3天出現(xiàn)懸浮細(xì)胞褐化現(xiàn)象；添加不同質(zhì)量濃度的ABA后第4天測其懸浮細(xì)胞生長量均與對照差異不顯著；添加不同質(zhì)量濃度ABA后懸浮細(xì)胞的SOD，POD 和CAT活性在48 h內(nèi)均顯著上升，而PAL活性變化在2~24 h間不顯著，后上升；添加不同質(zhì)量濃度的ABA可使筋骨草懸浮細(xì)胞的蛻皮激素含量增高，而添加0.1 mg/L ABA，其蛻皮激素含量增高最為顯著．

關(guān)鍵詞匍枝筋骨草；β-蛻皮甾酮；ABA；抗氧化酶

Changing of Antioxidant Enzyme Activities andβ-Ecdysone Synthesis after

Adding ABA intoAjugaLobataD. Don Suspension Cell Cultures System

YANYYue-yue,CHIDe-fu*,YUJia

(School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

AbstractThis study focuses on theAjugalobataD.Don suspension cell culture system after being cultivated for 7 days. In order to study the effect of ABA to the cell defense andβ-ecdysone synthesis ofAjugalobataD.Don suspension cell culture system, five kinds of different concentration ABA from 0.1 to 0.5 mg/L were added to this system separately. The results show that theAjugalobataD.Don suspension cell became brown 4 days after addition of ABA from 0.1 to 0.4 mg/L. The cell became brown 3 days after attition of ABA with 0.5 mg/L. No matter what kinds of ABA were added, the suspension cell growing in the treated culture system have no significant difference compared with controls when observed on the 4th day. No matter what kinds of ABA were added, the activities of SOD, POD and CAT increase when observed during the 48 hours, while the activities of PAL does not change remarkably during 2 to 24 hours, but increase after 24 hours. No matter what kinds of ABA were added, the synthesis ofβ-ecdysone increase, but the change increases most significantly when 0.1mg/L ABA was added.

Key wordsAjugalobataD. Don;β-ecdysone; ABA; antioxidant enzyme

筋骨草，唇形目(Lamiales)唇形科(Lamiaceae)筋骨草屬(Ajuga)植物,一年或二年生草本，高10～30 cm,原產(chǎn)歐亞大陸[1]，我國南方地區(qū)主產(chǎn)．筋骨草的主要次生代謝物為脫皮甾酮、杯莧甾酮、筋骨草甾酮B和C、筋骨草糖、筋骨草內(nèi)酯、黃酮甙、皂甙及生物堿等[2]．國內(nèi)外對匍枝筋骨草的研究主要集中在醫(yī)藥與昆蟲方面．在醫(yī)藥上匍枝筋骨草具有清熱解毒，涼血平肝的作用．用于治療上呼吸道感染，扁桃體炎，支氣管炎，咽炎，肺炎，胃腸炎，肝炎，闌尾炎，高血壓等；外用可治跌打損傷，癰癤瘡瘍[3]．在害蟲控制方面，匍枝筋骨草蛻皮激素含量較高，提取的植物源蛻皮激素具有良好的殺蟲效果[4]，可用于植物源殺蟲劑和生長調(diào)節(jié)劑的制作，具有經(jīng)濟(jì)和環(huán)境保護(hù)的價值．

脫落酸(Abscisic Acid，ABA)是一類抑制生長，促進(jìn)植物休眠的植物激素，又稱S-誘抗素，也有“逆境激素”之稱[5]．將ABA加入細(xì)胞培養(yǎng)體系后，會介導(dǎo)植物細(xì)胞依次發(fā)生信號識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理生化水平的變化[6]，在逆境條件下ABA含量增高，提高植物抗性．在體系中添加ABA，ABA含量也會增高．近年研究發(fā)現(xiàn)，逆境條件下ABA在植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物中具有調(diào)控作用，可以誘導(dǎo)綠原酸、酚類、黃酮類和萜類物質(zhì)的增加[7]．但ABA直接誘導(dǎo)細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物卻未見報道．

ABA是一種對人畜無害，新型高效，天然的植物生長活性物質(zhì)．本文在匍枝筋骨草懸浮體系中研究ABA對匍枝筋骨草細(xì)胞防御系統(tǒng)的作用及對蛻皮激素合成的影響，為揭示ABA調(diào)控筋骨草懸浮細(xì)胞合成蛻皮激素的機制奠定基礎(chǔ)．

1試驗與方法

1.1　試驗材料

試驗選取東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院森林生物工程實驗室培養(yǎng)的懸浮匍枝筋骨草進(jìn)行繼代培養(yǎng)．

1.2　方法

1.2.1懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)采用趙曉杰等[8]方法．將筋骨草在固體培養(yǎng)基(MS+2,4-D 0.4 mg/L)上誘導(dǎo)成愈傷組織．將生長在固體培養(yǎng)基的愈傷組織，在無菌條件下接種到未添加瓊脂的液體培養(yǎng)基內(nèi)(MS+2,4-D 0.4 mg/L)進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，接種量為100 g/L(即每50 mL培養(yǎng)基中接種筋骨草細(xì)胞鮮重5 g)，pH調(diào)至6.0．每隔7 d進(jìn)行一次繼代．本實驗使用繼代次數(shù)為4代的懸浮體系．培養(yǎng)條件：培養(yǎng)室內(nèi)光照培養(yǎng)，溫度為25 ℃，光/暗周期：16 h/8 h，光照強度2 000 lux，濕度為70%．搖床速度：110~120 r/min．

1.2.2篩選ABA濃度閾值本實驗設(shè)定0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/L共5個ABA質(zhì)量濃度梯度，并以空白為對照．加入到接種量為100 g/L已培養(yǎng)7 d的懸浮體系中．觀察匍枝筋骨草在不同懸浮體系中生長狀態(tài)和生物量，根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果，選出最適合的ABA添加濃度．

1.2.3 防御酶的提取及活性測定

(1)SOD提取與活性測定采用南京建成生物公司提供的總SOD測試盒進(jìn)行提取，稱取植物組織1 g，加入9 mL 0.1 mol/L pH 7.0~7.4的磷酸緩沖液，制成100 g/L的勻漿液，3 500~4 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行測定．以每1 g組織在1 mL反應(yīng)液SOD抑制率達(dá)到50%時所對應(yīng)的SOD量為一個SOD活力單位．

(2)CAT提取與活性測定采用總CAT測試盒(南京建成生物公司)提取,稱取植物組織1 g，加入9 mL生理鹽水，制成100 g/L的勻漿液，2 500 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行測定．以每1 mg組織蛋白每秒鐘分解1 μmol H2O2的量為一個活力單位．

(3)POD提取與活性測定采用總POD測試盒(南京建成生物公司)提取，稱取植物組織1 g，加入9 mL 0.1 mol/L pH 7.0~7.4的磷酸緩沖液，制成100 g/L的勻漿液，3 500 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行測定．以每1 mg組織蛋白每分鐘分解1 μg底物的酶量為一個活力單位．

(4)PAL提取與活性測定參照李靖[9]等的方法測定．取1 g(鮮質(zhì)量)懸浮細(xì)胞，加入少量 PVP和石英砂，4 ℃下研磨，加入5 mL預(yù)冷的酶提取液(0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液 pH 6.0，含2 mmol/L EDTA，4 mmol/L DTT)勻漿，混勻后10 000 r/min 4 ℃離心15 min，上清為胞內(nèi)酶待測液．1 mL酶待測液(同時以1 mL蒸餾水為對照)，加入2 mL 0.01 mol/L且pH 8.8 的硼酸緩沖液，1 mL 0.02 mol/L苯丙氨酸，混勻，37 ℃保溫30 min后，加入0.2 mL鹽酸終止反應(yīng)．測定290 nm處的吸光值．以每分鐘吸光值增加 0.01所需酶量為1個酶活性單位(U)．

1.2.4β-蛻皮甾酮的提取及含量測定參照黎昕等[10]方法，匍枝筋骨草細(xì)胞(干質(zhì)量)0.2 g，色譜甲醇5 mL，浸泡24 h，超聲1 h后進(jìn)行微波消解(WT-8000消解條件：T：50 ℃，P：2P0，t：10 min，W：300×2)；有機過濾膜過濾后濾液直接用于HPLC檢測．蛻皮甾酮檢測色譜柱:C18(4.6 mm×250 mm,5 μm粒度)；紫外可見光檢測器(波長范圍190~800 nm)；檢測波長242 nm；流動相(V(甲醛)∶V(水)=1∶1)0.8 mL/min，進(jìn)樣量20 μL．配置質(zhì)量濃度為0.8，0.4，0.2,0.1,0.05 g/L的β-蛻皮甾酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每次分別進(jìn)樣10 μL，重復(fù)3次，以峰面積的平均值為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得β-蛻皮甾酮回歸方程為：y=18 498x+226.2,相關(guān)系數(shù)為 0.999．按照液相色譜檢測的試樣的峰面積，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求出β-蛻皮甾酮含量．圖1為蛻皮激素標(biāo)樣液相色譜圖，圖2為匍枝筋骨草樣品液相色譜圖.

圖1　蛻皮激素標(biāo)品液相色譜圖Fig.1　The HPLC chromatogram of β-ecdysone

圖2　樣品液相色譜圖Fig.2　The HPLC chromatogram of sample

2結(jié)果與分析

2.1　匍枝筋骨草懸浮培養(yǎng)體系的建立

將匍枝筋骨草苗接種到固體培養(yǎng)基中(MS+2,4-D 0.4 mg/L)，經(jīng)30 d誘導(dǎo)，得到黃色疏松的愈傷組織(圖3，彩圖見封三)，將所得的愈傷組織接種到固體培養(yǎng)基(MS+2,4-D 0.4 mg/L)中進(jìn)行繼代培養(yǎng)．再將愈傷組織接種到未加瓊脂的液體培養(yǎng)基中(MS+2,4-D 0.4 mg/L)進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，得到組織均一且松散的懸浮細(xì)胞．

圖3　匍枝筋骨草(a:幼苗;b:愈傷組織;c:懸浮細(xì)胞)Fig.3　Ajuga lobata D.Don (a: Seedling; b: Callus; c: Suspension cell)

2.2　ABA濃度閾值的篩選

向培養(yǎng)7 d后的懸浮體系分別加入0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/L ABA，培養(yǎng)3 d后0.1~0.4 mg/L ABA處理的懸浮細(xì)胞無明顯變化，0.5 mg/L ABA處理的細(xì)胞出現(xiàn)明顯褐化．第4天，所有濃度組均出現(xiàn)褐化現(xiàn)象(圖4，彩圖見封三)．

圖4　經(jīng)ABA處理后生長狀況Fig.4　The growth status after ABA treatment

經(jīng)ABA處理并培養(yǎng)4 d后測其鮮質(zhì)量(見圖5)，添加ABA后生物量與對照差異不顯著．綜合分析其褐化現(xiàn)象及生物量變化，認(rèn)定0.5 mg/L ABA不適宜匍枝筋骨草懸浮細(xì)胞生長．初步確定ABA添加范圍為0.1~0.4 mg/L．

2.3　防御酶的含量變化

2.3.1SOD的活性變化如圖6，ABA處理后2 h處理組與對照差異均不顯著，0.3~0.4 mg/L ABA處理的懸浮細(xì)胞6 h后SOD活性與對照差異顯著(P<0.05)．0.2~0.4 mg/L ABA處理的懸浮細(xì)胞12 h后SOD活性與對照差異顯著(P<0.05)．0.1 mg/L ABA處理24 h后與對照差異顯著，同時0.2~0.4 mg/L處理與對照差異極顯著(P<0.01)．48 h后所有濃度處理與對照差異極顯著(P<0.01)．SOD活性呈上升的趨勢，前12 h上升趨勢緩慢，12~24 h上升趨勢顯著，24~48 h后相對接近平穩(wěn)．

圖5　細(xì)胞生物量變化Fig.5　The cell biomass variation

注：*，差異顯著；**，差異極顯著．下同.圖6　SOD活性變化Fig.6　The changes of SOD activity

2.3.2CAT的活性變化如圖7，ABA處理2 h后處理組與對照差異均不顯著，0.2~0.4 mg/L ABA處理的懸浮細(xì)胞6 h后CAT活性與對照差異顯著(P<0.05)．0.2~0.4 mg/L ABA處理的懸浮細(xì)胞12 h與24 h后CAT活性與對照差異極顯著(P<0.01)．48 h后所有濃度處理與對照差異極顯著(P<0.01)，且0.2~0.4 mg/L ABA處理后CAT活性相對接近．不同濃度ABA處理的筋骨草懸浮細(xì)胞CAT活性呈上升的趨勢．

2.3.3POD的活性變化如圖8，ABA處理2 h后處理組與對照差異均不顯著，0.2~0.4 mg/L ABA處理的懸浮細(xì)胞6~12 h后POD活性與對照差異極顯著(P<0.01)．48 h后所有濃度處理與對照差異極顯著(P<0.01)．不同濃度ABA處理的筋骨草懸浮細(xì)胞POD活性呈上升的趨勢，6~24 h上升趨勢緩慢，24~48 h后上升較快．

圖7　CAT活性變化Fig.7　The changes of CAT activity

圖8　POD活性變化Fig.8　The changes of POD activity

2.3.4PAL的活性變化如圖9，不同質(zhì)量濃度ABA處理的筋骨草PAL活性變化趨勢不明顯．48 h前所有濃度處理均與對照差異不顯著．48 h時0.3~0.4 mg/L ABA處理懸浮細(xì)胞PAL活性與對照差異顯著(P<0.05)．

2.4　β-蛻皮甾酮的含量變化

如圖10， 0.1 mg/L ABA處理后蛻皮甾酮含量在12~48 h后與對照差異極顯著(P<0.01),呈上升趨勢．0.2 mg/L ABA處理12 h后與對照差異顯著(P<0.05)．其他各處理在各時間點蛻皮激素含量均與對照差異不顯著．

圖9　PAL活性變化Fig.9　The changes of PAL activity

圖10　蛻皮激素含量變化Fig.10　The changes of β-ecdysone contents

3結(jié)論

本研究在匍枝筋骨草懸浮系統(tǒng)建立的系統(tǒng)上，向已培養(yǎng)7 d的懸浮體系內(nèi)加入0.1~0.5 mg/L ABA,結(jié)果表明:加入ABA后，匍枝筋骨草懸浮細(xì)胞的生物量與對照相比無顯著變化，未能證明ABA有效地促進(jìn)懸浮細(xì)胞的增殖．同時發(fā)現(xiàn)，在加入4 d后，處理組懸浮細(xì)胞普遍出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象，證明0.1~0.5 mg/L ABA不適宜用于葡枝筋骨草細(xì)胞的長期懸浮培養(yǎng)．

添加ABA后匍枝筋骨草細(xì)胞中SOD，CAT和POD活性呈上升趨勢，證明匍枝筋骨草在0.1~0.5 mg/L ABA處理后，懸浮細(xì)胞啟動了其防御系統(tǒng)，但PAL變化趨勢不如SOD，CAT和POD活性變化明顯；同時發(fā)現(xiàn)，在匍枝筋骨草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞未褐化時間段內(nèi)，添加0.1 mg/L ABA，懸浮細(xì)胞的蛻皮激素含量明顯增加，24 h后達(dá)到最大值，而后開始降低．匍枝筋骨草做為植物源殺蟲劑蛻皮激素的來源，可在生產(chǎn)前添加ABA以增加其蛻皮激素產(chǎn)量，得到高產(chǎn)蛻皮激素．

4討論

ABA處理后匍枝筋骨草懸浮細(xì)胞發(fā)生褐化，并隨濃度的增大其褐化現(xiàn)象愈明顯，這主要是因為ABA具有抑制生長作用, 可抑制整株植物或離體器官的生長，引起器官細(xì)胞早衰[11]．

SOD，CAT與POD是細(xì)胞防御酶，參與體內(nèi)重要的生理活動,在受到抗機械損傷、抗病原物侵入、生長條件惡化等，這些酶的活性會增高，增加機體抵御外界逆境的能力[12]．本實驗中，經(jīng)不同濃度ABA處理的葡枝筋骨草懸浮細(xì)胞內(nèi)SOD，CAT以及POD活性均顯著高于對照，說明添加ABA后懸浮細(xì)胞啟動了其防御系統(tǒng)．分析其原因，初步認(rèn)為ABA為調(diào)控激素，除介導(dǎo)細(xì)胞依次發(fā)生信號識別和傳導(dǎo)等，對植物細(xì)胞也有一定的脅迫作用[13-15]．因此，ABA加入到懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系后，誘使匍枝筋骨草懸浮細(xì)胞啟動防御系統(tǒng)，導(dǎo)致防御酶的活性增高；PAL是苯胺烷類代謝的關(guān)鍵酶，參與細(xì)胞分化和木質(zhì)化過程并在植物抗逆過程中起作用[16]．但ABA處理后的匍枝筋骨草懸浮細(xì)胞中的PAL在2~24 h變化不十分顯著，而后出現(xiàn)了顯著的升高過程，這一現(xiàn)象與其他植物研究[17-20]現(xiàn)象一致．

ABA被稱為應(yīng)激激素和脅迫激素，有研究表明，逆境條件可以影響細(xì)胞發(fā)生生理生化水平上的變化，在某種逆境脅迫下，植物細(xì)胞某些代謝加快，從而提高一些次生代謝物產(chǎn)量[21]，這可能是匍枝筋骨草懸浮細(xì)胞在添加0.1 mg/L的ABA后出現(xiàn)蛻皮激素合成量增高的原因．

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(編輯王健)

*通訊作者,E-mail：chidefu@126.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(31370649)

收稿日期：2014-10-24

中圖分類號S567.239

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號1000-2537(2015)03-0016-06

DOI:10.7612/j.issn.1000-2537.2015.03.004