周濟(jì)銘， 黨政平， 李雙勇， 丁 寬， 張小紅

（1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 陜西 楊凌712100； 2.陜西省富平縣種子技術(shù)推廣中心， 陜西 富平711700；3.西安市長(zhǎng)安區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心， 西安710100； 4.西北農(nóng)林科技大學(xué)， 陜西 楊凌712100）

近些年來(lái)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在玉米、大豆等作物中并且取得了很大成效，這給小麥的遺傳改良帶來(lái)了希望［1］。目前，在小麥的轉(zhuǎn)基因研究中，基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是最常用的2種基因轉(zhuǎn)化方法，其中基因槍法在實(shí)際中應(yīng)用最多，絕大部分轉(zhuǎn)基因小麥植株是由基因槍法獲得的［2］。利用基因槍法轉(zhuǎn)化成本很高，轉(zhuǎn)化率低、操作繁瑣［3］，與基因槍法相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法費(fèi)用低廉，操作簡(jiǎn)單，目的基因的大小基本不受限制，后代中目的基因多以單拷貝的狀態(tài)存在，能夠表達(dá)預(yù)期的目標(biāo)性狀等［4］。但小麥屬于單子葉植物，與雙子葉植物相比，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的效率還很低，不同基因型小麥間的轉(zhuǎn)化效率差異很大，不同品種對(duì)農(nóng)桿菌菌侵染時(shí)的敏感程度不同，存在較強(qiáng)的基因型依賴性，因此篩選對(duì)農(nóng)桿菌敏感的小麥基因型，優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率，擴(kuò)大該方法的應(yīng)用范圍，對(duì)促進(jìn)小麥轉(zhuǎn)基因研究有重要意義。

影響小麥農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的因素有基因型、侵染時(shí)菌液濃度和侵染時(shí)間等。為了優(yōu)化轉(zhuǎn)化體系，提高轉(zhuǎn)化效率，前人已進(jìn)行過(guò)相應(yīng)研究［5－14］，在小麥的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方面取得了很大進(jìn)展。但由于使用材料、侵染菌株及培養(yǎng)條件等的差異，在實(shí)際轉(zhuǎn)化中仍難以大量應(yīng)用。目前，農(nóng)桿菌敏感小麥基因型比較匱乏，轉(zhuǎn)化效率低，轉(zhuǎn)化條件仍需進(jìn)一步改進(jìn)和優(yōu)化。本研究主要以不同基因型的冬小麥品種的幼胚愈傷組織為受體材料，通過(guò)農(nóng)桿菌侵染后的GUS基因瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果的檢測(cè)，篩選出對(duì)農(nóng)桿菌敏感的基因型，同時(shí)優(yōu)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過(guò)程中的幾個(gè)影響因素，為完善小麥農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 受體材料

新春9號(hào)、鄭麥9023、濟(jì)麥19、周麥22等共13個(gè)小麥品種的幼胚愈傷組織用于農(nóng)桿菌敏感基因型的篩選；新春9號(hào)的幼胚愈傷組織用于轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化。

1.1.2 培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)所用的培養(yǎng)基包括LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g／L，酵母提取物 5g／L，NaCl 10g／L，瓊脂15g／L，pH＝7.0，高溫滅菌20min；YEP液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g／L，酵母提取物5g／L，NaCl 5g／L，pH＝7.0，高溫滅菌20min；愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS無(wú)機(jī)鹽，1.0mg／L VB1，天門冬酰胺 0.15g／L，2.0mg／L 2，4－D，蔗糖30g／L，植物凝膠2.5g／L，pH＝5.8；侵染液：1／10MS 無(wú)機(jī)鹽，MS 維生素，0.75g／L MgCl2，MES 1.95g／L，麥芽糖40g／L，谷氨酰胺0.5g，CH 0.1 g，葡萄糖10g，Picloram 2.2mg，AS 39mg，Vc 100mg，2，4－D 2.0mg，定容1 000mL，pH＝5.4，過(guò)濾除菌。

1.1.3 農(nóng)桿菌菌株及質(zhì)粒載體

農(nóng)桿菌菌株為C 58C1［11］含植物雙元表達(dá)載體pPNT 290，攜帶由Ubiquitin啟動(dòng)子調(diào)控的GUS基因和由35S啟動(dòng)子調(diào)控的NPTⅡ基因，菌株與載體均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所葉興國(guó)老師惠贈(zèng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料的取樣、消毒與接種

小麥開花授粉12～13d后，幼胚大小為1.0～1.2 mm時(shí)，于田間收集小麥未成熟籽粒，在超凈工作臺(tái)上加入75%的酒精表面消毒30s，再用0.1%的升汞滅菌處理15min，無(wú)菌水沖洗3次，用于幼胚接種。

在超凈工作臺(tái)上，將消毒后的種子用無(wú)菌手術(shù)刀尖挑出幼胚，盾片向上接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25℃下暗培養(yǎng)，之后用于農(nóng)桿菌的侵染。

1.2.2 農(nóng)桿菌菌株的活化與擴(kuò)大培養(yǎng)

從－80℃冰箱取出農(nóng)桿菌菌株，將其劃線接種到含有50mg／L 慶大霉素、50mg／L 利福平、50mg／L壯觀霉素和50mg／L鏈霉素的LB固體培養(yǎng)基上，28℃活化培養(yǎng)3d；然后在LB固體培養(yǎng)基上挑取單菌落，接種到含有50mg／L慶大霉素、50mg／L利福平、50mg／L壯觀霉素和50mg／L鏈霉素的5mL YEP液體培養(yǎng)基中，28℃，220r／min搖菌過(guò)夜培養(yǎng)。

次日，將過(guò)夜培養(yǎng)的5mL菌液倒入50mL YEP（含有相同濃度的上述抗生素）液體培養(yǎng)基中，28℃，240r／min搖菌6～7h，待菌液OD600在0.6～0.8之間時(shí)，停止搖菌培養(yǎng)，將菌液3 500r／min離心10min，去上清，收集菌體，用侵染液重懸菌體，搖勻?qū)⑵湎♂尩絆D600＝0.7，備用。

1.2.3 農(nóng)桿菌敏感基因型的篩選

小麥幼胚接種到誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上25℃暗條件下預(yù)培養(yǎng)4d，在將上述重懸菌液（OD600＝0.7）直接加入到固體培養(yǎng)基上，沒(méi)過(guò)材料侵染1h，用無(wú)菌濾紙將幼胚上殘留的菌液吸干，然后將幼胚轉(zhuǎn)移到無(wú)菌濾紙上，25℃黑暗條件下共培養(yǎng)2d后進(jìn)行GUS染色。

1.2.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

1）幼胚預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的確定。將新春9號(hào)新鮮幼胚放入侵染液中預(yù)處理60min，棄去侵染液后加入上述OD600＝0.7的重懸菌液直到?jīng)]過(guò)材料，分別侵染30min和60min，每個(gè)侵染時(shí)間下進(jìn)行3次重復(fù)；侵染結(jié)束用無(wú)菌濾紙將幼胚上殘留的菌液吸干，將幼胚轉(zhuǎn)接到與侵染液成分相同的固體培養(yǎng)基上，25℃黑暗條件下共培養(yǎng)2d后進(jìn)行GUS染色。

將新春9號(hào)幼胚接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25℃暗條件預(yù)培養(yǎng)4d，侵染與共培養(yǎng)過(guò)程同上。

2）適宜菌液濃度的確定。將幼胚接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，預(yù)培養(yǎng)7d后，挑選生長(zhǎng)良好的愈傷組織放入不同濃度的重懸菌液（OD600＝0.5、1.0、1.5）中侵染30min；每個(gè)菌液濃度處理下重復(fù)3次。其中對(duì)照（ck）是將愈傷組織放入不含有農(nóng)桿菌菌液的侵染液中處理相同的時(shí)間，其余操作均相同。侵染過(guò)程中晃動(dòng)幾次，侵染結(jié)束后用無(wú)菌濾紙將愈傷組織表面殘留的菌液吸干，將愈傷放到無(wú)菌濾紙上，25℃暗條件下共培養(yǎng)2d后進(jìn)行GUS染色。

3）適宜侵染時(shí)間的確定。對(duì)小麥幼胚進(jìn)行7d的預(yù)培養(yǎng)，挑選生長(zhǎng)良好的愈傷在OD600＝1.0的重懸農(nóng)桿菌菌液濃度下侵染15，30，60min；每一個(gè)的侵染時(shí)間處理下重復(fù)3次。對(duì)照處理和侵染結(jié)束后的處理方法同2）。

1.2.5 GUS表達(dá)活性的化學(xué)組織染色

采用 X－Gluc染色方法［15］，對(duì)轉(zhuǎn)化的材料進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。將侵染后的愈傷放入1.5mL的離心管中加入適量的X－Gluc染液，37℃避光條件下染色24h，染色完畢將染液吸出，用75%乙醇脫色后統(tǒng)計(jì)顯色愈傷組織數(shù)，計(jì)算GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

GUS基因瞬時(shí)表達(dá)率（%）＝顯色的愈傷數(shù)目／用于染色檢測(cè)的愈傷數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)桿菌敏感基因型的篩選

將新春9號(hào)、鄭麥9023、濟(jì)麥19等13個(gè)小麥基因型的幼胚預(yù)培養(yǎng)4d，利用含有GUS基因的農(nóng)桿菌C58 C1進(jìn)行侵染，共培養(yǎng)2d后進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，統(tǒng)計(jì)得到了各基因型幼胚的GUS瞬時(shí)表達(dá)率（表1）。可以看出，GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)率在0～95.9%之間，各基因型間差異明顯。根據(jù)GUS基因瞬時(shí)表達(dá)率可將不同基因型分為對(duì)農(nóng)桿菌侵染敏感型、一般敏感型、低敏感型和不敏感型四類，其中新春9號(hào)、小偃328和濟(jì)麥19三個(gè)基因型為敏感型，GUS基因表達(dá)率均達(dá)到90%以上，其中新春9號(hào)最高，為95.9%；其次是西農(nóng)882、小偃296、周麥27、小偃166和鄭麥9023五個(gè)小麥基因型，GUS的表達(dá)率為20%～40%，對(duì)農(nóng)桿菌為一般敏感型；而周麥22、泛麥5號(hào)和濟(jì)麥22 3個(gè)為低敏感型品種，GUS的表達(dá)率為5.6%～12.5%；而良星66和西農(nóng)2611兩個(gè)基因型對(duì)農(nóng)桿菌不敏感，GUS基因的表達(dá)率為0。

表1 不同基因型小麥幼胚愈傷組織GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)情況

2.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

2.2.1 幼胚預(yù)培養(yǎng)對(duì)侵染效果的影響

將新春9號(hào)剝離的新鮮幼胚分別預(yù)培養(yǎng)0d和4d，之后用濃度為OD600＝0.7的重懸菌液分別侵染30min和60min，共培養(yǎng)后經(jīng)GUS染色統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。由表2可以看出，預(yù)培養(yǎng)0d的幼胚在侵染30min和60min時(shí)的GUS基因表達(dá)率均為0，而預(yù)培養(yǎng)4d的幼胚在2個(gè)侵染時(shí)間下的GUS平均瞬時(shí)表達(dá)均超過(guò)了90%，分別為92.0%和95.9%，這說(shuō)明經(jīng)過(guò)4d預(yù)培養(yǎng)的幼胚對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性要明顯好于新鮮幼胚。

另外，在實(shí)驗(yàn)中觀察到，預(yù)培養(yǎng)4d的幼胚在侵染不同時(shí)間下表現(xiàn)出的侵染效果有所差異：侵染60min的幼胚經(jīng)過(guò)染色，染色程度更深，說(shuō)明GUS基因在愈傷中的表達(dá)量更大。

表2 不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間及不同侵染時(shí)間下GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)情況

2.2.2 適宜菌液濃度的確定

新春9號(hào)幼胚經(jīng)過(guò)7d的預(yù)培養(yǎng)，在菌液濃度OD600＝0.5、1.0、1.5下分別侵染30min，共培養(yǎng)后經(jīng)GUS染色，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，3個(gè)菌液濃度下GUS瞬時(shí)表達(dá)率都非常高，在菌液濃度OD600為1.0時(shí)最高，達(dá)到了94.0%。

表3 不同菌液濃度條件下GUS基因瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果

2.2.3 適宜侵染時(shí)間的確定

將新春9號(hào)的幼胚誘導(dǎo)愈傷預(yù)培養(yǎng)7d，在菌液濃度 OD600＝1.0菌液濃度下分別侵染15，30，60min，結(jié)果見表4?？梢钥吹?，在實(shí)驗(yàn)的菌液濃度和不同侵染時(shí)間下，幼胚愈傷的農(nóng)桿菌侵染效果均較好，幼胚GUS瞬時(shí)表達(dá)率均達(dá)到了90%以上。但從后期脫菌處理及培養(yǎng)效果來(lái)看，應(yīng)選擇較短的侵染時(shí)間為好。

表4 不同侵染時(shí)間條件下GUS基因瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果

3 討 論

目前來(lái)看，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)小麥進(jìn)行外源基因的轉(zhuǎn)化與基因槍法相比體系還不是很完善，應(yīng)用范圍上也不夠廣泛，但它是一種非常有發(fā)展前景的方法。影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的因素有很多，前人關(guān)于這方面的研究報(bào)道也較多。本研究從小麥的基因型、外植體的狀態(tài)、菌液濃度和侵染時(shí)間幾個(gè)方面進(jìn)行了研究，以期能夠進(jìn)一步優(yōu)化和完善農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化體系。

小麥的基因型對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化效果影響很大，實(shí)驗(yàn)中所使用的13個(gè)小麥基因型進(jìn)行轉(zhuǎn)化之后GUS的瞬時(shí)表達(dá)率差異非常顯著，最低的為0，最高達(dá)到95.9%。在本實(shí)驗(yàn)中，篩選到3個(gè)對(duì)農(nóng)桿菌敏感的基因型，其幼胚愈傷組織的GUS表達(dá)率均遠(yuǎn)高于葉興國(guó)［11］、石珍源等［16］的研究結(jié)果，分析可能是由于試驗(yàn)過(guò)程中使用的外植體類型的差異造成的，因此認(rèn)為，選用生理活性較高的幼胚愈傷對(duì)于提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效果有進(jìn)一步的促進(jìn)作用；同時(shí)部分相同品種的實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異，分析可能和供試品種來(lái)源及純度有關(guān)。

利用新鮮幼胚和預(yù)培養(yǎng)后的幼胚愈傷組織為受體，結(jié)果顯示，新鮮的幼胚對(duì)于農(nóng)桿菌的侵染完全不敏感，檢測(cè)不到GUS基因的表達(dá)；而預(yù)培養(yǎng)4d的幼胚愈傷組織對(duì)于農(nóng)桿菌的侵染非常敏感，GUS陽(yáng)性率均達(dá)到了90%以上；同時(shí)適宜菌液濃度和侵染時(shí)間的實(shí)驗(yàn)中，預(yù)培養(yǎng)7d的幼胚轉(zhuǎn)化效率也非常高。這一結(jié)果與前人相關(guān)研究結(jié)果基本一致。王永勤等研究認(rèn)為，利用預(yù)培養(yǎng)10d以上的幼胚適合做為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的材料［17］。Uze M等研究預(yù)培養(yǎng)3～24d幼胚經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化之后GUS的表達(dá)率，發(fā)現(xiàn)10d以上的預(yù)培養(yǎng)比3d的預(yù)培養(yǎng)效果要好很多［18］。黃益洪等［14］將幼胚預(yù)培養(yǎng)了10～15d，轉(zhuǎn)化后獲得了瞬時(shí)表達(dá)率為60%～80%的材料。這些結(jié)果表明，幼胚預(yù)培養(yǎng)可以顯著提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率，外植體預(yù)培養(yǎng)后，細(xì)胞進(jìn)入快速分裂并形成愈傷組織，處于活躍分裂期的細(xì)胞增加了對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性。

本試驗(yàn)在不同菌液濃度和侵染時(shí)間下進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其GUS表達(dá)率均較高，這可能由于實(shí)驗(yàn)中使用了對(duì)農(nóng)桿菌非常敏感的基因型新春9號(hào)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，菌液濃度OD600值為1.0時(shí)GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)率最高，而菌液濃度提高至1.5時(shí)GUS的表達(dá)率反而有所降低，劉香利等［12］的研究中也出現(xiàn)這種現(xiàn)象，認(rèn)為可能是由于高濃度的菌液對(duì)于愈傷組織細(xì)胞產(chǎn)生了損害，造成表達(dá)效率的降低?？紤]到短時(shí)間的侵染有利于后續(xù)抑菌處理和培養(yǎng)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化侵染時(shí)間選擇15min為宜。

4 結(jié) 論

篩選得到了對(duì)農(nóng)桿菌C 58C1非常敏感的3個(gè)小麥基因型：新春9號(hào)、小偃328和濟(jì)麥19；利用農(nóng)桿菌菌株C 58C1轉(zhuǎn)化的適宜條件為：幼胚經(jīng)過(guò)4～7d的預(yù)培養(yǎng)，在菌液濃度OD600＝1.0時(shí)進(jìn)行15min的侵染，可以獲得較好的轉(zhuǎn)化效果。

［1］Clive J.2009年全球生物技術(shù)／轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢(shì)——第一個(gè)十四年1996～2009［J］.中國(guó)生物工程雜志，2010，30（2）：1－22.

［2］肖興國(guó)，張愛民，聶秀玲.轉(zhuǎn)基因小麥的研究進(jìn)展與展望［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2000，8（2）：111－116.

［3］葉興國(guó)，陳明，杜麗璞，等.小麥轉(zhuǎn)基因方法及其評(píng)述［J］.遺傳，2011，33（5）：422－430.

［4］Cheng M，F(xiàn)ry JE，Pang SZ，et al.Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens［J］.Plant Physiol，1997，115（3）：971－980.

［5］張彬，趙明，賈棟，等.小麥基因型對(duì)根癌農(nóng)桿菌菌株敏感性研究［J］.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26（2）：135－137.

［6］薛哲勇，支大英，夏光敏，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)AtNHX1基因轉(zhuǎn)化小麥［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，38（1）：106－109.

［7］郭志江，丁在松，王金明，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化敏感基因型小麥的篩選鑒定［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，23（4）：81－84.

［8］Sanyal I，Singh A K，Kaushik M.Agrobacterium－mediated transformation of chickpea（Citer arietinumL.）with Bacillus thuringiensis crylAc gene for resistance against pod borer insect Hellcoterpa armigera［J］.Plant Science，2005，168（4）：1 135－1 146.

［9］Paz M M，Martinez J C，Kalvig A B.Improved cotylrdonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrnbacterium－mediated soybean transformation［J］.Plant Cell Reports，2006，25（3）：206－213.

［10］葉興國(guó)，Shirley S，徐惠君.小麥農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植株的定獲得和檢測(cè)［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，34（5）：456－468.

［11］葉興國(guó)，王艷麗，康樂(lè)，等.農(nóng)桿菌敏感小麥基因型的篩選及其轉(zhuǎn)化［J］.作物學(xué)報(bào)，2005，31（12）：1 552－1 556.

［12］劉香利，陳明利，趙慧賢，等.小麥農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化及 HMW－GS 1 Bx14基因的轉(zhuǎn)化［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，16（6）：25－31.

［13］宋成麗，王翾，徐虹，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥成熟胚轉(zhuǎn)化的影響因素［J］.麥類作物學(xué)報(bào)，2012，32（2）：209－214.

［14］黃益洪，周淼平，葉興國(guó).農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得小麥轉(zhuǎn)基因植株的研究［J］.作物學(xué)報(bào)，2002，28（4）：510－515.

［15］閔東紅，何莎，張彥，等.基因槍轉(zhuǎn)化小麥主要轟擊參數(shù)的優(yōu)化［J］.作物學(xué)報(bào)，2013，39（1）：60－67.

［16］石珍源，殷桂香，杜麗璞，等.小麥大齡幼胚再生性能改進(jìn)與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（2）：225－232.

［17］王永勤，肖興國(guó)，張愛民.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化幾個(gè)影響因素的研究［J］.遺傳學(xué)報(bào)，2002，29（3）：260－265.

［18］Uze M，Potrykus I，Sautter C.Factors influencing T－DNA transfer from Agrobacterium to precultured immature wheat embryos （Triticum aestivum L.）［J］.Cereal Res Commun.2000，28（1－2）：17－23.