張皖秋， 孫海燕， 張文明， 鄭文寅， 高燦紅， 姚大年

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 合肥230036； 2.濰坊學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院， 安徽 濰坊261061）

甜玉米（Z.m.saccharata Sturt）為玉米屬亞種，即甜質(zhì)型玉米亞種，原產(chǎn)地在美洲，西歐稱之為蔬菜玉米，現(xiàn)已成為一種新興的果蔬兼用型保健食品［1］。甜玉米受相關(guān)隱形基因突變的影響，促使可溶性糖轉(zhuǎn)化為淀粉的速率降低，因而甜玉米籽粒的含糖量比普通玉米高出2～8倍。甜玉米商業(yè)價(jià)值較高，也有很大的轉(zhuǎn)化增值空間，但是我國對甜玉米的開發(fā)和利用進(jìn)展卻較緩慢，原因在于甜玉米種子的活力弱，田間出苗率低，特別是超甜玉米，僅有50%左右［2－3］。因此，如何提高甜玉米種子活力成為種子領(lǐng)域的重要研究課題。

種子引發(fā)也稱為滲透調(diào)節(jié)，是提高種子活力方法之一，此方法最早由 Heydecker等［4］提出，是指控制種子處于吸脹的第二階段，促進(jìn)種子緩慢吸收水分，促進(jìn)酶的活化，進(jìn)行預(yù)發(fā)芽的生理生化代謝，同時(shí)，也要防止胚根伸長［5］。常用的種子引發(fā)方法有固體基質(zhì)引發(fā)、滲透引發(fā)、生物引發(fā)等［6］。研究發(fā)現(xiàn)，引發(fā)處理增強(qiáng)了種子活力、提高了種子的發(fā)芽速度、成苗率和整齊度，甚至可以增強(qiáng)種子的抗逆性，可一定程度的減少種子用量，節(jié)約成本［7］。胡晉等對直播水稻種子進(jìn)行砂引發(fā)處理，結(jié)果表明：經(jīng)砂引發(fā)處理后的水稻種子，與活力相關(guān)的一些酶活性均得到顯著提高［8］。張文明等采用不同含水量的砂引發(fā)處理草坪草種子，探究對其萌發(fā)及活力的影響，結(jié)果表明：各處理中種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、幼苗的鮮重、干重及簡化活力指數(shù)均得到明顯提高［9］。王芳等以水、硝酸鉀、硝酸鉀與磷酸二氫鉀混合溶液3種基質(zhì)對甜玉米種子進(jìn)行引發(fā)處理，結(jié)果表明：3種引發(fā)處理對甜玉米種子的發(fā)芽率影響不大，但均能促進(jìn)芽鞘和單株幼苗的生長和提高種子的活力［10］。Chem等研究發(fā)現(xiàn)，甜玉米種子在－0.3MPa PEG溶液中引發(fā)可提高種子的發(fā)芽率［11］。Resse等對甜玉米種子進(jìn)行加壓融合生物引發(fā)，結(jié)果表明：此方法不僅能增大吸濕速率，還能使金色假單胞菌在種子表面大量繁殖，明顯提高田間出苗率［12］。

本試驗(yàn)選用7個(gè)品種甜玉米種子為材料，每品種設(shè)置水分含量為5.7%和7.4%的2種砂引發(fā)處理，設(shè)未處理種子為對照，通過測定各處理脫氫酶、POD和Apase的活性，并進(jìn)行過氧化物酶和酸性磷酸酶電泳分析，研究砂引發(fā)對甜玉米種子酶活性的影響，探討砂引發(fā)提高甜玉米種子活力的生理生化機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試甜玉米品種共有7個(gè)，分別為：皖玉14號、皖玉15號、皖玉10號、皖甜1號、雙福超甜、粒粒豐超甜、金菲超甜。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 砂引發(fā)處理

在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇水分含量為5.7%和7.4%的2種砂引發(fā)處理。參照張文明等［9］的試驗(yàn)方法，先將砂子清洗數(shù)次，裝盤后放入130℃烘箱烘干，再用孔徑為d＝2.0mm的篩子篩去雜物。各處理以種子重量和干砂重量1∶5的比例，隨機(jī)取一定量的玉米種子（約1 000粒）和相應(yīng)重量的干砂，干砂放入培養(yǎng)盒內(nèi)，按砂水分含量為5.7%和7.4%的要求，加水并充分?jǐn)嚢?。再將相?yīng)的玉米種子倒入砂中，拌勻，加蓋密封后放入20℃培養(yǎng)箱中處理3d。設(shè)不作任何處理種子為對照。

1.2.2 酶活性測定

對處理后的7個(gè)品種的甜玉米種子進(jìn)行脫氫酶、POD、Apase活性的測定，以不作處理的種子為對照。脫氫酶活性測定參照尹燕枰等［13］的試驗(yàn)方法，采用氮藍(lán)四唑（TTC）法，測定490nm處的OD值。POD活性測定參照劉子凡［14］的試驗(yàn)方法，稍加改動(dòng)。Apase活性的測定參照程軍等［15］的試驗(yàn)方法，稍加改動(dòng)。

1.2.3 過氧化物酶同工酶電泳

試驗(yàn)步驟及方法參照孫海燕［16］的試驗(yàn)方法。

1）分離膠緩沖液：取10.98g的 Tris，14.4mL 1mol／L的 HCl和0.2mL的TEMED，加適量蒸餾水至30mL。

2）分離膠貯液：取14.0g的Acr和0.368g的Bis，加適量蒸餾水至50mL。

3）過硫酸銨溶液：取0.7g的過硫酸銨，加適量蒸餾水至50mL。

4）濃縮膠緩沖液：取1.196g的 Tris，9.6mL 1mol／L的 HCl，0.3mL的 TEMED，加適量蒸餾水至20mL。

5）濃縮膠貯液：取3.0g的Acr和0.75g的Bis，加適量蒸餾水至30mL。

6）蔗糖溶液：取20g的蔗糖，加蒸餾水至50mL。

7）電極緩沖液：取7.2g的甘氨酸和1.5g的Tris，加適量蒸餾水至250mL，再稀釋10倍。

8）1mol／L HCl溶液：取4.2mL的 HCl，緩慢加適量蒸餾水至50mL。

9）提取用液：取10mL的蔗糖液和2mL的電極緩沖液，加8mL蒸餾水。

10）0.1%溴酚藍(lán)溶液（前沿指示劑）：取30mg的溴酚藍(lán)，加30mL蒸餾水。

11）染色液：取25mL的聯(lián)苯胺溶液（0.5g聯(lián)苯胺＋3.75mL冰醋酸），25mL 5% 的 EDTA，25mL 4%的氯化銨溶液，250μL 30%的 H2O2，混合后定溶至100mL。

樣品提?。焊髌贩N取相同數(shù)量的甜玉米種子，均勻播于砂床，放置在人工智能氣候箱（30℃、黑暗）培養(yǎng)4d，定期檢測溫度，觀察芽苗長勢，芽鞘長出后，剪下胚芽，放入研缽，滴加6滴提取液，再加入少量石英砂，充分研磨后倒入離心管，以5 000r／min的轉(zhuǎn)速離心15min，吸出上清液，供點(diǎn)樣使用。

制膠：將之前配制好的試劑1），2），3）和蒸餾水按1∶2∶4∶1的比例配制成分離膠液，倒入安裝好的膠膜中。再將配制好的試劑4），5），3），6）按1∶2∶1∶4的比例配制成濃縮膠液，等分離膠液凝固后倒入濃縮膠液。在插樣品梳的時(shí)候，要防止產(chǎn)生氣泡。凝膠制好后放置30min，確保其完全聚合。

進(jìn)樣和電泳：用移液槍吸取20μL樣品提取液，加入濃縮膠樣品槽，再將之前配制好的電極緩沖液緩慢倒入電泳槽，至淹沒電極，最后向前槽加2滴溶液10）。電流設(shè)為32mA，當(dāng)指示劑到達(dá)電泳槽底部的時(shí)候，終止電泳。

染色：取出膠板，用蒸餾水把凝膠片沖洗兩遍，放在裝有染色液的容器里，觀察譜帶顯色清楚時(shí)，立刻取出，用蒸餾水將多余的染色液洗去，并拍照。

1.2.4 酸性磷酸酶同工酶電泳

參照過氧化物酶同工酶電泳的試驗(yàn)方法。染色液的配制：取100mgα－醋酸萘酯鈉鹽和100mg固藍(lán)B鹽，100mL 0.1mol／L pH＝5.0的醋酸緩沖液，混勻待用。

2 結(jié)果與分析

2.1 砂引發(fā)對甜玉米種子酶活性的影響

由圖1可見，2種砂引發(fā)處理的甜玉米種子脫氫酶活性均比ck高。2種砂引發(fā)處理間比較，除金菲超甜5.7%的砂引發(fā)處理脫氫酶活性比7.4%處理稍高外，其余品種7.4%的砂引發(fā)處理脫氫酶活性均高于5.7%處理。其中，皖甜1號、粒粒豐超甜和雙福超甜7.4%處理的脫氫酶活性與ck相比增高幅度較大。

圖1 砂引發(fā)甜玉米種子脫氫酶活性測定結(jié)果

由圖2可見，2種砂引發(fā)處理的甜玉米種子POD活性，除皖玉14號POD活性低于ck外，其他品種的POD活性均高于ck，其中，雙福超甜5.7%的砂引發(fā)處理POD活性與ck相比增高幅度較大。

圖2 砂引發(fā)甜玉米種子POD活性測定結(jié)果

由圖3可見，2種砂引發(fā)處理的甜玉米種子Apase活性均比ck高，其中皖甜1號5.7%的處理和粒粒豐超甜7.4%的處理，Apase活性與ck相比增高幅度較大。

2.2 砂引發(fā)甜玉米種子同工酶譜帶分析

由圖4可見，5.7%和7.4%2種砂引發(fā)處理的甜玉米種子，過氧化物酶同工酶譜帶均比對照清晰，且多出1～2條。

由圖5可見，5.7%和7.4%砂引發(fā)處理的甜玉米種子，酸性磷酸酶同工酶譜帶除皖玉14號外，其余各品種砂引發(fā)處理的譜帶均比對照顏色深。

3 討 論

研究表明，引發(fā)處理能使種子的RNA和蛋白質(zhì)的合成發(fā)生變化，還能誘導(dǎo)細(xì)胞膜的修復(fù)，增加萌發(fā)種子中ATP的含量，提高萌發(fā)種子相關(guān)酶的活性等一系列的生理生化變化，甚至能提高種子的抗逆性和出苗率，使之能在低溫、高溫、干旱、鹽漬或者缺氧的不利環(huán)境下萌發(fā)，最終達(dá)到有效地提高種子活力的目的［17］。種子引發(fā)可提高一些與抗劣變相關(guān)的酶活性，如提高POD的活性，通過降低生物體內(nèi)的H2O2含量，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞和增強(qiáng)種子的抗逆性的作用［18］。張海艷等研究發(fā)現(xiàn)，沙引發(fā)處理能提高糯玉米、爆裂玉米和甜玉米幼苗過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，也能顯著降低丙二醛（MDA）的含量［19］。本研究結(jié)果表明，適宜含水量的砂引發(fā)能明顯提高甜玉米種子的脫氫酶、POD和Apase活性，這與前人的研究結(jié)果基本一致。本研究砂引發(fā)處理過氧化物酶同工酶譜帶均比對照多出1～2條，是否為新的同工酶出現(xiàn)，還需要進(jìn)一步研究。

圖3 砂引發(fā)甜玉米種子Apase活性測定結(jié)果

種子引發(fā)是提高種子活力的有效方法之一，但引發(fā)的效果在種、品種或種子批之間可能會存在一定的差異，引發(fā)條件也難以設(shè)定統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，這就給種子引發(fā)技術(shù)的推廣應(yīng)用帶來困難。此外，各種引發(fā)方法也都存在一定的局限性，如PEG引發(fā)，由于其成本相對較高，適用于一些經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的種子；而滾筒引發(fā)不但要有一定的設(shè)備基礎(chǔ)，而且每次引發(fā)的種子有限。相比而言，砂作為一種既便宜又容易得到的物質(zhì)，并且對作物種子無毒性，可當(dāng)作一種優(yōu)良的引發(fā)基質(zhì)［20］。此外，砂引發(fā)方法簡單，可操作性強(qiáng)，從砂中篩出引發(fā)處理后的種子，可直接用于播種，也可連同砂一起播入田里，因此，砂引發(fā)具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

圖4 砂引發(fā)甜玉米過氧化物酶電泳圖譜

圖5 砂引發(fā)甜玉米種子酸性磷酸酶電泳圖譜

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