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(齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

苜蓿是我國目前種植面積最大的多年生豆科牧草，不僅營養(yǎng)價(jià)值高，而且產(chǎn)量豐富，被世界各地廣泛栽培，具有保持水土流失，防沙固塵等作用，在我國畜牧業(yè)發(fā)展中占有舉足輕重的地位[1]。優(yōu)質(zhì)苜蓿品種推廣和抗性選育已取得了一定成效，但育成的優(yōu)質(zhì)抗逆性強(qiáng)的品種比較少?，F(xiàn)代生物技術(shù)在育種上的應(yīng)用，已成為苜蓿品種改良的重要手段。有關(guān)苜蓿不同組織器官離體培養(yǎng)已有報(bào)道，但對不同苜蓿品種的不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)的比較研究報(bào)道甚少。對4種紫花苜蓿的不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)進(jìn)行比較分析，以期為紫花苜蓿應(yīng)用生物技術(shù)進(jìn)行抗逆性育種的研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試材料為龍牧801、龍牧81、敖漢、圖牧2號4種苜蓿種子，均由黑龍江省畜牧研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 無菌苗的培養(yǎng)

挑選籽粒飽滿的4種苜蓿種子，溫水中浸泡約2 h后，用 0.1%升汞消毒10 min，滅菌水沖洗后接種到MS+30 g蔗糖+10 g瓊脂的基本培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為光周期16 h/d，光照強(qiáng)度1 000～3 000 lx的25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使其種子發(fā)芽并獲得無菌苗。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

取生長12 d的4種無菌苗的子葉、下胚軸、莖和葉片，將莖和下胚軸切割成5～7 mm，子葉和葉片分割成5 mm×5 mm大小。將分割好的不同外植體接在MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA+30 g蔗糖的固體培養(yǎng)基中，每個(gè)品種的每種外植體接種8瓶，每瓶接種12塊。培養(yǎng)條件同上，接種后第2天開始觀察和記錄不同外植體愈傷組織發(fā)生情況。

1.2.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

對數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行差異顯著性和相關(guān)性分析。

愈傷組織誘導(dǎo)率(%)= 誘導(dǎo)愈傷組織數(shù)目/接種外植體數(shù)目×100%；

愈傷組織褐化率(%)= 褐化愈傷組織數(shù)目/接種愈傷組織數(shù)目×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體愈傷組織發(fā)生的動(dòng)態(tài)變化

對4種苜蓿不同的外植體的脫分化比較(見圖1)，下胚軸愈傷組織的生長啟動(dòng)比較早，接種基本培養(yǎng)基中2 d后其兩端或中間開始膨大發(fā)白，3 d后出現(xiàn)愈傷組織，莖次之，接入5 d后外植體開始增粗，愈傷組織在第8天開始顯現(xiàn)，子葉和葉片愈傷組織的生長啟動(dòng)較晚，接種8 d后外植體才開始膨大卷曲，15 d后在子葉和葉片邊緣逐漸形成愈傷組織。

在4種不同的外植體中，胚軸誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織呈現(xiàn)淡綠色，生長迅速，但愈傷組織質(zhì)地疏松。莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織呈現(xiàn)黃色、顆粒狀、疏松易碎。子葉和葉片誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織淡黃綠色、質(zhì)地緊密。4種苜蓿的不同外植體在愈傷組織的發(fā)生上和愈傷組織的形態(tài)上產(chǎn)生了一定的差異。

注：A～D依次為龍牧801的莖、子葉、葉片、下胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織 ；E～H依次為龍牧81的莖、子葉、葉片、下胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織；I～L依次為敖漢的莖、子葉、葉片、下胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織；M～P依次為圖牧的莖、子葉、葉片、下胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織。 圖1 苜蓿不同外植體的愈傷組織

表1 品種間不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)率(%)

外植體愈傷組織誘導(dǎo)率(%)龍牧801龍牧81敖漢圖牧2號平均值下胚軸99．8±0．58aA99．5±0．17aA98．6±0．34aA99．7±0．12aA99．4莖95．9±0．43bB93．1±0．58bB90．0±0．35bB93．2±0．20bB92．3子葉90．0±0．54cC91．2±0．58bB89．2±0．32bB91．1±0．48cC91．1葉片86．6±0．35dD83．3±0．55dD82．2±0．35cC85．0±0．08dD84．3平均值93．0891．7890．0092．25

注：不同字母代表同一品種的不同外植體間的比較，小寫字母代表0.05水平，大寫字母代表0.01水平。下同。

2.2 不同外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率

4種苜蓿品種的不同外植體接種到誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基后，愈傷組織的誘導(dǎo)效果和愈傷組織的生長情況區(qū)別很大。如表1所示，4種外植體均具有較強(qiáng)的愈傷組織發(fā)生能力，愈傷誘導(dǎo)率均在80%以上。不同的外植體愈傷組織之間誘導(dǎo)率存在顯著差異，下胚軸誘導(dǎo)率最高，可達(dá)99%，與其它外植體之間差異顯著，葉片的誘導(dǎo)率最低，為84.3%。在4種苜蓿中，龍牧801的誘導(dǎo)率相對高一些，龍牧81和圖牧次之，敖漢的誘導(dǎo)率最低。4種苜蓿的不同外植體除龍牧81與敖漢的子葉與莖之間差異不顯著外，其它外植體在愈傷組織的誘導(dǎo)率上均產(chǎn)生顯著的差異(p<0.01)，外植體在接種28 d后，4種苜蓿的愈傷組織誘導(dǎo)率基本趨于穩(wěn)定，部分愈傷組織開始變褐。

2.3 不同外植體誘導(dǎo)的愈傷組織的褐化率

在4種苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)過程中，不用外植體誘導(dǎo)的愈傷組織都有不同程度的褐化。如表2所示，不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織的褐化率之間差異顯著，在褐化率方面，下胚軸的褐化率最低，平均為8.68%，莖和子葉次之，葉片的褐化率最高，達(dá)25.5%。在4種苜蓿品種間，龍牧801和龍牧81的外植體誘導(dǎo)愈傷組織褐化率較低，敖漢和圖牧外植體誘導(dǎo)愈傷組織的褐化率相對較高。從愈傷組織的誘導(dǎo)率和褐化率綜合分析，選擇龍牧801苜蓿的下胚軸為理想的苜蓿愈傷組織的外植體。

表2 品種間不同外植體愈傷組織褐化率(%)

外植體愈傷組織誘導(dǎo)率(%)龍牧801龍牧81敖漢圖牧2號平均值下胚軸6．70±0．06dD8．90±0．02dD9．80±0．05dD9．30±0．02dD8．68莖9．20±0．06cC10．2±0．01cC14．0±0．21cC15．0±0．09cC12．20子葉15．2±0．06bB18．8±0．28bB17．9±0．32bB16．0±0．38bB16．98葉片20．2±0．11aA26．0±0．26aA28．3±0．29aA27．5±0．28aA25．50平均值12．8315．9817．5016．95

2.4 不同外植體愈傷組織相關(guān)性分析

對不同苜蓿品種的不同外植體間的愈傷組織誘導(dǎo)率進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表3。由表3可看出，莖和子葉的愈傷組織誘導(dǎo)率呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)。莖同下胚軸和葉片的愈傷組織誘導(dǎo)率呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，其它愈傷組織誘導(dǎo)率之間存在正相關(guān)。

表3 外植體誘導(dǎo)率的相關(guān)性分析

外植體下胚軸莖子葉葉片下胚軸1．000莖-0．7801．000子葉0．696-0．992??1．000葉片0．854-0．3510．2331．000

3 討 論

3.1 不同外植體的愈傷組織誘導(dǎo)能力

植物的遺傳特性和外植體種類對愈傷組織的誘導(dǎo)及其分化能力產(chǎn)生顯著影響[2]。誘導(dǎo)愈傷組織是建立在植物的再生體系或進(jìn)行遺傳性轉(zhuǎn)化等的重要途徑，也是產(chǎn)生變異，創(chuàng)造植物新品型的重要方法。而選擇適宜的外植體是誘導(dǎo)出愈傷組織的前提條件[3]。本實(shí)驗(yàn)選用下胚軸、莖、子葉、葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，不同的外植體之間的生長啟動(dòng)以及生長速度之間呈顯著差異，下胚軸和莖的愈傷組織啟動(dòng)時(shí)間要在子葉和葉片愈傷組織的啟動(dòng)時(shí)間之前。下胚軸的誘導(dǎo)率最高，與肖荷霞等[4]，王艷等[5]研究結(jié)果基本一致。同一外植體不同基因型的培養(yǎng)效果均無顯著差異，而同一基因型不同外植體的培養(yǎng)效果均有顯著差異。不同類型外植體培養(yǎng)的效果出現(xiàn)差異, 可能是因?yàn)榕咻S、莖、子葉、葉片的生理狀態(tài)和生育時(shí)期不同, 進(jìn)而影響內(nèi)源激素的水平的不相同。

3.2 愈傷組織的褐化

在本試驗(yàn)中，不同類型的外植體，誘導(dǎo)的愈傷組織都有不同程度的褐化。在組織培養(yǎng)過程中，褐變的產(chǎn)生原因受多種因子的影響。褐變的產(chǎn)生與外植體組織中所存在的酚類化合物的含量和多酚氧化酶的活性存在直接關(guān)系[6]。本試驗(yàn)借鑒前人的經(jīng)驗(yàn)，選取了一系列有效措施抑制外植體的褐化。首先，選取生長粗壯、鮮嫩的無菌苗作為材料，初代培養(yǎng)后脫分化啟動(dòng)時(shí)間短，增殖速度快，成活率高；其次，適當(dāng)?shù)販p少培養(yǎng)基中的激素和蔗糖的濃度，試驗(yàn)將2，4-D和蔗糖的量適度降低，來減少愈傷組織的褐化率。同時(shí)縮短轉(zhuǎn)瓶周期為15～20 d，進(jìn)而擺脫原培養(yǎng)基中褐色雜質(zhì)積累的不利的影響。在4種苜蓿中，葉片的褐化率都最高，可能是葉片比其它3種外植體中酚類化合物含量多和多酚氧化酶活性比較高導(dǎo)致的。

4 結(jié) 論

對4種苜蓿的下胚軸、葉片、子葉和莖誘導(dǎo)愈傷組織，不同品種的外植體愈傷組織的誘導(dǎo)率以及褐化率呈現(xiàn)顯著差異，下胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織效果是最好的，褐化率也是最低；苜蓿不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)率的高低為：下胚軸>子葉>莖>葉片；莖和子葉的愈傷組織誘導(dǎo)率存在極顯著負(fù)相關(guān)。

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[2]梁慧敏,黃劍,夏陽,等.苜蓿外植體再生系統(tǒng)的建立研究[J].中國草地,2003,25(4):8-14.

[3]唐玉倩,彭金環(huán),于元杰.輪葉黨參不同外植體愈傷誘導(dǎo)比較[J].分子植物育種,2010,8(5):951-957.

[4]肖荷霞,王瑛,高峰.外植體及激素對SANDITI紫花苜愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,26(4):47-52.

[5]王艷,李波,徐長繪.苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)及再分化研究[J].現(xiàn)代化農(nóng)業(yè),2005,5(6):1-3.

[6]趙蓬暉,張江濤,馬紅.植物組織培養(yǎng)中的幾個(gè)常見問題與對策[J].河南林業(yè)科技,2002,21(2):27-28.