張凱淅， 韓 俊， 王 程， 郭 蓓， 謝 皓

（北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 北京102206）

北農(nóng)106、北農(nóng)107和北農(nóng)108是北京農(nóng)學(xué)院大豆研究室以大豆品種科豐14為輻照親本，利用60Co－γ射線輻照其干種子，從1株持綠型突變體中經(jīng)系譜法選育而成的姊妹系，均具有葉片、果莢失綠延遲，成熟后種子為綠種皮和綠子葉等特征［1］。其中，北農(nóng)106、北農(nóng)107和北農(nóng)108于2012年申報了品種權(quán)保護(hù)，北農(nóng)106于2014年通過北京市農(nóng)作物品種審定委員會審定。由于北農(nóng)106、北農(nóng)107和北農(nóng)108來自同一親本科豐14，農(nóng)藝性狀十分相似，因此，在品種的鑒別上有一定難度。

分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，為品種鑒定提供了新的途徑。SSR標(biāo)記是目前品種鑒定上常用的技術(shù)，已在很多農(nóng)作 物 上 應(yīng) 用，例 如，大 豆［2］、玉 米［3］、水 稻［4］、棉花［5］、小麥［6］、洋蔥［7］等。本試驗利用傳統(tǒng)的植物形態(tài)性狀鑒定方法與SSR標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，對科豐14及其突變系北農(nóng)106、北農(nóng)107和北農(nóng)108進(jìn)行鑒定，旨在為北農(nóng)106、北農(nóng)107和北農(nóng)108種子的鑒別與品種權(quán)保護(hù)供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

科豐14、北農(nóng)106、北農(nóng)107和北農(nóng)108的種子由北京農(nóng)學(xué)院大豆研究室提供。

8 30對大豆SSR引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司合成，試驗藥品購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態(tài)性狀鑒定

科豐14、北農(nóng)106、北農(nóng)107和北農(nóng)108的種子夏播，種植于北京農(nóng)學(xué)院試驗田。每品種1小區(qū)，每小區(qū)3行，行長5m，株距0.1m。生長期間記載生育期、花色、葉形、生長習(xí)性等性狀，成熟后每品種隨機(jī)收獲20株，調(diào)查植株和籽粒性狀。

1.2.2 SSR分子標(biāo)記鑒定

大豆幼苗期，每品種隨機(jī)取10株幼嫩葉片，分別提取基因組DNA，等量DNA混合為品種SSR標(biāo)記的DNA模版。DNA的提取采用CTAB法，PCR擴(kuò)增采用10μL反應(yīng)體系，8%聚丙烯酰胺非變性膠電泳，1%硝酸銀水溶液銀染，制干膠保存，根據(jù)標(biāo)記的多態(tài)性統(tǒng)計結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 科豐14及其突變系主要生物學(xué)性狀比較

北農(nóng)106、北農(nóng)107和北農(nóng)108為姊妹系，來自于同一個輻照親本科豐14，因此，大部分生物學(xué)性狀與科豐14相同，但是，也有部分性狀有別于科豐14（表1）。例如，科豐14成熟后葉片變黃，籽粒呈黃種皮、黃子葉特征，北農(nóng)106、北農(nóng)107和北農(nóng)108在成熟期具有持綠特點，種皮和子葉均為綠色。由于持綠，北農(nóng)106、北農(nóng)107和北農(nóng)108的生育期普遍延長，同樣的栽培條件下，植株的高度也有差異，百粒重也不盡相同。

在北農(nóng)106、北農(nóng)107和北農(nóng)108姊妹系之間，除生育期、百粒重有差異外，植株的花色和種臍顏色也有變化。北農(nóng)106和北農(nóng)107為紫花，而北農(nóng)108為白花與科豐14相同；北農(nóng)106為褐色種臍，而北農(nóng)107和北農(nóng)108為淺褐色種臍與科豐14相同。這些性狀的差別，為北農(nóng)106、北農(nóng)107和北農(nóng)108以及科豐14的鑒定與鑒別提供了依據(jù)。但是，在種子階段，北農(nóng)106、北農(nóng)107和北農(nóng)108之間因籽粒顏色、粒型相同，難以鑒別。此外，雖然科豐14為黃種皮、黃子葉，但在苗期階段與其突變系之間也存在差別不明顯、容易混淆的問題。因此，建立分子水平的鑒定方法十分必要。

表1 北農(nóng)106、北農(nóng)107、北農(nóng)108和科豐14主要生物學(xué)性狀的比較

2.2 科豐14及其突變系SSR標(biāo)記的多態(tài)性分析

為在分子水平鑒定科豐14及其突變系，采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行了多態(tài)性分析，試圖挖掘不同品種間特異的SSR標(biāo)記，作為鑒定依據(jù)。經(jīng)利用分布在大豆遺傳圖譜上的830對SSR引物，對科豐14和其突變系北農(nóng)106、北農(nóng)107、北農(nóng)108的基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)和產(chǎn)生的標(biāo)記位點分析。分別發(fā)現(xiàn)科豐14有7對SSR引物產(chǎn)生的標(biāo)記位點與北農(nóng)106、北農(nóng)107和北農(nóng)108表現(xiàn)多態(tài)性；北農(nóng)106有3對引物產(chǎn)生的標(biāo)記位點與北農(nóng)107、北農(nóng)108和科豐14表現(xiàn)多態(tài)性；北農(nóng)107有2對引物產(chǎn)生的標(biāo)記位點與北農(nóng)106、北農(nóng)108和科豐14表現(xiàn)多態(tài)性；北農(nóng)108有2對引物產(chǎn)生的標(biāo)記位點與北農(nóng)106、北農(nóng)107和科豐14表現(xiàn)多態(tài)性。

圖1 科豐14與北農(nóng)106、北農(nóng)107和北農(nóng)108DNA SSR擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性圖譜

2.2.1 科豐14與北農(nóng)106、北農(nóng)107和北農(nóng)108之間的多態(tài)性分析

對在科豐14與北農(nóng)106、北農(nóng)107和北農(nóng)108之間有多態(tài)性擴(kuò)增的7對SSR引物多次檢測，結(jié)果表明，Satt 228、Sat＿160、Sat＿227、Sat＿362、Satt 514、Sat＿381和Satt 213共7對引物對科豐14擴(kuò)增的產(chǎn)物分子量大小有別于對北農(nóng)106、北農(nóng)107和北農(nóng)108產(chǎn)生的分子量（圖1），其分別產(chǎn)生的特異帶型Satt228＿170bp、Sat＿160＿90bp、Sat＿227＿150bp、Sat＿362＿120bp、Satt514＿150bp、Sat＿381＿200bp和Satt213＿80bp能夠在分子水平上從科豐14、北農(nóng)106、北農(nóng)107和北農(nóng)108這4個品種中鑒別出科豐14。因此，上述7個引物所產(chǎn)生的帶型，可作為鑒定科豐14的分子標(biāo)記。

2.2.2 北農(nóng)106與北農(nóng)107、科豐14和北農(nóng)108之間的多態(tài)性分析

對在北農(nóng)106與北農(nóng)107、北農(nóng)108和科豐14之間有多態(tài)性擴(kuò)增的 Satt 204、Sat＿380和Satt 706共3對SSR引物多次檢測，結(jié)果表明，這3個引物能夠分別擴(kuò)增出不同于北農(nóng)107、北農(nóng)108和科豐14的特異帶型（圖2），其標(biāo)記Satt204＿105bp、Sat＿380＿150bp和 Satt706＿160bp，可以作為鑒定北農(nóng)106分子標(biāo)記。

2.2.3 北農(nóng)107與科豐14、北農(nóng)106和北農(nóng)108之間的多態(tài)性分析

利用BE 475343和Sat＿211引物對北農(nóng)107與北農(nóng)106、北農(nóng)108和科豐14的DNA多次擴(kuò)增，結(jié)果表明，分別產(chǎn)

生的分子標(biāo)記BE475343＿100bp和Sat＿211＿110bp具有北農(nóng)107的特異性（圖3），可分別作為北農(nóng)107的鑒定標(biāo)記。

2.2.4 北農(nóng)108與科豐14、北農(nóng)106和北農(nóng)107之間的多態(tài)性分析

同理，經(jīng)多次重復(fù)檢測，Satt 367和Satt 373引物在北農(nóng)108的DNA中產(chǎn)生的Satt367＿130bp和Satt373＿160bp標(biāo)記（圖4），為北農(nóng)108的特異標(biāo)記，可作為鑒別北農(nóng)108的SSR分子標(biāo)記。

2.3 SSR標(biāo)記在大豆連鎖群位點的分析

通過對830對SSR引物的篩選，發(fā)現(xiàn)14對引物能夠在科豐14、北農(nóng)106、北農(nóng)107和北農(nóng)108的DNA中擴(kuò)增出多態(tài)性。由于北農(nóng)106、北農(nóng)107和北農(nóng)108為突變姊妹系，衍生于輻照親本科豐14，因此，通過對連鎖圖譜上SSR位點的分析，能夠進(jìn)一步推斷親子間、姊妹間發(fā)生變異位點的多寡與染色體的位置。表2是利用 NCBI（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）檢索，獲得的上述14對引物在大豆連鎖群上的位置。從表2可以看出，在大豆20個連鎖群中，科豐14與突變系之間產(chǎn)生的7個位點的SSR標(biāo)記，涉及5個連鎖群，表明60Co－γ射線輻照科豐14后，至少在5條染色體的DNA序列發(fā)生了變異，導(dǎo)致北農(nóng)106等突變系的產(chǎn)生；突變系北農(nóng)106與北農(nóng)107、北農(nóng)108之間有3個位點特異標(biāo)記，涉及1個連鎖群，表明北農(nóng)106至少有1條染色體DNA序列與北農(nóng)107、北農(nóng)108的序列有差異；同理，北農(nóng)107與北農(nóng)106、北農(nóng)108之間至少有1條染色體DNA序列不同；北農(nóng)108與北農(nóng)106、北農(nóng)107之間至少有2條染色體DNA序列有別。

表2 SSR引物標(biāo)記位點在大豆連鎖群上的位置

圖2 北農(nóng)106與北農(nóng)107、北農(nóng)108和科豐14DNA SSR擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性圖譜

圖3 北農(nóng)107與、北農(nóng)106北農(nóng)108和科豐14DNA SSR擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性圖譜

注：A和B分別表示SSR引物Satt 367和Satt 373。

3 討 論

輻照誘變是創(chuàng)制大豆新種質(zhì)的重要手段之一，本試驗供試材料中的北農(nóng)106等突變系就是利用60Co－γ射線輻照誘變獲得，與其輻照親本科豐14相比，有部分生物學(xué)性狀發(fā)生了變化，例如，種皮顏色、子葉顏色、成熟期持綠型及全生育期天數(shù)等，這些性狀可以作為鑒別科豐14和北農(nóng)106等突變系的形態(tài)標(biāo)記。同時，由于科豐14輻照后變異幅度較大，導(dǎo)致形成北農(nóng)106等突變系之間的部分性狀也不相同，可以利用品系間的性狀差異加以鑒別，例如，北農(nóng)106生育期105d，株高60cm，紫花，種臍褐色；北農(nóng)107生育期120d，株高75cm，紫花，種臍淺褐色；北農(nóng)115生育期120d，株高80cm，白花，種臍褐色。

利用分子標(biāo)記對品種進(jìn)行真實性鑒定，具有較高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。因此，本試驗嘗試應(yīng)用大豆SSR標(biāo)記對科豐14及其突變系進(jìn)行鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，科豐14有7個SSR標(biāo)記可用來區(qū)別突變系的種子；北農(nóng)106有3個SSR標(biāo)記可與北農(nóng)107、北農(nóng)108鑒別；北農(nóng)107有2個SSR標(biāo)記可以與北農(nóng)106、北農(nóng)108鑒別；北農(nóng)108有2個SSR標(biāo)記可與北農(nóng)106、北農(nóng)107鑒別。上述SSR標(biāo)記能夠用來鑒定科豐14及其突變系等品種。

據(jù)陳靜等報道，60Co－γ射線輻照誘變可使得DNA分子多個區(qū)段內(nèi)發(fā)生重復(fù)或缺失等結(jié)構(gòu)性變異，呈現(xiàn)多個位點突變［8］。本試驗發(fā)現(xiàn)的科豐14和突變系間的多個SSR標(biāo)記位點，驗證了上述結(jié)論，例如，科豐14有4個特異標(biāo)記分別來自2條染色體，北農(nóng)106的3個標(biāo)記來自于1條染色體，北農(nóng)107的2個標(biāo)記也來自于1條染色體，特別是科豐14與其突變系特異的標(biāo)記中，有2個標(biāo)記來自同一染色體，但是位點相對距離較遠(yuǎn)（E－3.72，E－64.18），說明科豐14被輻射后，導(dǎo)致多條染色體DNA的多個區(qū)段發(fā)生了變異，進(jìn)而產(chǎn)生了新的突變體。

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