雷延成，吳世政，張淑坤，侯倩，才鼎，肖宗宇，陳曉娟

腦血管病發(fā)病率、致死率、致殘率和復發(fā)率均很高，在高海拔地區(qū)尤為明顯[1]，由于傳統(tǒng)的治療方法目前仍不能完成腦損傷后神經(jīng)細胞的再生和修復，近來年，具有自我復制和多向分化潛能的神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）的研究成為了中樞神經(jīng)損傷治療的研究焦點之一。近年來國內(nèi)外研究表明，骨髓間充質(zhì)細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）于體外通過誘導分化可獲得骨髓源性神經(jīng)干細胞（source neural stem cells of bone marrow，BMSCs-NSCs）[2-3]，而腦源性神經(jīng)生長因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）能夠促進神經(jīng)細胞的存活、影響神經(jīng)細胞的遷移，在體外還能促進NSCs的存活和分化[4-6]。有文獻報道BMSCs與BDNF聯(lián)合移植可顯著改善大鼠腦或脊髓損傷及大腦中動脈阻塞再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型大鼠的神經(jīng)功能，促進其恢復[7-10]。缺氧預處理腦保護機制是近年研究的熱點，有研究表明低氧可誘導大鼠大腦皮層細胞的BDNF分泌和BDNF信使核糖核酸表達增加[11]，起到腦組織的修復作用[12-13]，但目前國內(nèi)外尚無文獻報道缺氧預處理是否能促進外源NSCs的增殖和分化，從而起到腦組織的保護作用，同時經(jīng)過缺氧預處理后BMSCs-NSCs和BDNF聯(lián)合移植是否進一步促進BDNF的表達而引起神經(jīng)功能恢復的疊加效應。本研究對缺氧預處理后BMSCs-NSCs聯(lián)合BDNF立體定向移植治療大鼠腦缺血再灌注損傷的療效進行了初步探討，為高海拔缺氧地區(qū)腦梗死的細胞移植治療提供動物實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 72只健康成年SD大鼠，體重200～250 g；體重85 g幼鼠1只（取骨髓用），大鼠由蘭州大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（甘）2013-0002。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。將大鼠隨機分為缺氧預處理組和常氧組，每組各36只，缺氧預處理組造模前3 d先行缺氧預處理，處理方式為模擬海拔5000 m高度（氧分壓11.32 kPa）的低壓氧艙，每天3 h，連續(xù)3 d。本研究中常氧組在西寧地區(qū)（海拔2260 m）室內(nèi)自然狀態(tài)下進行飼養(yǎng)和實驗。

兩組大鼠均制作MCAO/R模型，然后每組分為3個亞組（BMSCs-NSCs+BDNF組、BMSCs-NSCs組和對照組，每組各12只），分別梗死灶同側(cè)尾狀核內(nèi)立體定向移植BMSCs-NSCs+BDNF、BMSCs-NSCs和DMEM/F12培養(yǎng)基各10 μl。

1.2 主要材料 BDNF、DMEM/F12培養(yǎng)基、南美胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、B27、堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、5-溴脫氧尿嘧啶（Bromouracil deoxyriboside，Brdu）、兔抗CD133抗體、小鼠抗Nestin抗體、兔抗微管蛋白（β-tubulin）Ⅲ抗體、微管相關蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP-2）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、半乳糖神經(jīng)酰胺（galactosylceramidase，Galc）、山羊血清、山羊抗小鼠IgG和羊抗兔IgG、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）封片劑購于美國HyClone公司。

1.3 主要儀器 低壓氧艙（中航工業(yè)貴州風雷航空軍械公司研制）、CO2恒溫培養(yǎng)箱（HF-100，上海力申科學儀器有限公司）、動物立體定位儀（成都泰盟軟件有限公司）。

1.4 骨髓源性神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)、誘導分化及鑒定 幼年SD大鼠在無菌條件下取雙側(cè)股骨、脛骨及雙側(cè)肱骨，以含10%FBS+1%青鏈雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基10 ml重懸后接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，24 h后更換全量培養(yǎng)基，去除未貼壁的細胞及雜細胞，以后每隔2～3 d換液一次，待原代細胞達80%～90%融合后，用0.25%胰酶消化后按1∶2進行首次傳代培養(yǎng)，傳代至第3～4代時進行誘導分化。

誘導分化采用無血清懸浮培養(yǎng)法，選擇3～4代在含血清培養(yǎng)基中呈對數(shù)生長期的貼壁BMSCs，用0.25%胰酶消化，經(jīng)吸管吹打制成單細胞懸液，加入含DMEM/F12培養(yǎng)基（5 ml）、bFGF 20 ng/ml（100 μl）、EGF 20 ng/ml（100 ng）、B27添加劑（100 μl）的神經(jīng)篩選培養(yǎng)液中進行誘導分化3～5 d，待骨髓源性神經(jīng)球直徑為100～200 μm時傳代，按1∶2瓶比例將細胞接種于25 cm培養(yǎng)瓶中，置37℃，5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換半液一次，待骨髓源性神經(jīng)球直徑為100～200 μm時傳代。

CD133和Nestin檢測檢測：①選取在無血清培養(yǎng)基中呈懸浮生長的狀態(tài)良好的細胞球，去除培養(yǎng)基，0.01 mol/L的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗3次，用4%多聚甲醛固定30 min，0.01 mol/L PBS沖洗3次；②0.3%Triton X-100破膜，室溫10 min，0.01 mol/L PBS沖洗3次；③10%正常山羊血清封閉60 min；④滴加一抗：兔抗CD133和小鼠抗Nestin置濕盒中4℃孵育過夜，去除一抗，0.01 mol/L PBS沖洗3次；⑤滴加二抗：羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h，去除二抗后，0.01 mol/L PBS沖洗3次；⑥用含DAPI的封片劑對細胞核進行復染，并封片，熒光顯微鏡下觀察；⑦設陰性對照試驗，以抗體稀釋液代替一抗，結(jié)果鏡下不顯色為陰性結(jié)果。

1.5 大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型的建立及立體定向移植 采用改良的線栓法[14]，制備右側(cè)MCAO/R模型，參照Longa[15]的5分法進行評分，1～4分為造模成功，造模失敗依次遞補直至成功。

選取生長良好的大鼠骨髓源性神經(jīng)球，加入3 ng/ml的Brdu，培養(yǎng)1 d后收集細胞，收集已行Brdu標記的大鼠骨髓源神經(jīng)球，經(jīng)胰酶消化制成單細胞懸液，0.01 mol/L PBS清洗2次，顯微鏡下計數(shù)，配置移植液。BMSCs-NSCs+BDNF組（BDNF 5 μl+DMEM/F12 5 μl培養(yǎng)基共10 μl，調(diào)整活細胞密度為5×105/10 μl）、BMSCs-NSCs組（DMEM/F12培養(yǎng)基10 μl，調(diào)整活細胞密度為5×105/10 μl）和對照組（僅移植DMEM/F12培養(yǎng)基10 μl）。3.6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，備皮沿矢狀縫切開皮膚，定位后牙鉆鑿孔開顱，使用立體定向儀行大鼠骨髓源性神經(jīng)球的顱內(nèi)移植，選取大鼠右側(cè)腦尾狀核區(qū)為接種靶點，其坐標為：前囟中點前1.0 mm，矢狀縫右旁開3.0 mm，硬膜下5.0 mm。將細胞懸液以1 μl/min的速度注射入靶區(qū)，除針前留針10 min，使細胞充分沉積，顱骨骨孔用消毒骨蠟密閉，縫合頭皮切口。移植細胞夜無外漏，定位坐標無偏差，大鼠3 d內(nèi)無死亡為移植成功。

1.6 觀察指標 分別于建立MCAO/R模型前及移植后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d對大鼠進行功能缺損評分（包括平衡木測試、行走測試、抓握測試）（表1）。上述時間段每組取2只大鼠，水合氯醛麻醉后以0.9%生理鹽水快速灌注，分離大腦組織，浸入4%多聚甲醛中進行外固定，30%蔗糖浸泡脫水至沉底，快速冷凍后，采用恒溫冷凍切片機進行切片，每種梗死區(qū)范圍切片30張，厚度為10 μm，－20℃保存。免疫組織化學染色觀察Brdu陽性細胞的遷移路徑，神經(jīng)元經(jīng)CD133、Nestin、MAP-2、β-tubullin、GFAP、Galc 6種抗原行免疫組織化學染色，每種5張切片，行總光密度值（integral optical density，IOD）檢測，了解骨髓源性神經(jīng)球分化情況，進行療效觀察。

1.7 統(tǒng)計學 使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，所用數(shù)據(jù)符合正態(tài)性和方差齊性檢驗，均采用表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨髓源性神經(jīng)球鑒定方法與分化 免疫熒光染色結(jié)果顯示，在無血清條件下培養(yǎng)的細胞球呈Nestin綠色、CD133呈紅色為陽性，細胞核DAPI復染呈藍色（圖1），證實培養(yǎng)細胞為BMSCs-NSCs。BMSCs-NSCs Nestin、MAP-2、GFAP、Galc抗原免疫熒光染色均呈陽性表達（圖2），表明SD大鼠BMSCs-NSCs能分化為表達神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞特異性標志物的細胞。

2.2 各組大鼠神經(jīng)功能評定 常氧BMSCs-NSCs+BDNF組在移植后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d和35 d 6個時間點的神經(jīng)功能學評分有整體差異，其中3 d時神經(jīng)功能顯著高于14 d（P＜0.001）、21 d（P＜0.001）、28 d（P＜0.001）和35 d（P＜0.001）。常氧BMSCs-NSCs組在各個時間點的神經(jīng)功能學評分也有整體差異，其中3 d時神經(jīng)功能得分顯著高于14 d（P=0.001）、21 d（P=0.001）、28 d（P=0.001）和35 d（P=0.001）。常氧對照組各時間點神經(jīng)功能評分沒有顯著差異。

缺氧預處理BMSCs-NSCs組在移植后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d和35 d 6個時間點的神經(jīng)功能學評分有整體差異，其中3 d時神經(jīng)功能顯著高于14 d（P＜0.001）、21 d（P＜0.001）、28 d（P＜0.001）和35 d（P＜0.001）。缺氧預處理BMSCs-NSCs組在各個時間點的神經(jīng)功能學評分也有整體差異，其中3 d時神經(jīng)功能得分顯著高于14 d（P=0.001）、21 d（P=0.001）、28 d（P=0.001）和35 d（P=0.001）。對照組各時間點神經(jīng)功能評分沒有顯著差異。

表1 大鼠模型大鼠神經(jīng)功能評分

圖1 大鼠骨髓源神經(jīng)干細胞免疫熒光染色

缺氧預處理BMSCs-NSCs+BDNF組的神經(jīng)功能學評分在7 d（P=0.031）顯著低于常氧BMSCs-NSCs+BDNF組，而3 d（P=0.069）、14 d（P=0.342）、21 d（P=0.345）、28 d（P=0.362）和35 d（P=0.371）5各個時間點與常組沒有顯著差異；缺氧預處理BMSCs-NSCs組的神經(jīng)功能學評分在3 d（P=0.143）、7 d（P=0.095）、14 d（P=0.051）、21 d（P=0.069）、28 d（P=0.067）和35 d（P=0.053）6各個時間點均與常氧BMSCs-NSCs組沒有顯著差異。缺氧預處理對照組的神經(jīng)功能學評分只在第3天（P=0.040）顯著低于常氧對照組，而7 d（P=0.102）、14 d（P=0.164）、21 d（P=0.185）、28 d（P=0.169）和35 d（P=0.171）5各個時間點與常組沒有顯著差異（表2）。

2.3 骨髓源性神經(jīng)干細胞移植效果 移植后常氧與缺氧預處理組均有Brdu陽性的BMSCs-NSCs移植入腦。缺氧BMSCs-NSCs+BDNF組免疫組化Brdu單染，3 d時移植組在針道區(qū)域集聚Brdu陽性細胞，呈圓球形，棕色，呈簇狀分布；7 d時Brdu標記的陽性細胞向周圍較短距離遷移；14 d時Brdu陽性細胞仍集聚在針道區(qū)域，梗死區(qū)域可見少量遷移的Brdu陽性細胞（圖3A）；21 d時梗死區(qū)遷移的Brdu陽性細胞相對最多，分布較均勻，但大多數(shù)細胞仍集中針道區(qū)域及梗死區(qū)與正常腦組織交界處（圖3B）；28 d梗死區(qū)遷移的Badu陽性細胞數(shù)目反而略減少（圖3C）。

2.4 移植后21 d骨髓源性神經(jīng)干細胞在梗死區(qū)的分化情況 對移植后21 d時CD133、Nestin、GFAP、Map2、β-tubulin、Galc的熒光免疫組織化學法染色結(jié)果進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示各個指標在常氧和缺氧預處理6組間均有整體差異（表3）。進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)：無論常氧組還是缺氧預處理組，BMSCs-NSCs+BDNF組CD133、Nestin、GFAP、Map2、β-tubulin、Galc的IOD值均顯著高于BMSCs-NSCs組（均P＜0.001），BMSCs-NSCs+BDNF組、BMSCs-NSCs組各檢測指標也均顯著高于對照組（均P＜0.001）。

圖2 骨髓源性神經(jīng)干細胞CD133、MAP-2、GFAP抗原免疫熒光染色情況（熒光顯微鏡，200×）

缺氧BMSCs-NSCs+BDNF組與常氧BMSCs-NSCs+BDNF組CD133、Nestin、GFAP、Map2、β-tubulin、Galc檢測指標IOD值無顯著性差異。缺氧BMSCs-NSCs組與常氧BMSCs-NSCs組各檢測指標IOD值無顯著性差異。缺氧對照組與常氧對照組各檢測指標IOD值亦無顯著性差異。

3 討論

NSCs移植中內(nèi)外源諸多因素共同參與，相互作用是其損傷修復的機制。有研究表明急性缺氧刺激能導致內(nèi)源性NSCs的增殖和分化，起到腦組織修復作用[16]，但缺氧預處理能否影響外源性NSCs的增殖目前尚不清楚。

本研究顯示移植BMSCs-NSCs的遷移與時間窗密切相關，移植后3 d遷移不明顯，7 d時移植針道附近遷移，早期遷移并不理想，在21 d左右Badu陽性細胞到達梗死區(qū)內(nèi)最多，但大多數(shù)仍集中于梗死區(qū)及腦梗死病灶與正常腦組織交界處，且以GFAP表達陽性的星形膠質(zhì)細胞為主，而28 d后梗塞區(qū)陽性表達細胞數(shù)目反而略有減少，可能部分移植細胞發(fā)生了凋亡。對21 d神經(jīng)細胞修復狀況進行統(tǒng)計分析顯示：BMSCs-NSCs+BDNF組與BMSCs-NSCs移植各組中均可見β-tubulin、Nestin、GFAP、CD133、Galc、MAP-2免疫組織化學染色陽性細胞表達，表明大鼠BMSCs-NSCs移植后具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)胞3種神經(jīng)譜系細胞的能力。缺氧BMSCs-NSCs+BDNF組與常氧BMSCs-NSCs+BDNF組相比較，CD133、Nestin、GFAP、Map2、β-tubulin、Galc檢測指標間無顯著性差異，由此可見缺氧預處理并不能促進外源性移植細胞分化。但無論缺氧處理組、還是常氧組在添加BDNF后均顯著促進了BMSCs-NSCs向這3者分化的比例，顯著提高分化為神經(jīng)元的比例，并能增加神經(jīng)元突觸數(shù)目與長度，促進突觸連接。其可能機制如下：①BDNF可以通過酪氨酸激B（tyrosine kinase B，TrKB）受體促進神經(jīng)干細胞增殖，并誘導神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞分化[17]，促進了神經(jīng)功能的恢復；②NSCs或已分化的星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元等分泌多種細胞因子，促進神經(jīng)的再生；③NSCs分化為少突膠質(zhì)細胞，參與了神經(jīng)細胞髓鞘的形成，促進了神經(jīng)纖維的生長，促進了神經(jīng)功能的恢復。

表2 各組大鼠不同時間點神經(jīng)功能評分結(jié)果

表3 細胞移植后21 d各移植組中CD133、Nestin、MAP2、β-tubulin、GFAP、Galc總光密度值

圖3 骨髓源性神經(jīng)干細胞移植效果

各移植組大鼠神經(jīng)功能評定表明，移植后無論缺氧預處理組、還是常氧組中的BMSCs-NSCs+BDNF組及BMSCs-NSCs組大鼠神經(jīng)功能均開始明顯改善。移植治療后只有缺氧預處理BMSCs-NSCs+BDNF組7 d和對照組3 d神經(jīng)功能恢復情況要好于常氧對應組，而行BMSCs-NSCs+BDNF聯(lián)合后7 d左右缺氧預處理對神經(jīng)功能恢復最顯著，考慮到本實驗樣本量較少，尚不能全面客觀反映缺氧預處理對神經(jīng)功能恢復的作用，這也是本實驗不足之處。

目前研究結(jié)果證實缺氧預處理耐低氧效應相對明確，但其神經(jīng)保護機制卻未明確，可能涉及缺氧預處理過程中動物行為與代謝、神經(jīng)形態(tài)學、動物離體腦功能活動，更可能涉及神經(jīng)化學成分、分子神經(jīng)生物學等諸方面的變化[18-19]。本實驗中缺氧預處理并不能促進外源性BMSCs-NSCs移植細胞分化比例，但卻能改善大鼠神經(jīng)功能。分析可能原因有：①有研究表明缺氧預處理可誘導大鼠大腦皮層細胞的BDNF分泌和BDNF信使核糖核酸表達增加[20]，國內(nèi)研究表明在體外表皮生長因子濃度為20 μg/L、血清濃度為10%時，50 ng/L BDNF是促進NSCs分化為神經(jīng)元的較佳濃度，超過該比例并不能增加外源性神經(jīng)細胞分化[21]。而本實驗缺氧BMSCs-NSCs+BDNF組中添加的BDNF含量為50 ng/L，缺氧預處理可致大腦皮層細胞分泌的BDNF，兩者遞加可能后已超過上限而并不能促進外源性移植細胞分化比例；②有研究表明低氧預適應后海馬區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)干細胞明顯增殖，可能參與低氧預適應腦保護機制[16]，可引起大鼠神經(jīng)功能改善。其他研究也顯示缺氧預處理能導致內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖和分化，起到腦組織的修復作用[19，22]。

本研究分組較多，但每組樣本量較少，每個時間點每組大鼠免疫組織化學染色測定的例數(shù)僅有2只，因此可能會對結(jié)果造成一定偏倚。另外，本研究中的常氧組并不是平原環(huán)境下的常氧，對缺氧預處理條件下BMSCs-NSCs聯(lián)合BDNF立體定向移植的機制也沒有進一步研究，這些在以后的后繼研究中會進一步改進。

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